Name: macrophage differentiation and polarization into an m2-like phenotype using a human monocyte-like thp-1 leukemia cell line
Uploaded: 2021-08-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Macrophage Differentiation and Polarization into an M2-Like Phenotype using a Human Monocyte-Like THP-1 Leukemia Cell Line at JoVE.com

O Price Institute of Surgical Research, Universidade de Louisville, é apoiado financeiramente pela John W. Price e Barbara Thruston Atwood Price Trust. As fontes de financiamento não tiveram papel na concepção e condução do estudo, bem como na coleta, gestão, análise e interpretação dos dados.

NOTA: Uma visão geral das etapas descritas neste protocolo é mostrada na Figura 1. A linha celular de leucemia semelhante a monócitos humanos THP-1 foi comprada. A análise de repetição em tandem curto foi realizada para autenticar a linha celular THP-1. Realize todas as etapas em condições estéreis. A linha de células monocíticas THP-1 cresce em suspensão e não se prende a superfícies de cultura celular. A adesão pode ser induzida pela diferenciação de monócitos em células...

<ol>
	<li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts+enhance+tumor-associated+macrophages+enrichment+and+suppress+NK+cells+function+in+colorectal+cancer.">Cancer-associated fibroblasts enhance tumor-associated macrophages enrichment and suppress NK cells function in colorectal cancer.</a> Cell Death and Disease. 10 (4), 273 (2019).</li><li>Wang, J., Li, D., Cang, H., Guo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+cancer+and+immune+cells:+Role+of+tumor-associated+macrophages+in+the+tumor+microenvironment.">Crosstalk between cancer and immune cells: Role of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment.</a> Cancer Medicine. 8 (10), 4709-4721 (2019).</li><li>Soncin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+creates+a+niche+for+the+self-renewal+of+tumor-promoting+macrophages+in+colon+adenoma.">The tumor microenvironment creates a niche for the self-renewal of tumor-promoting macrophages in colon adenoma.</a> Nature Communications. 9 (1), 582 (2018).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).</li><li>Mazzone, M., Menga, A., Castegna, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+TAM+functions-it+takes+two+to+tango.">Metabolism and TAM functions-it takes two to tango.</a> Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (4), 700-716 (2018).</li><li>Eum, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-promoting+macrophages+prevail+in+malignant+ascites+of+advanced+gastric+cancer.">Tumor-promoting macrophages prevail in malignant ascites of advanced gastric cancer.</a> Experimental and Molecular Medicine. 52 (12), 1976-1988 (2020).</li><li>Qian, B. Z., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+diversity+enhances+tumor+progression+and+metastasis.">Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis.</a> Cell. 141 (1), 39-51 (2010).</li><li>Scheurlen, K. M., Billeter, A. T., O'Brien, S. J., Galandiuk, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+dysfunction+and+early-onset+colorectal+cancer+-+how+macrophages+build+the+bridge.">Metabolic dysfunction and early-onset colorectal cancer - how macrophages build the bridge.</a> Cancer Medicine. 9 (18), 6679-6693 (2020).</li><li>Bosshart, H., Heinzelmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THP-1+cells+as+a+model+for+human+monocytes.">THP-1 cells as a model for human monocytes.</a> Annals of Translational Medicine. 4 (21), 438 (2016).</li><li>. The American Type Culture Collection (ATCC) Available from: <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx#generalinformation">https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx#generalinformation</a> (2021)</li><li>Baxter, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+protocols+for+differentiation+of+THP-1+cells+to+macrophages+with+distinct+M(IFNgamma+LPS),+M(IL-4),+and+M(IL-10)+phenotypes.">Standardized protocols for differentiation of THP-1 cells to macrophages with distinct M(IFNgamma+LPS), M(IL-4), and M(IL-10) phenotypes.</a> Journal of Immunological Methods. 478, 112721 (2020).</li><li>Genin, M., Clement, F., Fattaccioli, A., Raes, M., Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M1+and+M2+macrophages+derived+from+THP-1+cells+differentially+modulate+the+response+of+cancer+cells+to+etoposide.">M1 and M2 macrophages derived from THP-1 cells differentially modulate the response of cancer cells to etoposide.</a> BMC Cancer. 15, 577 (2015).</li><li>Starr, T., Bauler, T. J., Malik-Kale, P., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phorbol+12-myristate-13-acetate+differentiation+protocol+is+critical+to+the+interaction+of+THP-1+macrophages+with+Salmonella+Typhimurium.">The phorbol 12-myristate-13-acetate differentiation protocol is critical to the interaction of THP-1 macrophages with Salmonella Typhimurium.</a> PLoS One. 13 (3), 0193601 (2018).</li><li>Lund, M. E., To, J., O'Brien, B. A., Donnelly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choice+of+phorbol+12-myristate+13-acetate+differentiation+protocol+influences+the+response+of+THP-1+macrophages+to+a+pro-inflammatory+stimulus.">The choice of phorbol 12-myristate 13-acetate differentiation protocol influences the response of THP-1 macrophages to a pro-inflammatory stimulus.</a> Journal of Immunological Methods. 430, 64-70 (2016).</li><li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-6/STAT3+pathway+intermediates+M1/M2+macrophage+polarization+during+the+development+of+hepatocellular+carcinoma.">IL-6/STAT3 pathway intermediates M1/M2 macrophage polarization during the development of hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 119 (11), 9419-9432 (2018).</li><li>O'Neill, L. A. J., Artyomov, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Itaconate:+the+poster+child+of+metabolic+reprogramming+in+macrophage+function.">Itaconate: the poster child of metabolic reprogramming in macrophage function.</a> Nature Reviews Immunology. 19 (5), 273-281 (2019).</li><li>Luig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-induced+IL-6+functions+as+a+natural+brake+on+macrophages+and+limits+gn.">Inflammation-induced IL-6 functions as a natural brake on macrophages and limits gn.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1597-1607 (2015).</li><li>Maruyama, K., Nemoto, E., Yamada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+macrophage+function+-+cyclic+tensile+force+inhibits+NLRP3+inflammasome-dependent+IL-1beta+secretion+in+murine+macrophages.">Mechanical regulation of macrophage function - cyclic tensile force inhibits NLRP3 inflammasome-dependent IL-1beta secretion in murine macrophages.</a> Inflammation and Regeneration. 39, 3 (2019).</li><li>Gatto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PMA-Induced+THP-1+Macrophage+Differentiation+is+Not+Impaired+by+Citrate-Coated+Platinum+Nanoparticles.">PMA-Induced THP-1 Macrophage Differentiation is Not Impaired by Citrate-Coated Platinum Nanoparticles.</a> Nanomaterials (Basel). 7 (10), (2017).</li><li>Maess, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+PMA+enhances+the+responsiveness+of+transfected+THP-1+macrophages+to+polarizing+stimuli.">Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli.</a> Journal of Immunological Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).</li><li>Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+PMA-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages.">The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).</li><li>Raggi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+human+macrophage+M1-M2+polarization+balance+by+hypoxia+and+the+triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-1.">Regulation of human macrophage M1-M2 polarization balance by hypoxia and the triggering receptor expressed on myeloid cells-1.</a> Frontiers in Immunology. 8, 11097 (2017).</li><li>Neutelings, T., Lambert, C. A., Nusgens, B. V., Colige, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mild+cold+shock+(25+degrees+C)+followed+by+warming+up+at+37+degrees+C+on+the+cellular+stress+response.">Effects of mild cold shock (25 degrees C) followed by warming up at 37 degrees C on the cellular stress response.</a> PLoS One. 8 (7), 69687 (2013).</li><li>Kurashina, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-free+release+of+adhered+cells+from+standard+culture+dishes+using+intermittent+ultrasonic+traveling+waves.">Enzyme-free release of adhered cells from standard culture dishes using intermittent ultrasonic traveling waves.</a> Communications Biology. 2, 393 (2019).</li><li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function.">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).</li><li>Bailey, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+murine+bone+marrow-derived+macrophages+for+nitric+oxide+and+redox+biology.">Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology.</a> Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).</li></ol>

Este protocolo de diferenciação e polarização de células monocitos THP-1 dentro de 14 dias fornece um método para obter macrófagos com um fenótipo distinto semelhante a M2 devido à longa incubação de células com períodos de descanso adequados entre as etapas.
Certos passos são fundamentais para este protocolo. O tempo de duplicação dos monócitos THP-1 é de aproximadamente 26 h. As células podem ser divididas a uma densidade celular de 9 x 105/mL e devem ser semead...

Macrófagos associados ao tumor (TAM) e seu papel na inflamação crônica, o aparecimento do câncer e o desenvolvimento de tumores são alvos importantes em pesquisas recentes1,2. Monócitos sanguíneos periféricos que são recrutados para o microambiente tecidual do tumor em desenvolvimento se diferenciam em macrófagos e podem ser polarizados em dois subtipos principais de macrófagos3. O macrófago ativado clássicamente representa o fenótipo m1 principalmente pró-inflamatório e o subtipo alternativo ativado como M2 mostra características predominantemente anti-inflamatórias4. Os macrófagos podem alternar dinamicamente entre esses dois fenótipos principais dependendo do metabolismo celular, com subtipos intermediários com atributos inflamatórios e anti-inflamatórios5. A TAM representa uma população heterogênea de ambos os fenótipos. Uma função promotora de tumores e um prognóstico ruim em diferentes tipos de cânceres está, no entanto, particularmente associado aos macrófagos semelhantes a M26,7,8.
Os perfis funcionais de macrófagos e sua interação com outras células dentro do microambiente tumoral são complexos e desafiadores de capturar em um ambiente em constante mudança durante o desenvolvimento contínuo do tumor. As linhas celulares podem proporcionar uma população celular homogênea com viabilidade estável na cultura, o que pode facilitar o processo de demonstração de mecanismos celulares e intercelulares definidos. A linha celular THP-1 semelhante a monócitos é um sistema modelo legítimo para monócitos humanos primários9. Esta linha celular espontaneamente imortalizada foi obtida a partir do sangue periférico de uma criança de um ano de idade com leucemia monocítica aguda9,10. A diferenciação e polarização das células THP-1 têm sido relatadas por diversos estudos e têm sido realizadas de várias formas diferentes11,12,13,14. Ativação e, portanto, a polarização dos macrófagos em um fenótipo semelhante a M1 é seguida por um mecanismo de recuperação anti-inflamatória compensatória, promovendo um fenótipo semelhante a M2 através de citocinas produzidas por macrófagos inflamatórios, como a interleucina 6 (IL-6) ou a itacina15,16. Isso pode servir como um mecanismo de ruptura para atenuar uma resposta inflamatória exagerada após a ativaçãocelular 17. O processo de diferenciação e polarização de monócitos e células monocitos THP-1 em um fenótipo anti-inflamatório semelhante a M2 é também acompanhado por estímulos pró-inflamatórios que devem ser superados. Uma resposta inflamatória de citocinas pode ser causada por estresse mecânico18,como a mudança de mídia para realimentar as células, ou adicionar compostos químicos para diferenciar células THP-1, como phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA), e induzir a produção de fator de necrose tumoral α (TNFα), interleucina 1β (IL-1β) ou IL-619. Esse perfil de expressão de citocina alterado como resposta ao PMA pode afetar e prevenir a polarização do macrófago subsequente20. Períodos de descanso adequados, como relatado antes após o tratamento da PMA, permitem que essas respostas inflamatórias diminuam e facilitem a polarização celular em um fenótipo21distinto semelhante a M2 .
Este protocolo demonstra um método para diferenciar e polarizar células semelhantes ao monócito THP-1 em um fenótipo semelhante a M2 de macrófagos dentro de 14 dias.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% trypan blue</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>152-5061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, USA</td>
			<td>1615-5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>&#160;89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L TipOne pipet tips</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, USA</td>
			<td>1111-2821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL&#160; Centrifuge tube</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>89039-664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L TipOne pipet tips</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, USA</td>
			<td>1120-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L TipOne pipet tips</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, USA</td>
			<td>1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipet</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>&#160;89130-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipet</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>&#160;89130-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tube</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>89039-662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase solution 500 mL</td>
			<td>Sigma, St. Louis, USA</td>
			<td>A6964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized</td>
			<td>Sigma, St. Louis, USA</td>
			<td>A5955-100 mL</td>
			<td>with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 &#956;g of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binder CO2 Incubator</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>C170-ULE3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoOne T-75cm flask with filter cap</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, USA</td>
			<td>CC7682-4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma, St. Louis, USA</td>
			<td>D8537-500 mL</td>
			<td>PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated)</td>
			<td>Eppendorf, Enfield, USA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol (70%)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCalibur flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences, San Diego, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 24-well plate</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ATCC, Manassas, USA</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse Anti-Human CD14</td>
			<td>BD Biosciences, San Diego, USA</td>
			<td>555397</td>
			<td>Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse Anti-Human CD80</td>
			<td>BD Pharmingen, San Diego, USA</td>
			<td>557226</td>
			<td>Flow cytometry, M1 marker (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1 &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Pharmingen, San Diego, USA</td>
			<td>555748</td>
			<td>Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG2a, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences, San Diego, USA</td>
			<td>553456</td>
			<td>Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BD Fc Block</td>
			<td>BD Biosciences, San Diego, USA</td>
			<td>564220</td>
			<td>Flow cytometry, Fc block (0.25 mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human interleukin 13 (IL-13)</td>
			<td>R&#38;D, Minneapolis, USA</td>
			<td>IL-771-10 &#956;g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human interleukin 4 (IL-4)</td>
			<td>R&#38;D, Minneapolis, USA</td>
			<td>SRP3093-20 &#956;g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213)</td>
			<td>Labconco, Kansas City, USA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine Solution, 200 mM</td>
			<td>ATCC, Manassas, USA</td>
			<td>30-2214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4</td>
			<td>Sigma, St. Louis, USA</td>
			<td>L2630-100 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Cell Scrapers</td>
			<td>Biotium, Fremont, USA</td>
			<td>22003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>02-671-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse inverted microscope TS100</td>
			<td>Nikon, Melville, USA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, USA</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Light Microscope RH-2</td>
			<td>Microscope Central, Feasterville, USA</td>
			<td>40888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 variable pipet- Gilson</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>76180-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 variable pipet-Gilson</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>76177-990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 variable pipet- Gilson</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>76177-988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD11b</td>
			<td>BD Biosciences, San Diego, USA</td>
			<td>555388</td>
			<td>Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences, San Diego, USA</td>
			<td>555749</td>
			<td>Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206</td>
			<td>BD Pharmingen, San Diego, USA</td>
			<td>551136</td>
			<td>Flow cytometry, M2 marker (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy 5 Mouse IgG1 &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Pharmingen, San Diego, USA</td>
			<td>555750</td>
			<td>Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma, St. Louis, USA</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerpette Plus pipettor</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>75856-448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Water bath (model 183)</td>
			<td>Precision Scientific, Chicago, USA</td>
			<td>66551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>ATCC, Manassas, USA</td>
			<td>30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>ATCC, Manassas, USA</td>
			<td>TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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macrophage differentiation and polarization into an m2-like phenotype using a human monocyte-like thp-1 leukemia cell line

Os macrófagos associados ao tumor (TAM) podem mudar sua expressão e perfil de citocina de acordo com estímulos externos. Essa notável plasticidade permite que a TAM se adapte às mudanças contínuas dentro do microambiente tumoral. Os macrófagos podem ter atributos principalmente pró-inflamatórios (semelhantes a M1) ou anti-inflamatórios (semelhantes a M2) e podem alternar continuamente entre esses dois estados principais. Macrófagos semelhantes a M2 no ambiente tumoral estão associados à progressão do câncer e ao prognóstico ruim em vários tipos de câncer. Muitos métodos diferentes para induzir diferenciação e polarização das células THP-1 são usados para investigar mecanismos celulares e intercelulares e os efeitos da TAM dentro do microambiente dos tumores. Atualmente, não há um modelo estabelecido para a polarização macrófago semelhante a M2 usando a linha celular THP-1, e os resultados de perfis de expressão e citocina de macrófagos devido a certos estímulos in vitro variam entre estudos. Este protocolo serve como orientação detalhada para diferenciar células semelhantes ao monócito THP-1 em macrófagos M0 e para polarizar ainda mais as células em um fenótipo semelhante a M2 dentro de 14 dias. Demonstramos as alterações morfológicas das células moncidas THP-1, macrófagos diferenciados e macrófagos polarizados semelhantes a M2 usando microscopia leve. Este modelo é a base para modelos de linha celular que investigam os efeitos anti-inflamatórios da TAM e suas interações com outras populações celulares do microambiente tumoral.

Macrófagos semelhantes a M2 foram caracterizados, e a polarização M2 foi validada usando citometria de fluxo para marcadores de cluster de diferenciação CD14, CD11b, CD80 (marcador semelhante a M1) e CD206 (marcador semelhante a M2). A coloração da citometria de fluxo foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. Os macrófagos foram lavados com PBS/5% FBS e incubados com bloco de receptor de Fcγ para evitar ligação inespecífica. As células foram então manchadas com anticorpos anti-humanos de ca...

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Macrophage Differentiation and Polarization into an M2-Like Phenotype using a Human Monocyte-Like THP-1 Leukemia Cell Line

Macrófagos associados ao tumor M2 (TAM) estão associados à progressão do tumor e ao prognóstico ruim no câncer. Este protocolo serve como um guia detalhado para reproduzir e polarizar células semelhantes a monócitos THP-1 em macrófagos semelhantes a M2 dentro de 14 dias. Este modelo é a base para investigar os efeitos anti-inflamatórios da TAM dentro do microambiente tumoral.

Diferenciação e polarização do macrófago em um fenótipo semelhante a M2 usando uma linha celular de leucemia THP-1 semelhante ao monocito humano

Tumor-associated macrophages (TAM) can switch their expression and cytokine profile according to external stimuli. This remarkable plasticity enables TAM ...

Macrófagos associados ao tumor anti-inflamatório estão ligados à progressão e ao prognóstico ruim no câncer. Este protocolo é um guia para diferenciar e polarizar células semelhantes a monócitos THP-1 em macrófagos semelhantes a M2 dentro de 14 dias. Atualmente não existe um modelo estabelecido para a polarização anti-inflamatória do THP-1.Este protocolo utiliza períodos de descanso adequados e um processo de polarização prolongado para criar um subtipo de macrófago distinto semelhante ao M2. O desenvolvimento tumoral, por exemplo, no câncer de cólon e na remodelação de tecidos, são controlados por macrófagos anti-inflamatórios. Entre os estudos que investigam sua função, a criação padronizada de um subtipo distinto semelhante ao M2 garante achados reprodutíveis.Comece definindo um temporizador por 150 segundos. Remova o frasco congelado contendo a linha celular THP-1 do nitrogênio líquido e descongele o frasco imediatamente a 37 graus Celsius em um banho de água limpa, iniciando o temporizador assim que o frasco for colocado no banho de água. Solte a tampa para liberar a pressão acumulada devido ao processo de descongelamento, garantindo que a abertura do tubo não entre em contato com a água para evitar contaminação.Descongele a suspensão da célula até que um chip de gelo de cerca de quatro milímetros de tamanho seja deixado dentro do frasco e prossiga para o próximo passo imediatamente. Transfira a fase líquida da suspensão celular para um tubo de 15 mililitros contendo nove mililitros de mídia de crescimento quente. Em seguida, transfira um mililitro desta suspensão celular média quente para o frasco THP-1 e volte para o tubo de 15 mililitros para derreter o chip de gelo restante, e lave o frasco para garantir que nenhuma célula seja deixada para trás.Misture a suspensão suavemente, escoando-a para cima e para baixo com uma pipeta de um mililitro. Remova aproximadamente 10 microliters da amostra para contar as células para viabilidade usando o azul trypan. As células com citoplasma claro são viáveis, um citoplasma azul indica morte celular.Enquanto estiver contando, gire a suspensão da célula quente a 200 vezes G por sete minutos a 37 graus Celsius. Remova o supernatante completamente e resuspende as células em meio de crescimento para alcançar uma densidade celular de 500.000 células por mililitro. Misture a suspensão suavemente e transfira 22 mililitros em frascos de cultura celular T75 cada um.Armazene os frascos em pé em uma incubadora a 37 graus Celsius com uma concentração de dióxido de carbono de 5% e troque a mídia de crescimento a cada três ou quatro dias. Prepare a suspensão celular para semear as células a uma densidade de 300.000 por mililitro por poço em placas de cultura celular de 24 poços. Misture o meio suavemente e uma alíquota de 26 mililitros em tubos de 50 mililitros.Transfira um mililitro do meio contendo células em cada poço de uma placa de 24 poços. Misture a mídia suavemente, encalhando-a para cima e para baixo entre as transferências. Mantenha a solução de trabalho recém-preparada de PMA no gelo e adicione 100 nanogramas de PMA por poço.Incubar as placas na incubadora sem qualquer tratamento adicional por 72 horas. Após 72 horas, retire o meio de crescimento e substitua-o por um mililitro de meio de crescimento fresco, garantindo não tocar na parte inferior dos poços com pontas de pipeta. Deixe as células descansarem por mais 96 horas na incubadora.Remova o meio de crescimento e substitua-o por um mililitro de meio de crescimento fresco. Adicione 20 nanogramas de interleucina 4 e 20 nanogramas de interleucina 13 por poço. Em seguida, deixe as células descansarem por 48 horas na incubadora.Repita todo o processo após 48 horas e deixe as células descansarem por mais 48 horas na incubadora. Remova o meio de crescimento e substitua-o por um mililitro de meio de crescimento fresco. Em seguida, deixe as células descansarem por 48 horas na incubadora.Remova o meio celular quente de cada poço e substitua-o por uma mistura de um mililitro de PBS gelado sem cálcio e magnésio e 5%FBS. Em seguida, coloque imediatamente a placa de célula no gelo por 45 minutos. Depois de 45 minutos no gelo, raspe as células usando mini raspadores de células.Transfira suavemente os macrófagos separados para PBS frio e 5% FBS em um tubo de 15 mililitros mantidos no gelo. Os macrófagos derivados do método de polarização mostram a expressão do CD14, bem como marcadores CD11b. Os marcadores monócito e macrófago CD14 e CD11b foram expressos em 70,9% e 74,7% das células, respectivamente.As células apresentaram baixos níveis de superfície do marcador M1 CD80 em 0,2% das células, e altos níveis de superfície do marcador M2-like CD206 em 62,6% das células. Como as células THP-1 em média tendem a afundar-se ao fundo de um frasco e são fáceis de ativar através de estresse mecânico, a mistura suave e o manuseio das células é importante. Macrófagos semelhantes a M2 são criados de forma reprodutivelmente, e foram caracterizados usando QR-TPCR, ELISA e citometria de fluxo.Esta é a base para investigar mecanismos anti-inflamatórios no desenvolvimento do câncer ou remodelação de tecidos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Um parasita Ensaio de Resgate e Transformação de Triagem leishmanicida contra intracelular<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotas em THP1 linha celular humana aguda Monocytic Leucemia

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Imunologia e Infecção

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

Investigação de polarização de macrófagos Usando medula macrófagos derivados

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar a heterogeneidade de diferenciação de macrófagos humanos e Polarização

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Estabelecimento de um<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema para estudar o comportamento intracelular de<em&gt; Candida glabrata</em&gt; Em humanos THP-1 macrófagos

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Avaliando a inata Sensing de HIV-1 CD4 Infected<sup&gt; +</sup&gt; As células T por células dendríticas plasmocitóides Usando um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura do sistema.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

A transfecção altamente eficiente de THP-1 por macrófagos humanos Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Rato Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento de células T e<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciação em subpopulações de células T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualizando o macrófago armadilhas extracelular usando microscopia Confocal

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Um protocolo de aspiração da bolha para estudar células T humanas Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis

Um estudo de Immunohistopathologic de perfil o folato receptores Beta macrófago e Vascular microambiente imune na arterite de células gigantes

Giant cell arteritis (GCA) is a chronic immune-mediated disease of medium-to-large sized arteries that affects older adults. GCA manifests with arthritis ...