Name: macrophage differentiation and polarization into an m2-like phenotype using a human monocyte-like thp-1 leukemia cell line
Uploaded: 2021-08-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Macrophage Differentiation and Polarization into an M2-Like Phenotype using a Human Monocyte-Like THP-1 Leukemia Cell Line at JoVE.com

מכון המחירים למחקר כירורגי, אוניברסיטת לואיוויל, נתמך כלכלית על ידי ג'ון ו. פרייס וברברה דרופון אטווד פרייס טראסט. למקורות המימון לא היה כל תפקיד בעיצוב וביצוע המחקר וכן באיסוף, ניהול, ניתוח ופרשנות הנתונים.

הערה: מבט כולל על השלבים המתוארים בפרוטוקול זה מוצג באיור 1. קו תאי הלוקמיה דמוי המונוציט האנושי THP-1 נרכש. ניתוח חוזר טנדם קצר בוצע כדי לאמת את קו התא THP-1. בצע את כל השלבים בתנאים סטריליים. קו התא המונוציטי THP-1 גדל בהשעיה ואינו מתחבר למשטחי תרבית התא. דבקות יכולה להיגרם על ידי ה...

<ol>
	<li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts+enhance+tumor-associated+macrophages+enrichment+and+suppress+NK+cells+function+in+colorectal+cancer.">Cancer-associated fibroblasts enhance tumor-associated macrophages enrichment and suppress NK cells function in colorectal cancer.</a> Cell Death and Disease. 10 (4), 273 (2019).</li><li>Wang, J., Li, D., Cang, H., Guo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+cancer+and+immune+cells:+Role+of+tumor-associated+macrophages+in+the+tumor+microenvironment.">Crosstalk between cancer and immune cells: Role of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment.</a> Cancer Medicine. 8 (10), 4709-4721 (2019).</li><li>Soncin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+creates+a+niche+for+the+self-renewal+of+tumor-promoting+macrophages+in+colon+adenoma.">The tumor microenvironment creates a niche for the self-renewal of tumor-promoting macrophages in colon adenoma.</a> Nature Communications. 9 (1), 582 (2018).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).</li><li>Mazzone, M., Menga, A., Castegna, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+TAM+functions-it+takes+two+to+tango.">Metabolism and TAM functions-it takes two to tango.</a> Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (4), 700-716 (2018).</li><li>Eum, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-promoting+macrophages+prevail+in+malignant+ascites+of+advanced+gastric+cancer.">Tumor-promoting macrophages prevail in malignant ascites of advanced gastric cancer.</a> Experimental and Molecular Medicine. 52 (12), 1976-1988 (2020).</li><li>Qian, B. Z., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+diversity+enhances+tumor+progression+and+metastasis.">Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis.</a> Cell. 141 (1), 39-51 (2010).</li><li>Scheurlen, K. M., Billeter, A. T., O'Brien, S. J., Galandiuk, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+dysfunction+and+early-onset+colorectal+cancer+-+how+macrophages+build+the+bridge.">Metabolic dysfunction and early-onset colorectal cancer - how macrophages build the bridge.</a> Cancer Medicine. 9 (18), 6679-6693 (2020).</li><li>Bosshart, H., Heinzelmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THP-1+cells+as+a+model+for+human+monocytes.">THP-1 cells as a model for human monocytes.</a> Annals of Translational Medicine. 4 (21), 438 (2016).</li><li>. The American Type Culture Collection (ATCC) Available from: <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx#generalinformation">https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx#generalinformation</a> (2021)</li><li>Baxter, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+protocols+for+differentiation+of+THP-1+cells+to+macrophages+with+distinct+M(IFNgamma+LPS),+M(IL-4),+and+M(IL-10)+phenotypes.">Standardized protocols for differentiation of THP-1 cells to macrophages with distinct M(IFNgamma+LPS), M(IL-4), and M(IL-10) phenotypes.</a> Journal of Immunological Methods. 478, 112721 (2020).</li><li>Genin, M., Clement, F., Fattaccioli, A., Raes, M., Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M1+and+M2+macrophages+derived+from+THP-1+cells+differentially+modulate+the+response+of+cancer+cells+to+etoposide.">M1 and M2 macrophages derived from THP-1 cells differentially modulate the response of cancer cells to etoposide.</a> BMC Cancer. 15, 577 (2015).</li><li>Starr, T., Bauler, T. J., Malik-Kale, P., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phorbol+12-myristate-13-acetate+differentiation+protocol+is+critical+to+the+interaction+of+THP-1+macrophages+with+Salmonella+Typhimurium.">The phorbol 12-myristate-13-acetate differentiation protocol is critical to the interaction of THP-1 macrophages with Salmonella Typhimurium.</a> PLoS One. 13 (3), 0193601 (2018).</li><li>Lund, M. E., To, J., O'Brien, B. A., Donnelly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choice+of+phorbol+12-myristate+13-acetate+differentiation+protocol+influences+the+response+of+THP-1+macrophages+to+a+pro-inflammatory+stimulus.">The choice of phorbol 12-myristate 13-acetate differentiation protocol influences the response of THP-1 macrophages to a pro-inflammatory stimulus.</a> Journal of Immunological Methods. 430, 64-70 (2016).</li><li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-6/STAT3+pathway+intermediates+M1/M2+macrophage+polarization+during+the+development+of+hepatocellular+carcinoma.">IL-6/STAT3 pathway intermediates M1/M2 macrophage polarization during the development of hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 119 (11), 9419-9432 (2018).</li><li>O'Neill, L. A. J., Artyomov, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Itaconate:+the+poster+child+of+metabolic+reprogramming+in+macrophage+function.">Itaconate: the poster child of metabolic reprogramming in macrophage function.</a> Nature Reviews Immunology. 19 (5), 273-281 (2019).</li><li>Luig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-induced+IL-6+functions+as+a+natural+brake+on+macrophages+and+limits+gn.">Inflammation-induced IL-6 functions as a natural brake on macrophages and limits gn.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1597-1607 (2015).</li><li>Maruyama, K., Nemoto, E., Yamada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+macrophage+function+-+cyclic+tensile+force+inhibits+NLRP3+inflammasome-dependent+IL-1beta+secretion+in+murine+macrophages.">Mechanical regulation of macrophage function - cyclic tensile force inhibits NLRP3 inflammasome-dependent IL-1beta secretion in murine macrophages.</a> Inflammation and Regeneration. 39, 3 (2019).</li><li>Gatto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PMA-Induced+THP-1+Macrophage+Differentiation+is+Not+Impaired+by+Citrate-Coated+Platinum+Nanoparticles.">PMA-Induced THP-1 Macrophage Differentiation is Not Impaired by Citrate-Coated Platinum Nanoparticles.</a> Nanomaterials (Basel). 7 (10), (2017).</li><li>Maess, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+PMA+enhances+the+responsiveness+of+transfected+THP-1+macrophages+to+polarizing+stimuli.">Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli.</a> Journal of Immunological Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).</li><li>Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+PMA-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages.">The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).</li><li>Raggi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+human+macrophage+M1-M2+polarization+balance+by+hypoxia+and+the+triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-1.">Regulation of human macrophage M1-M2 polarization balance by hypoxia and the triggering receptor expressed on myeloid cells-1.</a> Frontiers in Immunology. 8, 11097 (2017).</li><li>Neutelings, T., Lambert, C. A., Nusgens, B. V., Colige, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mild+cold+shock+(25+degrees+C)+followed+by+warming+up+at+37+degrees+C+on+the+cellular+stress+response.">Effects of mild cold shock (25 degrees C) followed by warming up at 37 degrees C on the cellular stress response.</a> PLoS One. 8 (7), 69687 (2013).</li><li>Kurashina, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-free+release+of+adhered+cells+from+standard+culture+dishes+using+intermittent+ultrasonic+traveling+waves.">Enzyme-free release of adhered cells from standard culture dishes using intermittent ultrasonic traveling waves.</a> Communications Biology. 2, 393 (2019).</li><li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function.">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).</li><li>Bailey, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+murine+bone+marrow-derived+macrophages+for+nitric+oxide+and+redox+biology.">Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology.</a> Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).</li></ol>

פרוטוקול זה על הבחנה וקיטוב תאים דמויי THP-1 בתוך 14 ימים מספק שיטה להשיג מקרופאגים עם פנוטיפ דמוי M2 נפרד עקב דגירה טיפול ארוכה של תאים עם תקופות מנוחה נאותה בין שלבים.
שלבים מסוימים הם קריטיים לפרוטוקול זה. זמן ההכפלה של מונוציטים THP-1 הוא כ 26 שעות. תאים יכולים להיות מפוצלים בצפי...

מקרופאגים הקשורים לגידול (TAM) ותפקידם בדלקת כרונית, תחילת הסרטן והתפתחות הגידול הם מטרות חשובות במחקר האחרון1,2. מונוציטים דם היקפיים המגויסים למיקרו-סביבה של הגידול המתפתח מבדילים למקרופאגים וניתן לקוטב לשני תתי סוגים עיקריים של מקרופאגים3. המקרופאג' המופעל קלאסית מייצג את הפנוטיפ דמוי M1 הפרו-דלקתי בעיקר ותת-סוג דמוי M2 המופעל לחילופין מראה מאפיינים אנטי דלקתיים בעיקר4. מקרופאגים יכולים לעבור באופן דינמי בין שני פנוטיפים עיקריים אלה בהתאם לחילוף החומרים התאי שלהם, עם תת-סוגים ביניים בעלי תכונות דלקתיות ואנטי דלקתיות5. TAM מייצג אוכלוסייה הטרוגנית של שני הפנוטיפים. פונקציה לקידום גידול ופרוגנוזה ירודה בסוגים שונים של סרטן קשורה במיוחד למקרופאגים דמויי M26,7,8.
הפרופילים התפקודיים של מקרופאגים והאינטראקציה שלהם עם תאים אחרים בתוך המיקרו-סביבה של הגידול הם מורכבים ומאתגרים ללכידה בסביבה המשתנה ללא הרף במהלך התפתחות גידול מתמשכת. קווי תאים יכולים לספק לאוכלוסיית תאים הומוגנית יכולת כדאיות יציבה בתרבות, אשר יכולה להקל על תהליך הדגמת מנגנונים תאיים ובין תאיים מוגדרים. קו התאים דמוי מונוציט THP-1 הוא מערכת מודל לגיטימית למונוציטים אנושיים ראשוניים9. קו תאים מונצח באופן ספונטני זה הושג מדם היקפי של תינוק בן שנה עם לוקמיה מונוציטיתחריפה 9,10. הבידול והקיטוב של תאי THP-1 דווחו על ידי מספר מחקרים ובוצעו בדרכים שונות מרובות11,12,13,14. הפעלה, ולכן, הקיטוב של מקרופאגים לתוך פנוטיפ דמוי M1 מלווה מנגנון ריבאונד אנטי דלקתי מפצה, קידום פנוטיפ דמוי M2 באמצעות ציטוקינים המיוצרים על ידי מקרופאגים דלקתיים, כגון אינטרלוקין 6 (IL-6) או itaconate15,16. זה עשוי לשמש כמנגנון שבירה כדי להחלשות תגובה דלקתית overshooting לאחר הפעלת התא17. תהליך ההבחנה והקיטוב של מונוציטים ותאים דמויי THP-1 לפנוטיפ אנטי דלקתי דמוי M2 מלווה בעצמו גם בגירויים פרו דלקתיים שיש להתגבר עליהם. תגובת ציטוקינים דלקתית יכולה להיגרם על ידי מתח מכני18, כגון שינוי מדיה כדי להזין מחדש את התאים, או הוספת תרכובות כימיות כדי להבדיל בין תאי THP-1, כגון פורבול 12-myristate 13-אצטט (PMA), ולזירוז ייצור של גורם נמק הגידול α (TNFα), אינטרלוקין 1β (IL-1β) או IL-619. פרופיל ביטוי ציטוקינים שונה זה כתגובה ל- PMA יכול להשפיע ולמנוע קיטוב מקרופאגים עוקב20. תקופות מנוחה נאותות, כפי שדווח בעבר לאחר טיפול PMA, לאפשר תגובות דלקתיות אלה כדי להקטין ולהקל על קיטוב התא לתוך פנוטיפ M2-כמו ברור21.
פרוטוקול זה מדגים שיטה להבדיל ולקטב תאים דמויי THP-1 לתוך פנוטיפ דמוי M2 של מקרופאגים בתוך 14 ימים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% trypan blue</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>152-5061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, USA</td>
			<td>1615-5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>&#160;89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L TipOne pipet tips</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, USA</td>
			<td>1111-2821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL&#160; Centrifuge tube</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>89039-664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L TipOne pipet tips</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, USA</td>
			<td>1120-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L TipOne pipet tips</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, USA</td>
			<td>1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipet</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>&#160;89130-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipet</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>&#160;89130-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tube</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>89039-662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase solution 500 mL</td>
			<td>Sigma, St. Louis, USA</td>
			<td>A6964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized</td>
			<td>Sigma, St. Louis, USA</td>
			<td>A5955-100 mL</td>
			<td>with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 &#956;g of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binder CO2 Incubator</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>C170-ULE3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoOne T-75cm flask with filter cap</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, USA</td>
			<td>CC7682-4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma, St. Louis, USA</td>
			<td>D8537-500 mL</td>
			<td>PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated)</td>
			<td>Eppendorf, Enfield, USA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol (70%)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCalibur flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences, San Diego, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 24-well plate</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ATCC, Manassas, USA</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse Anti-Human CD14</td>
			<td>BD Biosciences, San Diego, USA</td>
			<td>555397</td>
			<td>Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse Anti-Human CD80</td>
			<td>BD Pharmingen, San Diego, USA</td>
			<td>557226</td>
			<td>Flow cytometry, M1 marker (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1 &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Pharmingen, San Diego, USA</td>
			<td>555748</td>
			<td>Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG2a, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences, San Diego, USA</td>
			<td>553456</td>
			<td>Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BD Fc Block</td>
			<td>BD Biosciences, San Diego, USA</td>
			<td>564220</td>
			<td>Flow cytometry, Fc block (0.25 mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human interleukin 13 (IL-13)</td>
			<td>R&#38;D, Minneapolis, USA</td>
			<td>IL-771-10 &#956;g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human interleukin 4 (IL-4)</td>
			<td>R&#38;D, Minneapolis, USA</td>
			<td>SRP3093-20 &#956;g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213)</td>
			<td>Labconco, Kansas City, USA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine Solution, 200 mM</td>
			<td>ATCC, Manassas, USA</td>
			<td>30-2214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4</td>
			<td>Sigma, St. Louis, USA</td>
			<td>L2630-100 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Cell Scrapers</td>
			<td>Biotium, Fremont, USA</td>
			<td>22003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>02-671-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse inverted microscope TS100</td>
			<td>Nikon, Melville, USA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, USA</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Light Microscope RH-2</td>
			<td>Microscope Central, Feasterville, USA</td>
			<td>40888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 variable pipet- Gilson</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>76180-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 variable pipet-Gilson</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>76177-990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 variable pipet- Gilson</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>76177-988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD11b</td>
			<td>BD Biosciences, San Diego, USA</td>
			<td>555388</td>
			<td>Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences, San Diego, USA</td>
			<td>555749</td>
			<td>Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206</td>
			<td>BD Pharmingen, San Diego, USA</td>
			<td>551136</td>
			<td>Flow cytometry, M2 marker (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy 5 Mouse IgG1 &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Pharmingen, San Diego, USA</td>
			<td>555750</td>
			<td>Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma, St. Louis, USA</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerpette Plus pipettor</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>75856-448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Water bath (model 183)</td>
			<td>Precision Scientific, Chicago, USA</td>
			<td>66551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>ATCC, Manassas, USA</td>
			<td>30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>ATCC, Manassas, USA</td>
			<td>TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

macrophage differentiation and polarization into an m2-like phenotype using a human monocyte-like thp-1 leukemia cell line

מקרופאגים הקשורים לגידול (TAM) יכולים להחליף את הביטוי שלהם ואת פרופיל הציטוקינים שלהם על פי גירויים חיצוניים. פלסטיות יוצאת דופן זו מאפשרת ל- TAM להסתגל לשינויים מתמשכים בתוך מיקרו-סביבה של הגידול. מקרופאגים יכולים להיות בעיקר תכונות פרו דלקתיות (דמויי M1) או אנטי דלקתיות (דמויי M2) ויכולים לעבור ללא הרף בין שתי המדינות העיקריות הללו. מקרופאגים דמויי M2 בסביבת הגידול קשורים להתקדמות הסרטן ופרוגנוזה ירודה במספר סוגים של סרטן. שיטות רבות ושונות לגרימת בידול וקיטוב של תאי THP-1 משמשות לחקירת מנגנונים תאיים ובין תאיים והשפעות TAM בתוך המיקרו-סביבה של גידולים. נכון לעכשיו, אין מודל מבוסס לקיטוב מקרופאגים דמוי M2 באמצעות קו התא THP-1, ותוצאות פרופילי הביטוי והציטוקינים של מקרופאגים בשל גירויים במבחנה מסוימים משתנות בין מחקרים. פרוטוקול זה משמש הדרכה מפורטת כדי להבדיל בין תאים דמויי THP-1 מונוציט למקרופאגים M0 ולקטב עוד יותר תאים לתוך פנוטיפ דמוי M2 בתוך 14 ימים. אנו מדגימים את השינויים המורפולוגיים של תאים דמויי THP-1, מקרופאגים מובחנים ומקרופאגים מקוטבים דמויי M2 באמצעות מיקרוסקופיה קלה. מודל זה הוא הבסיס למודלים של קו התאים החוקרים את ההשפעות האנטי דלקתיות של TAM ואת האינטראקציות שלהם עם אוכלוסיות תאים אחרות של microenvironment הגידול.

מקרופאגים דמויי M2 אופיינו, וקיטוב M2 אומת באמצעות ציטומטריית זרימה עבור אשכול של סמני בידול (CD) CD14, CD11b, CD80 (סמן דמוי M1) ו- CD206 (סמן דמוי M2). כתמי ציטומטריה זרימה בוצעו על פי הוראות היצרן. מקרופאגים נשטפו עם PBS / 5% FBS ודגרו עם בלוק קולטן Fcγ כדי למנוע כריכה לא מוגדרת. התאים הוכתמו אז בנוגדנים נגד CD14 ו-C...

Watch this Scientific Journal Video about Macrophage Differentiation and Polarization into an M2-Like Phenotype using a Human Monocyte-Like THP-1 Leukemia Cell Line at JoVE.com

Macrophage Differentiation and Polarization into an M2-Like Phenotype using a Human Monocyte-Like THP-1 Leukemia Cell Line

מקרופאגים דמויי M2 הקשורים לגידול (TAM) קשורים להתקדמות הגידול ולאבחנה לקויה בסרטן. פרוטוקול זה משמש כמדריך מפורט להבחנה וקיטוב של תאים דמויי THP-1 למקרופאגים דמויי M2 תוך 14 יום. מודל זה הוא הבסיס לחקור את ההשפעות האנטי דלקתיות של TAM בתוך microenvironment הגידול.

בידול מקרופאג' וקיטוב לפנוטיפ דמוי M2 באמצעות קו תאים דמוי THP-1 לוקמיה דמוי מונוציטים

Tumor-associated macrophages (TAM) can switch their expression and cytokine profile according to external stimuli. This remarkable plasticity enables TAM ...

מקרופאגים הקשורים לגידול אנטי דלקתי קשורים להתקדמות ולאבחנה לקויה בסרטן. פרוטוקול זה הוא מדריך להבחנה וקיטוב של תאים דמויי THP-1 למקרופאגים דמויי M2 תוך 14 יום. נכון לעכשיו אין מודל מבוסס לקיטוב THP-1 אנטי דלקתי.פרוטוקול זה משתמש בתקופות מנוחה נאותות ובתהליך קיטוב ממושך כדי ליצור סוג משנה ייחודי דמוי מקרופאג' דמוי M2. התפתחות הגידול, למשל, בסרטן המעי הגס ובשיפוץ רקמות, נשלטת על ידי מקרופאגים אנטי דלקתיים. בין מחקרים החוקרים את תפקידם, יצירה סטנדרטית של תת-סוג דמוי M2 מובהק מבטיחה ממצאים ניתנים לשחזור.התחל על-ידי הגדרת שעון שעון התזמן למשך 150 שניות. הסר את הנקינה הקפואה המכילה את קו התא THP-1 מן החנקן הנוזלי להפשיר את הסליל מיד ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים נקיים, מתחיל את הטיימר ברגע שהביחינה מוכנסת לאמבט המים. לשחרר את המכסה כדי לשחרר את הלחץ שנבנה עקב תהליך ההפשרה, להבטיח כי פתיחת הצינור לא ליצור קשר עם המים כדי למנוע זיהום.להפשיר את השעיית התא עד שבב קרח על ארבעה מילימטרים בגודל נשאר בתוך המשחקון ולהמשיך לשלב הבא מיד. העבר את השלב הנוזלי של השעיית התא לצינור 15 מיליליטר המכיל תשעה מיליליטר של מדיה צמיחה חמה. לאחר מכן העבר מיליליטר אחד של השעיית תא בינוני חם זה לתוך מקטורן THP-1 ובחזרה לצינור 15 מיליליטר כדי להמיס את שבב הקרח הנותר, ולשטוף את הקרבון כדי להבטיח שלא יישארו תאים מאחור.מערבבים את המתלים בעדינות על ידי צנרת אותו למעלה ולמטה עם פיפטה של מיליליטר אחד. הסר כ 10 microliters של המדגם לספור את התאים עבור קיימא באמצעות כחול טריפן. התאים עם ציטופלסמה ברורה הם קיימא, ציטופלסמה כחולה מצביעה על מוות תאים.תוך כדי ספירה, לסובב את השעיית התא החם ב 200 פעמים G במשך שבע דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant לחלוטין resuspend התאים במדיום צמיחה כדי להשיג צפיפות תא של 500, 000 תאים למיליליטר. מערבבים את המתלים בעדינות ומעבירים 22 מיליליטר לתוך צלוחיות תרבית תאים T75 כל אחד.לאחסן את הבקבוקונים זקופים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם ריכוז 5% פחמן דו חמצני ולהחליף את מדיה הצמיחה כל שלושה עד ארבעה ימים. הכן את השעיית התא לזרוע את התאים בצפיפות של 300, 000 למיליליטר לבאר לתוך לוחות תרבית תאים 24-well. מערבבים את המדיום בעדינות ומכין עליקוטים של 26 מיליליטר בצינורות 50 מיליליטר.מעבירים מיליליטר אחד של המדיום המכיל תאים לכל באר של צלחת 24-well. מערבבים את המדיה בעדינות על ידי צנרת אותה למעלה ולמטה בין העברות. שמור את פתרון העבודה המוכן טרי של PMA על קרח ולהוסיף 100 ננוגרם של PMA לכל טוב.לדגור על הצלחות באינקובטור ללא טיפול נוסף במשך 72 שעות. לאחר 72 שעות, להסיר את מדיום הצמיחה ולהחליף אותו עם מיליליטר אחד של מדיום צמיחה טרי, להבטיח לא לגעת בתחתית הבארות עם טיפים pipette. תן לתאים לנוח עוד 96 שעות באינקובטור.הסר את מדיום הצמיחה ולהחליף אותו עם מיליליטר אחד של מדיום צמיחה טרי. הוסף 20 ננוגרם של אינטרלוקין 4 ו 20 ננוגרם של אינטרלוקין 13 לבאר. ואז תן לתאים לנוח במשך 48 שעות באינקובטור.חזור על כל התהליך לאחר 48 שעות ולתת לתאים לנוח עוד 48 שעות באינקובטור. הסר את מדיום הצמיחה ולהחליף אותו עם מיליליטר אחד של מדיום צמיחה טרי. ואז תן לתאים לנוח במשך 48 שעות באינקובטור.הסר את בינוני התא החם מכל באר ולהחליף אותו עם תערובת מיליליטר אחד של PBS קר כקרח ללא סידן ומגנזיום ו 5% FBS. ואז מיד למקם את צלחת התא על קרח במשך 45 דקות. לאחר 45 דקות על קרח, לגרד את התאים באמצעות מגרדי תאים מיני.העבירו בעדינות את המקרופאגים המנותקים ל-PBS קר ו-5% FBS בצינור של 15 מיליליטר שנשמר על קרח. המקרופאגים הנגזרים משיטת הקיטוב מציגים את הביטוי של CD14, כמו גם סמני CD11b. סמני המונוציט והמקרופיג' CD14 ו- CD11b באו לידי ביטוי ב- 70.9% ו- 74.7% מהתאים, בהתאמה.תאים הראו רמות פני שטח נמוכות של CD80 סמן דמוי M1 ב 0.2% של תאים, ורמות פני השטח גבוהות של CD206 סמן דמוי M2 ב 62.6% של תאים. כמו תאי THP-1 בינוני נוטים לשקוע לתחתית של בוחן וקל להפעיל באמצעות מתח מכני, ערבוב עדין וטיפול של התאים חשוב. מקרופאגים דמויי M2 נוצרים באופן חוזר, והם מאופיינים באמצעות QR-TPCR, ELISA וציטומטריית זרימה.זהו הבסיס לחקירת מנגנונים אנטי דלקתיים בהתפתחות סרטן או שיפוץ רקמות.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Assay הצלה וטרנספורמציה טפילה להקרנת Antileishmanial נגד תאי<em&gt; ישמניה donovani</em&gt; Amastigotes בקו THP1 אדם חריף Monocytic וקמיה של תאים

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

חקירה של קיטוב Macrophage שימוש המקרופאגים נגזרים מח עצם

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל ללמוד ההטרוגניות של בידול Macrophage אדם וקיטוב

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

הקמתה של<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת ללמוד את התנהגות תאית של<em&gt; קנדידה glabrata</em&gt; בהמקרופאגים THP-1 אדם

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

הערכת חישה המולדת של CD4 הנגוע ב- HIV-1<sup&gt; +</sup&gt; T תאים על ידי תאים דנדריטים Plasmacytoid שימוש<em&gt; Ex vivo</em&gt; עמית תרבות מערכת.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Transfection יעיל ביותר של של אדם המקרופאגים THP-1 על ידי nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

העכבר נאיבי CD4<sup&gt; +</supו&gt; בידוד תא T<em&gt; במבחנה</em&gt; בידול לתוך תת תא T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

להמחיש מלכודות חוץ-תאי מקרופאג באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

פרוטוקול שלפוחית היניקה לימודים אדם T-cell האחזור תגובות In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis

מחקר Immunohistopathologic פרופיל חומצה פולית קולטן בטא מקרופאג של כלי הדם Microenvironment המערכת החיסונית ב Arteritis תא ענק

Giant cell arteritis (GCA) is a chronic immune-mediated disease of medium-to-large sized arteries that affects older adults. GCA manifests with arthritis ...