Name: macrophage differentiation and polarization into an m2-like phenotype using a human monocyte-like thp-1 leukemia cell line
Uploaded: 2021-08-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Macrophage Differentiation and Polarization into an M2-Like Phenotype using a Human Monocyte-Like THP-1 Leukemia Cell Line at JoVE.com

Het Price Institute of Surgical Research, University of Louisville, wordt financieel ondersteund door de John W. Price en Barbara Thruston Atwood Price Trust. De financieringsbronnen speelden geen rol in de opzet en uitvoering van het onderzoek en in het verzamelen, beheren, analyseren en interpreteren van de gegevens.

OPMERKING: Een overzicht van de stappen die in dit protocol worden beschreven, wordt weergegeven in figuur 1. De menselijke monocyt-achtige leukemie cellijn THP-1 werd gekocht. Korte tandemherhalingsanalyse werd uitgevoerd om de THP-1-cellijn te verifiëren. Voer alle stappen uit onder steriele omstandigheden. De THP-1 monocytische cellijn groeit in suspensie en hecht zich niet aan celkweekoppervlakken. Hechting kan worden geïnduceerd door monocyten te differentiëren in macrofaagachtige ce...

<ol>
	<li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts+enhance+tumor-associated+macrophages+enrichment+and+suppress+NK+cells+function+in+colorectal+cancer.">Cancer-associated fibroblasts enhance tumor-associated macrophages enrichment and suppress NK cells function in colorectal cancer.</a> Cell Death and Disease. 10 (4), 273 (2019).</li><li>Wang, J., Li, D., Cang, H., Guo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+cancer+and+immune+cells:+Role+of+tumor-associated+macrophages+in+the+tumor+microenvironment.">Crosstalk between cancer and immune cells: Role of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment.</a> Cancer Medicine. 8 (10), 4709-4721 (2019).</li><li>Soncin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+creates+a+niche+for+the+self-renewal+of+tumor-promoting+macrophages+in+colon+adenoma.">The tumor microenvironment creates a niche for the self-renewal of tumor-promoting macrophages in colon adenoma.</a> Nature Communications. 9 (1), 582 (2018).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).</li><li>Mazzone, M., Menga, A., Castegna, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+TAM+functions-it+takes+two+to+tango.">Metabolism and TAM functions-it takes two to tango.</a> Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (4), 700-716 (2018).</li><li>Eum, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-promoting+macrophages+prevail+in+malignant+ascites+of+advanced+gastric+cancer.">Tumor-promoting macrophages prevail in malignant ascites of advanced gastric cancer.</a> Experimental and Molecular Medicine. 52 (12), 1976-1988 (2020).</li><li>Qian, B. Z., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+diversity+enhances+tumor+progression+and+metastasis.">Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis.</a> Cell. 141 (1), 39-51 (2010).</li><li>Scheurlen, K. M., Billeter, A. T., O'Brien, S. J., Galandiuk, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+dysfunction+and+early-onset+colorectal+cancer+-+how+macrophages+build+the+bridge.">Metabolic dysfunction and early-onset colorectal cancer - how macrophages build the bridge.</a> Cancer Medicine. 9 (18), 6679-6693 (2020).</li><li>Bosshart, H., Heinzelmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THP-1+cells+as+a+model+for+human+monocytes.">THP-1 cells as a model for human monocytes.</a> Annals of Translational Medicine. 4 (21), 438 (2016).</li><li>. The American Type Culture Collection (ATCC) Available from: <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx#generalinformation">https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx#generalinformation</a> (2021)</li><li>Baxter, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+protocols+for+differentiation+of+THP-1+cells+to+macrophages+with+distinct+M(IFNgamma+LPS),+M(IL-4),+and+M(IL-10)+phenotypes.">Standardized protocols for differentiation of THP-1 cells to macrophages with distinct M(IFNgamma+LPS), M(IL-4), and M(IL-10) phenotypes.</a> Journal of Immunological Methods. 478, 112721 (2020).</li><li>Genin, M., Clement, F., Fattaccioli, A., Raes, M., Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M1+and+M2+macrophages+derived+from+THP-1+cells+differentially+modulate+the+response+of+cancer+cells+to+etoposide.">M1 and M2 macrophages derived from THP-1 cells differentially modulate the response of cancer cells to etoposide.</a> BMC Cancer. 15, 577 (2015).</li><li>Starr, T., Bauler, T. J., Malik-Kale, P., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phorbol+12-myristate-13-acetate+differentiation+protocol+is+critical+to+the+interaction+of+THP-1+macrophages+with+Salmonella+Typhimurium.">The phorbol 12-myristate-13-acetate differentiation protocol is critical to the interaction of THP-1 macrophages with Salmonella Typhimurium.</a> PLoS One. 13 (3), 0193601 (2018).</li><li>Lund, M. E., To, J., O'Brien, B. A., Donnelly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choice+of+phorbol+12-myristate+13-acetate+differentiation+protocol+influences+the+response+of+THP-1+macrophages+to+a+pro-inflammatory+stimulus.">The choice of phorbol 12-myristate 13-acetate differentiation protocol influences the response of THP-1 macrophages to a pro-inflammatory stimulus.</a> Journal of Immunological Methods. 430, 64-70 (2016).</li><li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-6/STAT3+pathway+intermediates+M1/M2+macrophage+polarization+during+the+development+of+hepatocellular+carcinoma.">IL-6/STAT3 pathway intermediates M1/M2 macrophage polarization during the development of hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 119 (11), 9419-9432 (2018).</li><li>O'Neill, L. A. J., Artyomov, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Itaconate:+the+poster+child+of+metabolic+reprogramming+in+macrophage+function.">Itaconate: the poster child of metabolic reprogramming in macrophage function.</a> Nature Reviews Immunology. 19 (5), 273-281 (2019).</li><li>Luig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-induced+IL-6+functions+as+a+natural+brake+on+macrophages+and+limits+gn.">Inflammation-induced IL-6 functions as a natural brake on macrophages and limits gn.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1597-1607 (2015).</li><li>Maruyama, K., Nemoto, E., Yamada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+macrophage+function+-+cyclic+tensile+force+inhibits+NLRP3+inflammasome-dependent+IL-1beta+secretion+in+murine+macrophages.">Mechanical regulation of macrophage function - cyclic tensile force inhibits NLRP3 inflammasome-dependent IL-1beta secretion in murine macrophages.</a> Inflammation and Regeneration. 39, 3 (2019).</li><li>Gatto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PMA-Induced+THP-1+Macrophage+Differentiation+is+Not+Impaired+by+Citrate-Coated+Platinum+Nanoparticles.">PMA-Induced THP-1 Macrophage Differentiation is Not Impaired by Citrate-Coated Platinum Nanoparticles.</a> Nanomaterials (Basel). 7 (10), (2017).</li><li>Maess, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+PMA+enhances+the+responsiveness+of+transfected+THP-1+macrophages+to+polarizing+stimuli.">Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli.</a> Journal of Immunological Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).</li><li>Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+PMA-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages.">The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).</li><li>Raggi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+human+macrophage+M1-M2+polarization+balance+by+hypoxia+and+the+triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-1.">Regulation of human macrophage M1-M2 polarization balance by hypoxia and the triggering receptor expressed on myeloid cells-1.</a> Frontiers in Immunology. 8, 11097 (2017).</li><li>Neutelings, T., Lambert, C. A., Nusgens, B. V., Colige, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mild+cold+shock+(25+degrees+C)+followed+by+warming+up+at+37+degrees+C+on+the+cellular+stress+response.">Effects of mild cold shock (25 degrees C) followed by warming up at 37 degrees C on the cellular stress response.</a> PLoS One. 8 (7), 69687 (2013).</li><li>Kurashina, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-free+release+of+adhered+cells+from+standard+culture+dishes+using+intermittent+ultrasonic+traveling+waves.">Enzyme-free release of adhered cells from standard culture dishes using intermittent ultrasonic traveling waves.</a> Communications Biology. 2, 393 (2019).</li><li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function.">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).</li><li>Bailey, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+murine+bone+marrow-derived+macrophages+for+nitric+oxide+and+redox+biology.">Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology.</a> Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).</li></ol>

Dit protocol voor het differentiëren en polariseren van THP-1 monocytachtige cellen binnen 14 dagen biedt een methode om macrofagen te verkrijgen met een duidelijk M2-achtig fenotype als gevolg van lange behandeling incubatie van cellen met voldoende rustperioden tussen stappen.
Bepaalde stappen zijn van cruciaal belang voor dit protocol. De verdubbelingstijd van THP-1 monocyten is ongeveer 26 uur. Cellen kunnen worden gesplitst met een celdichtheid van 9 x 105/ ml en moeten worden...

Tumor-geassocieerde macrofagen (TAM) en hun rol bij chronische ontsteking, het begin van kanker en tumorontwikkeling zijn belangrijke doelen in recent onderzoek1,2. Perifere bloedmonocyten die worden gerekruteerd naar de weefselmicro-omgeving van de zich ontwikkelende tumor differentiëren in macrofagen en kunnen worden gepolariseerd in twee hoofdsubtypen van macrofagen3. De klassiek geactiveerde macrofaag vertegenwoordigt het voornamelijk pro-inflammatoire M1-achtige fenotype en het alternatief geactiveerde M2-achtige subtype vertoont overwegend ontstekingsremmende kenmerken4. Macrofagen kunnen dynamisch schakelen tussen deze twee belangrijkste fenotypen, afhankelijk van hun cellulaire metabolisme, waarbij intermediaire subtypen zowel inflammatoire als ontstekingsremmende eigenschappen hebben5. TAM vertegenwoordigt een heterogene populatie van beide fenotypen. Een tumorbevorderende functie en slechte prognose bij verschillende soorten kanker wordt echter vooral geassocieerd met M2-achtige macrofagen6,7,8.
De functionele profielen van macrofagen en hun interactie met andere cellen in de micro-omgeving van de tumor zijn complex en uitdagend om vast te leggen in een voortdurend veranderende omgeving tijdens de voortdurende tumorontwikkeling. Cellijnen kunnen een homogene celpopulatie bieden met een stabiele levensvatbaarheid in cultuur, wat het proces van het aantonen van gedefinieerde cellulaire en intercellulaire mechanismen kan vergemakkelijken. De monocyt-achtige THP-1 cellijn is een legitiem modelsysteem voor primaire menselijke monocyten9. Deze spontaan vereeuwigde cellijn is verkregen uit het perifere bloed van een eenjarig kind met acute monocytische leukemie9,10. De differentiatie en polarisatie van THP-1-cellen zijn gemeld door verschillende studies en zijn op meerdere verschillende manieren uitgevoerd11,12,13,14. Activering en daarom de polarisatie van macrofagen in een M1-achtig fenotype wordt gevolgd door een compenserend ontstekingsremmend reboundmechanisme, dat een M2-achtig fenotype bevordert via cytokines geproduceerd door inflammatoire macrofagen, zoals interleukine 6 (IL-6) of itaconate15,16. Dit kan dienen als een pauzemechanisme om een overschietende ontstekingsreactie na celactivering tedempen 17. Het proces van het differentiëren en polariseren van monocyten en THP-1 monocytachtige cellen tot een ontstekingsremmend M2-achtig fenotype gaat zelf ook gepaard met pro-inflammatoire stimuli die moeten worden overwonnen. Een inflammatoire cytokinerespons kan worden veroorzaakt door mechanische stress18, zoals het veranderen van media om de cellen te voeden, of het toevoegen van chemische verbindingen om THP-1-cellen te differentiëren, zoals phorbol 12-myristate 13-acetaat (PMA), en induceert de productie van tumornecrosefactor α (TNFα), interleukine 1β (IL-1β) of IL-619. Dit veranderde cytokine-expressieprofiel als reactie op PMA kan latere macrofaagpolarisatie beïnvloeden en voorkomen20. Adequate rustperioden, zoals gemeld vóór na PMA-behandeling, zorgen ervoor dat deze ontstekingsreacties verminderen en celpolarisatie vergemakkelijken tot een duidelijk M2-achtig fenotype21.
Dit protocol demonstreert een methode om THP-1 monocytachtige cellen binnen 14 dagen te differentiëren en te polariseren tot een M2-achtig fenotype van macrofagen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% trypan blue</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>152-5061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, USA</td>
			<td>1615-5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>&#160;89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L TipOne pipet tips</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, USA</td>
			<td>1111-2821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL&#160; Centrifuge tube</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>89039-664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L TipOne pipet tips</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, USA</td>
			<td>1120-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L TipOne pipet tips</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, USA</td>
			<td>1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipet</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>&#160;89130-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipet</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>&#160;89130-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tube</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>89039-662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase solution 500 mL</td>
			<td>Sigma, St. Louis, USA</td>
			<td>A6964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized</td>
			<td>Sigma, St. Louis, USA</td>
			<td>A5955-100 mL</td>
			<td>with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 &#956;g of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binder CO2 Incubator</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>C170-ULE3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoOne T-75cm flask with filter cap</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, USA</td>
			<td>CC7682-4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma, St. Louis, USA</td>
			<td>D8537-500 mL</td>
			<td>PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated)</td>
			<td>Eppendorf, Enfield, USA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol (70%)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCalibur flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences, San Diego, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 24-well plate</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ATCC, Manassas, USA</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse Anti-Human CD14</td>
			<td>BD Biosciences, San Diego, USA</td>
			<td>555397</td>
			<td>Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse Anti-Human CD80</td>
			<td>BD Pharmingen, San Diego, USA</td>
			<td>557226</td>
			<td>Flow cytometry, M1 marker (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1 &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Pharmingen, San Diego, USA</td>
			<td>555748</td>
			<td>Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG2a, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences, San Diego, USA</td>
			<td>553456</td>
			<td>Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BD Fc Block</td>
			<td>BD Biosciences, San Diego, USA</td>
			<td>564220</td>
			<td>Flow cytometry, Fc block (0.25 mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human interleukin 13 (IL-13)</td>
			<td>R&#38;D, Minneapolis, USA</td>
			<td>IL-771-10 &#956;g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human interleukin 4 (IL-4)</td>
			<td>R&#38;D, Minneapolis, USA</td>
			<td>SRP3093-20 &#956;g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213)</td>
			<td>Labconco, Kansas City, USA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine Solution, 200 mM</td>
			<td>ATCC, Manassas, USA</td>
			<td>30-2214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4</td>
			<td>Sigma, St. Louis, USA</td>
			<td>L2630-100 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Cell Scrapers</td>
			<td>Biotium, Fremont, USA</td>
			<td>22003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>02-671-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse inverted microscope TS100</td>
			<td>Nikon, Melville, USA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, USA</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Light Microscope RH-2</td>
			<td>Microscope Central, Feasterville, USA</td>
			<td>40888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 variable pipet- Gilson</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>76180-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 variable pipet-Gilson</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>76177-990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 variable pipet- Gilson</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>76177-988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD11b</td>
			<td>BD Biosciences, San Diego, USA</td>
			<td>555388</td>
			<td>Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences, San Diego, USA</td>
			<td>555749</td>
			<td>Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206</td>
			<td>BD Pharmingen, San Diego, USA</td>
			<td>551136</td>
			<td>Flow cytometry, M2 marker (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy 5 Mouse IgG1 &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Pharmingen, San Diego, USA</td>
			<td>555750</td>
			<td>Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma, St. Louis, USA</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerpette Plus pipettor</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>75856-448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Water bath (model 183)</td>
			<td>Precision Scientific, Chicago, USA</td>
			<td>66551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>ATCC, Manassas, USA</td>
			<td>30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>ATCC, Manassas, USA</td>
			<td>TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

macrophage differentiation and polarization into an m2-like phenotype using a human monocyte-like thp-1 leukemia cell line

Tumor-geassocieerde macrofagen (TAM) kunnen hun expressie en cytokineprofiel veranderen op basis van externe stimuli. Deze opmerkelijke plasticiteit stelt TAM in staat zich aan te passen aan voortdurende veranderingen in de micro-omgeving van de tumor. Macrofagen kunnen voornamelijk pro-inflammatoire (M1-achtige) of ontstekingsremmende (M2-achtige) eigenschappen hebben en kunnen voortdurend schakelen tussen deze twee hoofdtoestanden. M2-achtige macrofagen in de tumoromgeving worden geassocieerd met kankerprogressie en slechte prognose bij verschillende soorten kanker. Veel verschillende methoden voor het induceren van differentiatie en polarisatie van THP-1-cellen worden gebruikt om cellulaire en intercellulaire mechanismen en de effecten van TAM in de micro-omgeving van tumoren te onderzoeken. Momenteel is er geen vastgesteld model voor M2-achtige macrofaagpolarisatie met behulp van de THP-1-cellijn en de resultaten van expressie- en cytokineprofielen van macrofagen als gevolg van bepaalde in vitro stimuli variëren tussen studies. Dit protocol dient als gedetailleerde leidraad om THP-1 monocytachtige cellen te differentiëren in M0-macrofagen en om cellen binnen 14 dagen verder te polariseren tot een M2-achtig fenotype. We demonstreren de morfologische veranderingen van THP-1 monocytachtige cellen, gedifferentieerde macrofagen en gepolariseerde M2-achtige macrofagen met behulp van lichtmicroscopie. Dit model is de basis voor cellijnmodellen die de ontstekingsremmende effecten van TAM en hun interacties met andere celpopulaties van de tumormicro-omgeving onderzoeken.

M2-achtige macrofagen werden gekarakteriseerd en M2-polarisatie werd gevalideerd met behulp van flowcytometrie voor Cluster of Differentiation markers (CD) CD14, CD11b, CD80 (M1-achtige marker) en CD206 (M2-achtige marker). Flowcytometriekleuring werd uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. Macrofagen werden gewassen met PBS/5% FBS en geïncubeerd met Fcγ-receptorblok om niet-specifieke binding te voorkomen. Cellen werden vervolgens gekleurd met FITC-geconjugeerde muis anti-humane CD14- en CD80-antilichamen,...

Watch this Scientific Journal Video about Macrophage Differentiation and Polarization into an M2-Like Phenotype using a Human Monocyte-Like THP-1 Leukemia Cell Line at JoVE.com

Macrophage Differentiation and Polarization into an M2-Like Phenotype using a Human Monocyte-Like THP-1 Leukemia Cell Line

M2-achtige tumor-geassocieerde macrofagen (TAM) zijn geassocieerd met tumorprogressie en slechte prognose bij kanker. Dit protocol dient als een gedetailleerde gids om THP-1 monocytachtige cellen binnen 14 dagen reproduceerbaar te differentiëren en te polariseren in M2-achtige macrofagen. Dit model is de basis om de ontstekingsremmende effecten van TAM in de tumormicro-omgeving te onderzoeken.

Macrofaagdifferentiatie en polarisatie in een M2-achtig fenotype met behulp van een menselijke monocytachtige THP-1 leukemie cellijn

Tumor-associated macrophages (TAM) can switch their expression and cytokine profile according to external stimuli. This remarkable plasticity enables TAM ...

Ontstekingsremmende tumor geassocieerde macrofagen zijn gekoppeld aan progressie en slechte prognose bij kanker. Dit protocol is een gids om THP-1 monocytachtige cellen binnen 14 dagen te differentiëren en te polariseren in M2-achtige macrofagen. Momenteel is er geen gevestigd model voor ontstekingsremmende THP-1 polarisatie.Dit protocol maakt gebruik van adequate rustperioden en een langdurig polarisatieproces om een duidelijk M2-achtig macrofaagsubtype te creëren. Tumorontwikkeling, bijvoorbeeld bij darmkanker en weefselremodellering, worden gecontroleerd door ontstekingsremmende macrofagen. Onder studies die hun functie onderzoeken, zorgt gestandaardiseerde creatie van een duidelijk M2-achtig subtype voor reproduceerbare bevindingen.Begin met het instellen van een timer voor 150 seconden. Verwijder de bevroren injectieflacon met de THP-1-cellijn uit de vloeibare stikstof en ontdooi de injectieflacon onmiddellijk bij 37 graden Celsius in een schoonwaterbad, start de timer zodra de injectieflacon in het waterbad wordt geplaatst. Maak de dop los om de druk los te laten die is opgebouwd als gevolg van het ontdooiproces, zodat de buisopening niet in contact komt met het water om verontreiniging te voorkomen.Ontdooi de celsuspensie totdat een ijschip van ongeveer vier millimeter groot in de injectieflacon achterblijft en ga onmiddellijk verder met de volgende stap. Breng de vloeibare fase van de celsuspensie over in een buis van 15 milliliter met negen milliliter warme groeimedia. Breng vervolgens een milliliter van deze warme mediumcelsuspensie over in de THP-1-injectieflacon en terug naar de buis van 15 milliliter om de resterende ijschip te smelten en spoel de injectieflacon door om ervoor te zorgen dat er geen cellen achterblijven.Meng de suspensie voorzichtig door deze op en neer te pipetten met een pipet van één milliliter. Verwijder ongeveer 10 microliter van het monster om de cellen te tellen op levensvatbaarheid met trypan blue. De cellen met helder cytoplasma zijn levensvatbaar, een blauw cytoplasma duidt op celdood.Draai tijdens het tellen de warme celsuspensie gedurende zeven minuten bij 37 graden Celsius op 200 keer G. Verwijder het supernatant volledig en resuspend de cellen in groeimedium om een celdichtheid van 500.000 cellen per milliliter te bereiken. Meng de suspensie voorzichtig en breng elk 22 milliliter over in T75-celkweekkolven.Bewaar de kolven rechtop in een incubator bij 37 graden Celsius met een kooldioxideconcentratie van 5% en wissel de groeimedia om de drie tot vier dagen uit. Bereid de celsuspensie voor om de cellen met een dichtheid van 300.000 per milliliter per put in 24-well celkweekplaten te zaaien. Meng het medium voorzichtig en bereid aliquots van 26 milliliter in 50 milliliter buizen.Breng één milliliter van het celbevattende medium over in elke put van een plaat met 24 putten. Meng de media voorzichtig door het op en neer te pipetteren tussen de overdrachten door. Bewaar de vers bereide werkoplossing van PMA op ijs en voeg 100 nanogram PMA per put toe.Incubeer de platen in de couveuse zonder verdere behandeling gedurende 72 uur. Verwijder na 72 uur het groeimedium en vervang het door één milliliter vers groeimedium, zodat u de bodem van de putten niet raakt met pipetpunten. Laat de cellen nog 96 uur rusten in de couveuse.Verwijder het groeimedium en vervang het door één milliliter vers groeimedium. Voeg 20 nanogram interleukine 4 en 20 nanogram interleukine 13 per put toe. Laat de cellen vervolgens 48 uur rusten in de couveuse.Herhaal het hele proces na 48 uur en laat de cellen nog 48 uur rusten in de couveuse. Verwijder het groeimedium en vervang het door één milliliter vers groeimedium. Laat de cellen vervolgens 48 uur rusten in de couveuse.Verwijder het warme celmedium uit elke put en vervang het door een mengsel van één milliliter ijskoude PBS zonder calcium en magnesium en 5% FBS. Plaats de celplaat dan onmiddellijk gedurende 45 minuten op ijs. Na 45 minuten op ijs schraap je de cellen af met behulp van mini-celschrapers.Breng de losgemaakte macrofagen voorzichtig over naar koude PBS en 5% FBS in een buis van 15 milliliter die op ijs wordt gehouden. De macrofagen afgeleid van de polarisatiemethode tonen de expressie van CD14, evenals CD11b-markers. De monocyten- en macrofaagmarkers CD14 en CD11b werden uitgedrukt in respectievelijk 70,9% en 74,7% van de cellen.Cellen vertoonden lage oppervlakteniveaus van de M1-achtige marker CD80 in 0,2% van de cellen en hoge oppervlakteniveaus van de M2-achtige marker CD206 in 62,6% van de cellen. Omdat THP-1-cellen in medium de neiging hebben om naar de bodem van een injectieflacon te zinken en gemakkelijk te activeren zijn door mechanische stress, is het voorzichtig mengen en hanteren van de cellen belangrijk. M2-achtige macrofagen worden reproduceerbaar gemaakt en zijn gekarakteriseerd met behulp van QR-TPCR, ELISA en flowcytometrie.Dit is de basis voor het onderzoeken van ontstekingsremmende mechanismen bij de ontwikkeling van kanker of weefselremodellering.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Een Parasiet Rescue and Transformation Assay voor antileishmania Screening tegen intracellulaire<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigoten in THP1 Human acute monocytische leukemiecellijn

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

Onderzoek van Macrophage Polarisatie behulp beenmerg afgeleide Macrofagen

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Een<em&gt; In vitro</em&gt; Model te Heterogeniteit van Human Macrophage Differentiatie en Polarisatie Studie

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Oprichting van een<em&gt; In vitro</em&gt; Systeem om Intracellular Gedrag van Studie<em&gt; Candida glabrata</em&gt; In Human THP-1 macrofagen

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Het beoordelen van de Aangeboren Sensing van HIV-1 geïnfecteerde CD4<sup&gt; +</sup&gt; T cellen door plasmacytoïde dendritische cellen gebruiken een<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultuur systeem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Zeer efficiënte transfectie van Human THP-1 macrofagen door Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Muis Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolatie en<em&gt; In vitro</em&gt; Differentiatie in T cel subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualiseren van extracellulaire Traps Macrophage met behulp van de Confocal Microscopie

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Een zuig Blister-Protocol om menselijke T-cel Recall reacties In Vivo te studeren

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis

Een studie van de Immunohistopathologic profileert de folaat Receptor Beta Macrophage en vasculaire immuun communicatie in gigantische cel Arteritis

Giant cell arteritis (GCA) is a chronic immune-mediated disease of medium-to-large sized arteries that affects older adults. GCA manifests with arthritis ...