Name: macrophage differentiation and polarization into an m2-like phenotype using a human monocyte-like thp-1 leukemia cell line
Uploaded: 2021-08-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Macrophage Differentiation and Polarization into an M2-Like Phenotype using a Human Monocyte-Like THP-1 Leukemia Cell Line at JoVE.com

Le Price Institute of Surgical Research de l’Université de Louisville est soutenu financièrement par le John W. Price and Barbara Thruston Atwood Price Trust. Les sources de financement n’ont joué aucun rôle dans la conception et la réalisation de l’étude ainsi que dans la collecte, la gestion, l’analyse et l’interprétation des données.

Remarque : Une vue d’ensemble des étapes décrites dans ce protocole est illustrée à la figure 1. La lignée cellulaire de leucémie monocytaire humaine THP-1 a été achetée. Une courte analyse de répétition en tandem a été effectuée pour authentifier la lignée cellulaire THP-1. Effectuez toutes les étapes dans des conditions stériles. La lignée cellulaire monocytaire THP-1 se développe en suspension et ne se fixe pas aux surfaces de culture cellulaire. L’adhérence peut ?...

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	<li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts+enhance+tumor-associated+macrophages+enrichment+and+suppress+NK+cells+function+in+colorectal+cancer.">Cancer-associated fibroblasts enhance tumor-associated macrophages enrichment and suppress NK cells function in colorectal cancer.</a> Cell Death and Disease. 10 (4), 273 (2019).</li><li>Wang, J., Li, D., Cang, H., Guo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+cancer+and+immune+cells:+Role+of+tumor-associated+macrophages+in+the+tumor+microenvironment.">Crosstalk between cancer and immune cells: Role of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment.</a> Cancer Medicine. 8 (10), 4709-4721 (2019).</li><li>Soncin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+creates+a+niche+for+the+self-renewal+of+tumor-promoting+macrophages+in+colon+adenoma.">The tumor microenvironment creates a niche for the self-renewal of tumor-promoting macrophages in colon adenoma.</a> Nature Communications. 9 (1), 582 (2018).</li><li>Mosser, D. 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J., Malik-Kale, P., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phorbol+12-myristate-13-acetate+differentiation+protocol+is+critical+to+the+interaction+of+THP-1+macrophages+with+Salmonella+Typhimurium.">The phorbol 12-myristate-13-acetate differentiation protocol is critical to the interaction of THP-1 macrophages with Salmonella Typhimurium.</a> PLoS One. 13 (3), 0193601 (2018).</li><li>Lund, M. E., To, J., O'Brien, B. A., Donnelly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choice+of+phorbol+12-myristate+13-acetate+differentiation+protocol+influences+the+response+of+THP-1+macrophages+to+a+pro-inflammatory+stimulus.">The choice of phorbol 12-myristate 13-acetate differentiation protocol influences the response of THP-1 macrophages to a pro-inflammatory stimulus.</a> Journal of Immunological Methods. 430, 64-70 (2016).</li><li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-6/STAT3+pathway+intermediates+M1/M2+macrophage+polarization+during+the+development+of+hepatocellular+carcinoma.">IL-6/STAT3 pathway intermediates M1/M2 macrophage polarization during the development of hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 119 (11), 9419-9432 (2018).</li><li>O'Neill, L. A. J., Artyomov, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Itaconate:+the+poster+child+of+metabolic+reprogramming+in+macrophage+function.">Itaconate: the poster child of metabolic reprogramming in macrophage function.</a> Nature Reviews Immunology. 19 (5), 273-281 (2019).</li><li>Luig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-induced+IL-6+functions+as+a+natural+brake+on+macrophages+and+limits+gn.">Inflammation-induced IL-6 functions as a natural brake on macrophages and limits gn.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1597-1607 (2015).</li><li>Maruyama, K., Nemoto, E., Yamada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+macrophage+function+-+cyclic+tensile+force+inhibits+NLRP3+inflammasome-dependent+IL-1beta+secretion+in+murine+macrophages.">Mechanical regulation of macrophage function - cyclic tensile force inhibits NLRP3 inflammasome-dependent IL-1beta secretion in murine macrophages.</a> Inflammation and Regeneration. 39, 3 (2019).</li><li>Gatto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PMA-Induced+THP-1+Macrophage+Differentiation+is+Not+Impaired+by+Citrate-Coated+Platinum+Nanoparticles.">PMA-Induced THP-1 Macrophage Differentiation is Not Impaired by Citrate-Coated Platinum Nanoparticles.</a> Nanomaterials (Basel). 7 (10), (2017).</li><li>Maess, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+PMA+enhances+the+responsiveness+of+transfected+THP-1+macrophages+to+polarizing+stimuli.">Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli.</a> Journal of Immunological Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).</li><li>Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+PMA-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages.">The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).</li><li>Raggi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+human+macrophage+M1-M2+polarization+balance+by+hypoxia+and+the+triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-1.">Regulation of human macrophage M1-M2 polarization balance by hypoxia and the triggering receptor expressed on myeloid cells-1.</a> Frontiers in Immunology. 8, 11097 (2017).</li><li>Neutelings, T., Lambert, C. A., Nusgens, B. V., Colige, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mild+cold+shock+(25+degrees+C)+followed+by+warming+up+at+37+degrees+C+on+the+cellular+stress+response.">Effects of mild cold shock (25 degrees C) followed by warming up at 37 degrees C on the cellular stress response.</a> PLoS One. 8 (7), 69687 (2013).</li><li>Kurashina, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-free+release+of+adhered+cells+from+standard+culture+dishes+using+intermittent+ultrasonic+traveling+waves.">Enzyme-free release of adhered cells from standard culture dishes using intermittent ultrasonic traveling waves.</a> Communications Biology. 2, 393 (2019).</li><li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function.">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).</li><li>Bailey, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+murine+bone+marrow-derived+macrophages+for+nitric+oxide+and+redox+biology.">Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology.</a> Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).</li></ol>

Ce protocole sur la différenciation et la polarisation des cellules monocytaires THP-1 dans les 14 jours fournit une méthode pour obtenir des macrophages avec un phénotype distinct de type M2 en raison d’une longue incubation de cellules avec des périodes de repos adéquates entre les étapes.
Certaines étapes sont essentielles à ce protocole. Le temps de doublement des monocytes THP-1 est d’environ 26 h. Les cellules peuvent être divisées à une densité cellulaire de 9 x 105...

Les macrophages associés aux tumeurs (TAM) et leur rôle dans l’inflammation chronique, l’apparition du cancer et le développement de tumeurs sont des cibles importantes dans les recherches récentes1,2. Les monocytes du sang périphérique qui sont recrutés dans le microenvironnement tissulaire de la tumeur en développement se différencient en macrophages et peuvent être polarisés en deux sous-types principaux de macrophages3. Le macrophage activé classiquement représente le phénotype de type M1 principalement pro-inflammatoire et le sous-type de type M2 activé alternativement présente principalement des caractéristiques anti-inflammatoires4. Les macrophages peuvent basculer dynamiquement entre ces deux phénotypes principaux en fonction de leur métabolisme cellulaire, les sous-types intermédiaires ayant à la fois des attributs inflammatoires et anti-inflammatoires5. TAM représente une population hétérogène des deux phénotypes. Une fonction favorisant la tumeur et un mauvais pronostic dans différents types de cancers sont cependant particulièrement associés aux macrophages de type M26,7,8.
Les profils fonctionnels des macrophages et leur interaction avec d’autres cellules dans le microenvironnement tumoral sont complexes et difficiles à capturer dans un environnement en constante évolution pendant le développement continu de la tumeur. Les lignées cellulaires peuvent fournir une population cellulaire homogène avec une viabilité stable en culture, ce qui peut faciliter le processus de démonstration de mécanismes cellulaires et intercellulaires définis. La lignée cellulaire THP-1 de type monocyte est un système modèle légitime pour les monocytes humains primaires9. Cette lignée cellulaire spontanément immortalisée a été obtenue à partir du sang périphérique d’un nourrisson d’un an atteint de leucémie monocytaire aiguë9,10. La différenciation et la polarisation des cellules THP-1 ont été rapportées par plusieurs études et ont été réalisées de multiples manières différentes11,12,13,14. L’activation et, par conséquent, la polarisation des macrophages en un phénotype de type M1 est suivie d’un mécanisme de rebond anti-inflammatoire compensatoire, favorisant un phénotype de type M2 à travers des cytokines produites par des macrophages inflammatoires, tels que l’interleukine 6 (IL-6) ou l’itaconate15,16. Cela pourrait servir de mécanisme de rupture pour atténuer une réponse inflammatoire de dépassement après l’activation cellulaire17. Le processus de différenciation et de polarisation des monocytes et des cellules de type monocyte THP-1 en un phénotype anti-inflammatoire de type M2 s’accompagne lui-même de stimuli pro-inflammatoires qui doivent être surmontés. Une réponse inflammatoire aux cytokines peut être causée par un stress mécanique18, tel que le changement de milieu pour réalimenter les cellules, ou l’ajout de composés chimiques pour différencier les cellules THP-1, tels que le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA), et induire la production de facteur de nécrose tumorale α (TNFα), interleukine 1β (IL-1β) ou IL-619. Cette altération du profil d’expression des cytokines en réponse à la PMA peut affecter et prévenir la polarisation ultérieure des macrophages20. Des périodes de repos adéquates, comme indiqué précédemment après le traitement par PMA, permettent à ces réponses inflammatoires de diminuer et facilitent la polarisation cellulaire en un phénotype 21 distinct de typeM2.
Ce protocole démontre une méthode pour différencier et polariser les cellules de type monocytaire THP-1 en un phénotype de macrophages de type M2 dans les 14 jours.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% trypan blue</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>152-5061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, USA</td>
			<td>1615-5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>&#160;89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L TipOne pipet tips</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, USA</td>
			<td>1111-2821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL&#160; Centrifuge tube</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>89039-664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L TipOne pipet tips</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, USA</td>
			<td>1120-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L TipOne pipet tips</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, USA</td>
			<td>1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipet</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>&#160;89130-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipet</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>&#160;89130-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tube</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>89039-662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase solution 500 mL</td>
			<td>Sigma, St. Louis, USA</td>
			<td>A6964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized</td>
			<td>Sigma, St. Louis, USA</td>
			<td>A5955-100 mL</td>
			<td>with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 &#956;g of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binder CO2 Incubator</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>C170-ULE3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoOne T-75cm flask with filter cap</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, USA</td>
			<td>CC7682-4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma, St. Louis, USA</td>
			<td>D8537-500 mL</td>
			<td>PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated)</td>
			<td>Eppendorf, Enfield, USA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol (70%)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCalibur flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences, San Diego, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 24-well plate</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ATCC, Manassas, USA</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse Anti-Human CD14</td>
			<td>BD Biosciences, San Diego, USA</td>
			<td>555397</td>
			<td>Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse Anti-Human CD80</td>
			<td>BD Pharmingen, San Diego, USA</td>
			<td>557226</td>
			<td>Flow cytometry, M1 marker (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1 &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Pharmingen, San Diego, USA</td>
			<td>555748</td>
			<td>Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG2a, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences, San Diego, USA</td>
			<td>553456</td>
			<td>Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BD Fc Block</td>
			<td>BD Biosciences, San Diego, USA</td>
			<td>564220</td>
			<td>Flow cytometry, Fc block (0.25 mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human interleukin 13 (IL-13)</td>
			<td>R&#38;D, Minneapolis, USA</td>
			<td>IL-771-10 &#956;g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human interleukin 4 (IL-4)</td>
			<td>R&#38;D, Minneapolis, USA</td>
			<td>SRP3093-20 &#956;g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213)</td>
			<td>Labconco, Kansas City, USA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine Solution, 200 mM</td>
			<td>ATCC, Manassas, USA</td>
			<td>30-2214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4</td>
			<td>Sigma, St. Louis, USA</td>
			<td>L2630-100 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Cell Scrapers</td>
			<td>Biotium, Fremont, USA</td>
			<td>22003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>02-671-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse inverted microscope TS100</td>
			<td>Nikon, Melville, USA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, USA</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Light Microscope RH-2</td>
			<td>Microscope Central, Feasterville, USA</td>
			<td>40888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 variable pipet- Gilson</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>76180-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 variable pipet-Gilson</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>76177-990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 variable pipet- Gilson</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>76177-988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD11b</td>
			<td>BD Biosciences, San Diego, USA</td>
			<td>555388</td>
			<td>Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences, San Diego, USA</td>
			<td>555749</td>
			<td>Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206</td>
			<td>BD Pharmingen, San Diego, USA</td>
			<td>551136</td>
			<td>Flow cytometry, M2 marker (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy 5 Mouse IgG1 &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Pharmingen, San Diego, USA</td>
			<td>555750</td>
			<td>Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma, St. Louis, USA</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerpette Plus pipettor</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>75856-448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Water bath (model 183)</td>
			<td>Precision Scientific, Chicago, USA</td>
			<td>66551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>ATCC, Manassas, USA</td>
			<td>30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>ATCC, Manassas, USA</td>
			<td>TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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macrophage differentiation and polarization into an m2-like phenotype using a human monocyte-like thp-1 leukemia cell line

Les macrophages associés aux tumeurs (TAM) peuvent changer leur expression et leur profil de cytokines en fonction de stimuli externes. Cette plasticité remarquable permet à TAM de s’adapter aux changements en cours dans le microenvironnement tumoral. Les macrophages peuvent avoir des attributs principalement pro-inflammatoires (de type M1) ou anti-inflammatoires (de type M2) et peuvent basculer continuellement entre ces deux états principaux. Les macrophages de type M2 dans l’environnement tumoral sont associés à la progression du cancer et à un mauvais pronostic dans plusieurs types de cancer. De nombreuses méthodes différentes pour induire la différenciation et la polarisation des cellules THP-1 sont utilisées pour étudier les mécanismes cellulaires et intercellulaires et les effets du TAM dans le microenvironnement des tumeurs. À l’heure actuelle, il n’existe aucun modèle établi pour la polarisation des macrophages de type M2 utilisant la lignée cellulaire THP-1, et les résultats de l’expression et des profils de cytokines des macrophages dus à certains stimuli in vitro varient d’une étude à l’autre. Ce protocole sert de guide détaillé pour différencier les cellules de type monocyte THP-1 en macrophages M0 et pour polariser davantage les cellules en un phénotype de type M2 dans les 14 jours. Nous démontrons les changements morphologiques des cellules de type monocytaire THP-1, des macrophages différenciés et des macrophages polarisés de type M2 à l’aide de la microscopie optique. Ce modèle est à la base de modèles de lignées cellulaires étudiant les effets anti-inflammatoires du TAM et leurs interactions avec d’autres populations cellulaires du microenvironnement tumoral.

Des macrophages de type M2 ont été caractérisés et la polarisation M2 a été validée à l’aide de la cytométrie en flux pour les marqueurs de type Cluster of Differentiation (CD) CD14, CD11b, CD80 (marqueur de type M1) et CD206 (marqueur de type M2). La coloration par cytométrie en flux a été effectuée conformément aux instructions du fabricant. Les macrophages ont été lavés avec du PBS/FBS à 5 % et incubés avec le bloc récepteur Fcγ pour éviter toute liaison non spécifique. Les cellules ont ensuit...

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Macrophage Differentiation and Polarization into an M2-Like Phenotype using a Human Monocyte-Like THP-1 Leukemia Cell Line

Les macrophages associés aux tumeurs de type M2 (TAM) sont associés à la progression tumorale et à un mauvais pronostic dans le cancer. Ce protocole sert de guide détaillé pour différencier et polariser de manière reproductible les cellules monocytaires THP-1 en macrophages de type M2 dans les 14 jours. Ce modèle est la base pour étudier les effets anti-inflammatoires du TAM dans le microenvironnement tumoral.

Différenciation et polarisation des macrophages en un phénotype de type M2 à l’aide d’une lignée cellulaire de leucémie THP-1 semblable à un monocyte humain

Tumor-associated macrophages (TAM) can switch their expression and cytokine profile according to external stimuli. This remarkable plasticity enables TAM ...

Les macrophages associés aux tumeurs anti-inflammatoires sont liés à la progression et au mauvais pronostic du cancer. Ce protocole est un guide pour différencier et polariser les cellules de type monocyte THP-1 en macrophages de type M2 dans les 14 jours. Actuellement, il n’existe pas de modèle établi pour la polarisation anti-inflammatoire du THP-1.Ce protocole utilise des périodes de repos adéquates et un processus de polarisation prolongé pour créer un sous-type de macrophage distinct de type M2. Le développement tumoral, par exemple, dans le cancer du côlon et le remodelage des tissus, sont contrôlés par des macrophages anti-inflammatoires. Parmi les études portant sur leur fonction, la création standardisée d’un sous-type distinct de type M2 garantit des résultats reproductibles.Commencez par régler une minuterie pendant 150 secondes. Retirez le flacon congelé contenant la lignée cellulaire THP-1 de l’azote liquide et décongelez le flacon immédiatement à 37 degrés Celsius dans un bain-marie propre, en démarrant la minuterie dès que le flacon est mis dans le bain-marie. Desserrer le bouchon pour libérer la pression accumulée en raison du processus de décongélation, en veillant à ce que l’ouverture du tube n’entre pas en contact avec l’eau pour éviter toute contamination.Décongelez la suspension de la cellule jusqu’à ce qu’une puce de glace d’environ quatre millimètres soit laissée dans le flacon et passez immédiatement à l’étape suivante. Transférer la phase liquide de la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres contenant neuf millilitres de milieux de croissance chauds. Ensuite, transférez un millilitre de cette suspension de cellules moyennes chaudes dans le flacon THP-1 et retournez dans le tube de 15 millilitres pour faire fondre la puce de glace restante, et rincez le flacon pour vous assurer qu’aucune cellule n’est laissée derrière.Mélangez doucement la suspension en la pipetant de haut en bas avec une pipette d’un millilitre. Retirez environ 10 microlitres de l’échantillon pour compter la viabilité des cellules à l’aide du bleu de trypan. Les cellules avec un cytoplasme clair sont viables, un cytoplasme bleu indique la mort cellulaire.Pendant le comptage, faites tourner la suspension de la cellule chaude à 200 fois G pendant sept minutes à 37 degrés Celsius. Retirez complètement le surnageant et ressuspendez les cellules dans le milieu de croissance pour atteindre une densité cellulaire de 500 000 cellules par millilitre. Mélanger doucement la suspension et transférer 22 millilitres dans des flacons de culture cellulaire T75 chacun.Conservez les flacons à la verticale dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec une concentration de dioxyde de carbone de 5% et échangez le milieu de croissance tous les trois à quatre jours. Préparer la suspension cellulaire pour ensemencer les cellules à une densité de 300 000 par millilitre par puits dans des plaques de culture cellulaire de 24 puits. Mélanger doucement le milieu et préparer des aliquotes de 26 millilitres dans des tubes de 50 millilitres.Transférer un millilitre du milieu contenant la cellule dans chaque puits d’une plaque de 24 puits. Mélangez doucement le média en le pipetant de haut en bas entre les transferts. Conservez la solution de travail de PMA fraîchement préparée sur de la glace et ajoutez 100 nanogrammes de PMA par puits.Incuber les plaques dans l’incubateur sans autre traitement pendant 72 heures. Après 72 heures, retirez le milieu de croissance et remplacez-le par un millilitre de milieu de croissance frais, en veillant à ne pas toucher le fond des puits avec des pointes de pipette. Laissez les cellules reposer pendant encore 96 heures dans l’incubateur.Retirez le milieu de croissance et remplacez-le par un millilitre de milieu de croissance frais. Ajouter 20 nanogrammes d’interleukine 4 et 20 nanogrammes d’interleukine 13 par puits. Laissez ensuite les cellules reposer pendant 48 heures dans l’incubateur.Répétez tout le processus après 48 heures et laissez les cellules reposer pendant encore 48 heures dans l’incubateur. Retirez le milieu de croissance et remplacez-le par un millilitre de milieu de croissance frais. Laissez ensuite les cellules reposer pendant 48 heures dans l’incubateur.Retirez le milieu cellulaire chaud de chaque puits et remplacez-le par un mélange d’un millilitre de PBS glacé sans calcium et magnésium et 5% FBS. Ensuite, placez immédiatement la plaque cellulaire sur de la glace pendant 45 minutes. Après 45 minutes sur la glace, grattez les cellules à l’aide de mini grattoirs à cellules.Transférer doucement les macrophages détachés dans du PBS froid et du FBS à 5% dans un tube de 15 millilitres maintenu sur de la glace. Les macrophages dérivés de la méthode de polarisation montrent l’expression de CD14, ainsi que des marqueurs CD11b. Les marqueurs monocytaires et macrophages CD14 et CD11b ont été exprimés dans 70,9 % et 74,7 % des cellules, respectivement.Les cellules ont montré de faibles niveaux de surface du marqueur de type M1 CD80 dans 0,2% des cellules, et des niveaux de surface élevés du marqueur de type M2 CD206 dans 62,6% des cellules. Comme les cellules THP-1 en milieu ont tendance à couler au fond d’un flacon et sont faciles à activer en raison de contraintes mécaniques, il est important de mélanger et de manipuler les cellules en douceur. Les macrophages de type M2 sont créés de manière reproductible et ont été caractérisés à l’aide de QR-TPCR, ELISA et de cytométrie en flux.C’est la base pour étudier les mécanismes anti-inflammatoires dans le développement du cancer ou le remodelage des tissus.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Un test Parasite sauvetage et à la transformation pour le dépistage anti-leishmaniose contre intracellulaire<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotes dans THP1 humaines ligne leucémie aiguë monocytaire cellulaire

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Recherche

Immunologie et infection

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

Enquête de la polarisation des macrophages aide de moelle osseuse macrophages dérivés

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Une<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle pour étudier l&#39;hétérogénéité de la différenciation des macrophages humains et de la polarisation

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Mise en place d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; Système d&#39;étudier le comportement intracellulaire de<em&gt; Candida glabrata</em&gt; En droits macrophages THP-1

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

L&#39;évaluation de l&#39;Innate détection du VIH-1 CD4 infectés<sup&gt; +</sup&gt; Cellules T par les cellules dendritiques plasmacytoïdes Utilisation d&#39;un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Système de co-culture.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

La transfection très efficace des droits de THP-1 par les macrophages nucléofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Souris Naïf CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolement des cellules T et<em&gt; In vitro</em&gt; Différenciation en sous-ensembles de cellules T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualisation des pièges extracellulaires de Macrophage à l’aide de la microscopie confocale

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Un protocole de boursouflure d’aspiration pour étudier les cellules T humaines rappel Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis

Une étude Immunohistopathologic pour profiler le Folate récepteurs bêta Macrophage et vasculaire microenvironnement immunitaire dans l’artérite à cellules géantes

Giant cell arteritis (GCA) is a chronic immune-mediated disease of medium-to-large sized arteries that affects older adults. GCA manifests with arthritis ...