Name: macrophage differentiation and polarization into an m2-like phenotype using a human monocyte-like thp-1 leukemia cell line
Uploaded: 2021-08-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Macrophage Differentiation and Polarization into an M2-Like Phenotype using a Human Monocyte-Like THP-1 Leukemia Cell Line at JoVE.com

El Instituto Price de Investigación Quirúrgica de la Universidad de Louisville, cuenta con el apoyo financiero de John W. Price y Barbara Thruston Atwood Price Trust. Las fuentes de financiación no tuvieron ningún papel en el diseño y la realización del estudio, así como en la recopilación, gestión, análisis e interpretación de los datos.

Nota : una descripción general de los pasos descritos en este protocolo se muestra en la figura 1. Se compró la línea celular de leucemia similar a monocitos humanos THP-1. Se realizó un breve análisis de repetición en tándem para autenticar la línea celular THP-1. Realice todos los pasos en condiciones estériles. La línea celular monocítica THP-1 crece en suspensión y no se adhiere a las superficies de cultivo celular. La adherencia se puede inducir diferenciando los monocitos e...

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	<li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts+enhance+tumor-associated+macrophages+enrichment+and+suppress+NK+cells+function+in+colorectal+cancer.">Cancer-associated fibroblasts enhance tumor-associated macrophages enrichment and suppress NK cells function in colorectal cancer.</a> Cell Death and Disease. 10 (4), 273 (2019).</li><li>Wang, J., Li, D., Cang, H., Guo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+cancer+and+immune+cells:+Role+of+tumor-associated+macrophages+in+the+tumor+microenvironment.">Crosstalk between cancer and immune cells: Role of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment.</a> Cancer Medicine. 8 (10), 4709-4721 (2019).</li><li>Soncin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+creates+a+niche+for+the+self-renewal+of+tumor-promoting+macrophages+in+colon+adenoma.">The tumor microenvironment creates a niche for the self-renewal of tumor-promoting macrophages in colon adenoma.</a> Nature Communications. 9 (1), 582 (2018).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).</li><li>Mazzone, M., Menga, A., Castegna, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+TAM+functions-it+takes+two+to+tango.">Metabolism and TAM functions-it takes two to tango.</a> Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (4), 700-716 (2018).</li><li>Eum, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-promoting+macrophages+prevail+in+malignant+ascites+of+advanced+gastric+cancer.">Tumor-promoting macrophages prevail in malignant ascites of advanced gastric cancer.</a> Experimental and Molecular Medicine. 52 (12), 1976-1988 (2020).</li><li>Qian, B. Z., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+diversity+enhances+tumor+progression+and+metastasis.">Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis.</a> Cell. 141 (1), 39-51 (2010).</li><li>Scheurlen, K. M., Billeter, A. T., O'Brien, S. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+protocols+for+differentiation+of+THP-1+cells+to+macrophages+with+distinct+M(IFNgamma+LPS),+M(IL-4),+and+M(IL-10)+phenotypes.">Standardized protocols for differentiation of THP-1 cells to macrophages with distinct M(IFNgamma+LPS), M(IL-4), and M(IL-10) phenotypes.</a> Journal of Immunological Methods. 478, 112721 (2020).</li><li>Genin, M., Clement, F., Fattaccioli, A., Raes, M., Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M1+and+M2+macrophages+derived+from+THP-1+cells+differentially+modulate+the+response+of+cancer+cells+to+etoposide.">M1 and M2 macrophages derived from THP-1 cells differentially modulate the response of cancer cells to etoposide.</a> BMC Cancer. 15, 577 (2015).</li><li>Starr, T., Bauler, T. J., Malik-Kale, P., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phorbol+12-myristate-13-acetate+differentiation+protocol+is+critical+to+the+interaction+of+THP-1+macrophages+with+Salmonella+Typhimurium.">The phorbol 12-myristate-13-acetate differentiation protocol is critical to the interaction of THP-1 macrophages with Salmonella Typhimurium.</a> PLoS One. 13 (3), 0193601 (2018).</li><li>Lund, M. E., To, J., O'Brien, B. A., Donnelly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choice+of+phorbol+12-myristate+13-acetate+differentiation+protocol+influences+the+response+of+THP-1+macrophages+to+a+pro-inflammatory+stimulus.">The choice of phorbol 12-myristate 13-acetate differentiation protocol influences the response of THP-1 macrophages to a pro-inflammatory stimulus.</a> Journal of Immunological Methods. 430, 64-70 (2016).</li><li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-6/STAT3+pathway+intermediates+M1/M2+macrophage+polarization+during+the+development+of+hepatocellular+carcinoma.">IL-6/STAT3 pathway intermediates M1/M2 macrophage polarization during the development of hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 119 (11), 9419-9432 (2018).</li><li>O'Neill, L. A. J., Artyomov, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Itaconate:+the+poster+child+of+metabolic+reprogramming+in+macrophage+function.">Itaconate: the poster child of metabolic reprogramming in macrophage function.</a> Nature Reviews Immunology. 19 (5), 273-281 (2019).</li><li>Luig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-induced+IL-6+functions+as+a+natural+brake+on+macrophages+and+limits+gn.">Inflammation-induced IL-6 functions as a natural brake on macrophages and limits gn.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1597-1607 (2015).</li><li>Maruyama, K., Nemoto, E., Yamada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+macrophage+function+-+cyclic+tensile+force+inhibits+NLRP3+inflammasome-dependent+IL-1beta+secretion+in+murine+macrophages.">Mechanical regulation of macrophage function - cyclic tensile force inhibits NLRP3 inflammasome-dependent IL-1beta secretion in murine macrophages.</a> Inflammation and Regeneration. 39, 3 (2019).</li><li>Gatto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PMA-Induced+THP-1+Macrophage+Differentiation+is+Not+Impaired+by+Citrate-Coated+Platinum+Nanoparticles.">PMA-Induced THP-1 Macrophage Differentiation is Not Impaired by Citrate-Coated Platinum Nanoparticles.</a> Nanomaterials (Basel). 7 (10), (2017).</li><li>Maess, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+PMA+enhances+the+responsiveness+of+transfected+THP-1+macrophages+to+polarizing+stimuli.">Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli.</a> Journal of Immunological Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).</li><li>Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+PMA-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages.">The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).</li><li>Raggi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+human+macrophage+M1-M2+polarization+balance+by+hypoxia+and+the+triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-1.">Regulation of human macrophage M1-M2 polarization balance by hypoxia and the triggering receptor expressed on myeloid cells-1.</a> Frontiers in Immunology. 8, 11097 (2017).</li><li>Neutelings, T., Lambert, C. A., Nusgens, B. V., Colige, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mild+cold+shock+(25+degrees+C)+followed+by+warming+up+at+37+degrees+C+on+the+cellular+stress+response.">Effects of mild cold shock (25 degrees C) followed by warming up at 37 degrees C on the cellular stress response.</a> PLoS One. 8 (7), 69687 (2013).</li><li>Kurashina, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-free+release+of+adhered+cells+from+standard+culture+dishes+using+intermittent+ultrasonic+traveling+waves.">Enzyme-free release of adhered cells from standard culture dishes using intermittent ultrasonic traveling waves.</a> Communications Biology. 2, 393 (2019).</li><li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function.">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).</li><li>Bailey, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+murine+bone+marrow-derived+macrophages+for+nitric+oxide+and+redox+biology.">Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology.</a> Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).</li></ol>

Este protocolo sobre la diferenciación y polarización de células similares a monocitos THP-1 en 14 días proporciona un método para obtener macrófagos con un fenotipo distinto similar a M2 debido a la incubación de células de tratamiento prolongado con períodos de descanso adecuados entre pasos.
Ciertos pasos son críticos para este protocolo. El tiempo de duplicación de los monocitos THP-1 es de aproximadamente 26 h. Las células se pueden dividir a una densidad celular de 9 x10...

Los macrófagos asociados a tumores (TAM) y su papel en la inflamación crónica, la aparición del cáncer y el desarrollo de tumores son objetivos importantes en investigaciones recientes1,2. Los monocitos de sangre periférica que se reclutan en el microambiente tisular del tumor en desarrollo se diferencian en macrófagos y pueden polarizarse en dos subtipos principales de macrófagos3. El macrófago activado clásicamente representa el fenotipo M1 principalmente proinflamatorio y el subtipo similar a M2 activado alternativamente muestra características predominantemente antiinflamatorias4. Los macrófagos pueden cambiar dinámicamente entre estos dos fenotipos principales dependiendo de su metabolismo celular, con subtipos intermedios que tienen atributos inflamatorios y antiinflamatorios5. TAM representa una población heterogénea de ambos fenotipos. Sin embargo, una función promotora de tumores y un mal pronóstico en diferentes tipos de cáncer se asocian particularmente con macrófagos similares a M26,7,8.
Los perfiles funcionales de los macrófagos y su interacción con otras células dentro del microambiente tumoral son complejos y difíciles de capturar en un entorno en constante cambio durante el desarrollo continuo del tumor. Las líneas celulares pueden proporcionar una población celular homogénea con viabilidad estable en cultivo, lo que puede facilitar el proceso de demostración de mecanismos celulares e intercelulares definidos. La línea celular THP-1 similar a un monocitos es un sistema modelo legítimo para monocitos humanos primarios9. Esta línea celular inmortalizada espontáneamente se ha obtenido de la sangre periférica de un lactante de un año con leucemia monocítica aguda9,10. La diferenciación y polarización de las células THP-1 han sido reportadas por varios estudios y se han realizado de múltiples maneras diferentes11,12,13,14. La activación y, por tanto, la polarización de los macrófagos en un fenotipo tipo M1 es seguida por un mecanismo de rebote antiinflamatorio compensatorio, promoviendo un fenotipo tipo M2 a través de citoquinas producidas por macrófagos inflamatorios, como la interleucina 6 (IL-6) o el itaconato15,16. Esto podría servir como un mecanismo de ruptura para atenuar una respuesta inflamatoria excesiva después de la activación celular17. El proceso de diferenciar y polarizar monocitos y células similares a monocitos THP-1 en un fenotipo antiinflamatorio similar a M2 también se acompaña de estímulos proinflamatorios que deben superarse. Una respuesta inflamatoria de citoquinas puede ser causada por estrés mecánico18,como cambiar los medios para realimentar las células, o agregar compuestos químicos para diferenciar las células THP-1, como forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), e inducir la producción de factor de necrosis tumoral α (TNFα), interleucina 1β (IL-1β) o IL-619. Este perfil alterado de expresión de citoquinas como respuesta a la PMA puede afectar y prevenir la polarización posterior de los macrófagos20. Los períodos de descanso adecuados, como se informó antes después del tratamiento con PMA, permiten que estas respuestas inflamatorias disminuyan y faciliten la polarización celular en un fenotipo 21 distinto similar aM2.
Este protocolo demuestra un método para diferenciar y polarizar las células similares a los monocitos THP-1 en un fenotipo de macrófagos similar a M2 en un plazo de 14 días.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% trypan blue</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>152-5061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, USA</td>
			<td>1615-5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>&#160;89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L TipOne pipet tips</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, USA</td>
			<td>1111-2821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL&#160; Centrifuge tube</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>89039-664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L TipOne pipet tips</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, USA</td>
			<td>1120-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L TipOne pipet tips</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, USA</td>
			<td>1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipet</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>&#160;89130-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipet</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>&#160;89130-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tube</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>89039-662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase solution 500 mL</td>
			<td>Sigma, St. Louis, USA</td>
			<td>A6964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized</td>
			<td>Sigma, St. Louis, USA</td>
			<td>A5955-100 mL</td>
			<td>with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 &#956;g of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binder CO2 Incubator</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>C170-ULE3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoOne T-75cm flask with filter cap</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, USA</td>
			<td>CC7682-4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma, St. Louis, USA</td>
			<td>D8537-500 mL</td>
			<td>PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated)</td>
			<td>Eppendorf, Enfield, USA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol (70%)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCalibur flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences, San Diego, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 24-well plate</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ATCC, Manassas, USA</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse Anti-Human CD14</td>
			<td>BD Biosciences, San Diego, USA</td>
			<td>555397</td>
			<td>Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse Anti-Human CD80</td>
			<td>BD Pharmingen, San Diego, USA</td>
			<td>557226</td>
			<td>Flow cytometry, M1 marker (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1 &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Pharmingen, San Diego, USA</td>
			<td>555748</td>
			<td>Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG2a, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences, San Diego, USA</td>
			<td>553456</td>
			<td>Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BD Fc Block</td>
			<td>BD Biosciences, San Diego, USA</td>
			<td>564220</td>
			<td>Flow cytometry, Fc block (0.25 mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human interleukin 13 (IL-13)</td>
			<td>R&#38;D, Minneapolis, USA</td>
			<td>IL-771-10 &#956;g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human interleukin 4 (IL-4)</td>
			<td>R&#38;D, Minneapolis, USA</td>
			<td>SRP3093-20 &#956;g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213)</td>
			<td>Labconco, Kansas City, USA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine Solution, 200 mM</td>
			<td>ATCC, Manassas, USA</td>
			<td>30-2214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4</td>
			<td>Sigma, St. Louis, USA</td>
			<td>L2630-100 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Cell Scrapers</td>
			<td>Biotium, Fremont, USA</td>
			<td>22003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>02-671-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse inverted microscope TS100</td>
			<td>Nikon, Melville, USA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, USA</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Light Microscope RH-2</td>
			<td>Microscope Central, Feasterville, USA</td>
			<td>40888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 variable pipet- Gilson</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>76180-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 variable pipet-Gilson</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>76177-990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 variable pipet- Gilson</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>76177-988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD11b</td>
			<td>BD Biosciences, San Diego, USA</td>
			<td>555388</td>
			<td>Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences, San Diego, USA</td>
			<td>555749</td>
			<td>Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206</td>
			<td>BD Pharmingen, San Diego, USA</td>
			<td>551136</td>
			<td>Flow cytometry, M2 marker (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy 5 Mouse IgG1 &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Pharmingen, San Diego, USA</td>
			<td>555750</td>
			<td>Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma, St. Louis, USA</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerpette Plus pipettor</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>75856-448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Water bath (model 183)</td>
			<td>Precision Scientific, Chicago, USA</td>
			<td>66551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>ATCC, Manassas, USA</td>
			<td>30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>ATCC, Manassas, USA</td>
			<td>TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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macrophage differentiation and polarization into an m2-like phenotype using a human monocyte-like thp-1 leukemia cell line

Los macrófagos asociados a tumores (TAM) pueden cambiar su expresión y perfil de citoquinas de acuerdo con los estímulos externos. Esta notable plasticidad permite a TAM adaptarse a los cambios en curso dentro del microambiente tumoral. Los macrófagos pueden tener principalmente atributos proinflamatorios (similares a M1) o antiinflamatorios (similares a M2) y pueden cambiar continuamente entre estos dos estados principales. Los macrófagos similares a M2 dentro del entorno tumoral se asocian con la progresión del cáncer y el mal pronóstico en varios tipos de cáncer. Se utilizan muchos métodos diferentes para inducir la diferenciación y polarización de las células THP-1 para investigar los mecanismos celulares e intercelulares y los efectos de TAM dentro del microambiente de los tumores. Actualmente, no existe un modelo establecido para la polarización de macrófagos similares a M2 utilizando la línea celular THP-1, y los resultados de la expresión y los perfiles de citoquinas de los macrófagos debido a ciertos estímulos in vitro varían entre los estudios. Este protocolo sirve como guía detallada para diferenciar las células similares a los monocitos THP-1 en macrófagos M0 y para polarizar aún más las células en un fenotipo similar a M2 dentro de los 14 días. Demostramos los cambios morfológicos de células similares a monocitos THP-1, macrófagos diferenciados y macrófagos polarizados similares a M2 utilizando microscopía de luz. Este modelo es la base para los modelos de línea celular que investigan los efectos antiinflamatorios de TAM y sus interacciones con otras poblaciones celulares del microambiente tumoral.

Se caracterizaron macrófagos similares a M2 y se validó la polarización M2 mediante citometría de flujo para marcadores de grupo de diferenciación (CD) CD14, CD11b, CD80 (marcador similar a M1) y CD206 (marcador similar a M2). La tinción por citometría de flujo se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los macrófagos se lavaron con PBS/5% FBS y se incubaron con el bloqueo del receptor Fcγ para evitar la unión inespecífica. Las células se tiñeron con anticuerpos CD14 y CD80 antihumanos conj...

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Macrophage Differentiation and Polarization into an M2-Like Phenotype using a Human Monocyte-Like THP-1 Leukemia Cell Line

Los macrófagos asociados a tumores (TAM) similares a M2 se asocian con progresión tumoral y mal pronóstico en el cáncer. Este protocolo sirve como una guía detallada para diferenciar y polarizar de manera reproducible las células similares a los monocitos THP-1 en macrófagos similares a M2 en un plazo de 14 días. Este modelo es la base para investigar los efectos antiinflamatorios de la TAM dentro del microambiente tumoral.

Diferenciación y polarización de macrófagos en un fenotipo similar a M2 utilizando una línea celular de leucemia THP-1 similar a monocitos humanos

Tumor-associated macrophages (TAM) can switch their expression and cytokine profile according to external stimuli. This remarkable plasticity enables TAM ...

Los macrófagos asociados a tumores antiinflamatorios están relacionados con la progresión y el mal pronóstico del cáncer. Este protocolo es una guía para diferenciar y polarizar las células similares a los monocitos THP-1 en macrófagos similares a M2 en un plazo de 14 días. Actualmente no existe un modelo establecido para la polarización antiinflamatoria de THP-1.Este protocolo utiliza períodos de descanso adecuados y un proceso de polarización prolongado para crear un subtipo de macrófagos distinto similar a M2. El desarrollo de tumores, por ejemplo, en el cáncer de colon y la remodelación de tejidos, están controlados por macrófagos antiinflamatorios. Entre los estudios que investigan su función, la creación estandarizada de un subtipo distinto similar a M2 garantiza hallazgos reproducibles.Comience configurando un temporizador durante 150 segundos. Retire el vial congelado que contiene la línea celular THP-1 del nitrógeno líquido y descongele el vial inmediatamente a 37 grados centígrados en un baño de agua limpia, iniciando el temporizador tan pronto como el vial se coloque en el baño de agua. Afloje la tapa para liberar la presión acumulada debido al proceso de descongelación, asegurando que la abertura del tubo no entre en contacto con el agua para evitar la contaminación.Descongele la suspensión celular hasta que quede una viruta de hielo de unos cuatro milímetros de tamaño dentro del vial y proceda al siguiente paso inmediatamente. Transfiera la fase líquida de la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros que contenga nueve mililitros de medios de crecimiento calientes. Luego transfiera un mililitro de esta suspensión de células medianas calientes al vial de THP-1 y regrese al tubo de 15 mililitros para derretir la viruta de hielo restante, y enjuague el vial para asegurarse de que no queden células.Mezcle la suspensión suavemente pipeteándola hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de un mililitro. Retire aproximadamente 10 microlitros de la muestra para contar las células para la viabilidad usando azul tripano. Las células con citoplasma claro son viables, un citoplasma azul indica la muerte celular.Mientras cuenta, gire hacia abajo la suspensión de células calientes a 200 veces G durante siete minutos a 37 grados centígrados. Retire el sobrenadante por completo y resuspónda las células en medio de crecimiento para lograr una densidad celular de 500, 000 células por mililitro. Mezcle la suspensión suavemente y transfiera 22 mililitros en matraces de cultivo celular T75 cada uno.Almacene los matraces en posición vertical en una incubadora a 37 grados centígrados con una concentración de dióxido de carbono del 5% e intercambie los medios de crecimiento cada tres o cuatro días. Prepare la suspensión celular para sembrar las células a una densidad de 300, 000 por mililitro por pozo en placas de cultivo celular de 24 pozos. Mezclar el medio suavemente y preparar alícuotas de 26 mililitros en tubos de 50 mililitros.Transfiera un mililitro del medio que contiene la célula a cada pozo de una placa de 24 pozos. Mezcle el medio suavemente canaleándolo hacia arriba y hacia abajo entre transferencias. Mantenga la solución de trabajo recién preparada de PMA en hielo y agregue 100 nanogramos de PMA por pozo.Incubar las placas en la incubadora sin ningún tratamiento adicional durante 72 horas. Después de 72 horas, retire el medio de crecimiento y reemplácelo con un mililitro de medio de crecimiento fresco, asegurándose de no tocar el fondo de los pozos con puntas de pipeta. Deje que las células descansen durante otras 96 horas en la incubadora.Retire el medio de crecimiento y reemplácelo con un mililitro de medio de crecimiento fresco. Agregue 20 nanogramos de interleucina 4 y 20 nanogramos de interleucina 13 por pozo. Luego deje que las células descansen durante 48 horas en la incubadora.Repita todo el proceso después de 48 horas y deje que las células descansen durante otras 48 horas en la incubadora. Retire el medio de crecimiento y reemplácelo con un mililitro de medio de crecimiento fresco. Luego deje que las células descansen durante 48 horas en la incubadora.Retire el medio de células calientes de cada pozo y reemplácelo con una mezcla de un mililitro de PBS helado sin calcio y magnesio y 5% FBS. Luego, coloque inmediatamente la placa celular sobre hielo durante 45 minutos. Después de 45 minutos en hielo, raspe las células usando mini raspadores de células.Transfiera suavemente los macrófagos desprendidos a PBS frío y 5% FBS en un tubo de 15 mililitros mantenido en hielo. Los macrófagos derivados del método de polarización muestran la expresión de CD14, así como los marcadores CD11b. Los marcadores de monocitos y macrófagos CD14 y CD11b se expresaron en el 70,9% y 74,7% de las células, respectivamente.Las células mostraron bajos niveles superficiales del marcador similar a M1 CD80 en el 0,2% de las células, y altos niveles de superficie del marcador similar a M2 CD206 en el 62,6% de las células. Como las células THP-1 en medio tienden a hundirse en el fondo de un vial y son fáciles de activar a través del estrés mecánico, es importante mezclar y manipular suavemente las células. Los macrófagos similares a M2 se crean de manera reproducible y se han caracterizado utilizando QR-TPCR, ELISA y citometría de flujo.Esta es la base para investigar los mecanismos antiinflamatorios en el desarrollo del cáncer o la remodelación de tejidos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescate y Transformación de ensayo para la detección antileishmanial contra intracelular<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotes en THP1 Humanos aguda línea celular de leucemia monocítica

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Investigación

Inmunología e Infección

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

Investigación de la polarización de macrófagos utilizando la médula ósea macrófagos derivados

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudiar la heterogeneidad de diferenciación de los macrófagos humanos y polarización

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establecimiento de un<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema para estudiar el comportamiento intracelular de<em&gt; Candida glabrata</em&gt; En humanos THP-1 macrófagos

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

La evaluación de la innata de detección de VIH-1 CD4 infectados<sup&gt; +</sup&gt; Células T por las células dendríticas plasmocitoides Usando un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura del sistema.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

La transfección altamente eficiente de humanos THP-1 macrófagos por Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Ratón Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Aislamiento de células T y<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciación en subconjuntos de células T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualización de macrófagos trampas extracelular mediante Microscopía Confocal

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Un protocolo de aspiración de la ampolla para estudiar células de T humanas recordar respuestas en Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis

Un estudio de Immunohistopathologic a perfil el folato del Receptor Beta macrófago y microambiente inmunológico Vascular en Arteritis de células gigantes

Giant cell arteritis (GCA) is a chronic immune-mediated disease of medium-to-large sized arteries that affects older adults. GCA manifests with arthritis ...