Name: macrophage differentiation and polarization into an m2-like phenotype using a human monocyte-like thp-1 leukemia cell line
Uploaded: 2021-08-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Macrophage Differentiation and Polarization into an M2-Like Phenotype using a Human Monocyte-Like THP-1 Leukemia Cell Line at JoVE.com

Price Institute of Surgical Research, University of Louisville, stöds ekonomiskt av John W. Price och Barbara Thruston Atwood Price Trust. Finansieringskällorna hade ingen roll i studiens utformning och genomförande samt i insamling, förvaltning, analys och tolkning av uppgifterna.

En översikt över de steg som beskrivs i det här protokollet visas i figur 1. Den mänskliga monocytliknande leukemi cellinjen THP-1 köptes. Kort tandem upprepa analys utfördes för att autentisera THP-1 cellinjen. Utför alla steg under sterila förhållanden. Den monocytiska cellinjen THP-1 växer i suspension och fästs inte på cellodlingsytor. Vidhäftning kan induceras genom att differentiera monocyter till makrofagliknande celler genom t.ex. mekanisk stress eller specifik behandli...

<ol>
	<li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts+enhance+tumor-associated+macrophages+enrichment+and+suppress+NK+cells+function+in+colorectal+cancer.">Cancer-associated fibroblasts enhance tumor-associated macrophages enrichment and suppress NK cells function in colorectal cancer.</a> Cell Death and Disease. 10 (4), 273 (2019).</li><li>Wang, J., Li, D., Cang, H., Guo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+cancer+and+immune+cells:+Role+of+tumor-associated+macrophages+in+the+tumor+microenvironment.">Crosstalk between cancer and immune cells: Role of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment.</a> Cancer Medicine. 8 (10), 4709-4721 (2019).</li><li>Soncin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+creates+a+niche+for+the+self-renewal+of+tumor-promoting+macrophages+in+colon+adenoma.">The tumor microenvironment creates a niche for the self-renewal of tumor-promoting macrophages in colon adenoma.</a> Nature Communications. 9 (1), 582 (2018).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).</li><li>Mazzone, M., Menga, A., Castegna, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+TAM+functions-it+takes+two+to+tango.">Metabolism and TAM functions-it takes two to tango.</a> Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (4), 700-716 (2018).</li><li>Eum, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-promoting+macrophages+prevail+in+malignant+ascites+of+advanced+gastric+cancer.">Tumor-promoting macrophages prevail in malignant ascites of advanced gastric cancer.</a> Experimental and Molecular Medicine. 52 (12), 1976-1988 (2020).</li><li>Qian, B. Z., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+diversity+enhances+tumor+progression+and+metastasis.">Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis.</a> Cell. 141 (1), 39-51 (2010).</li><li>Scheurlen, K. M., Billeter, A. T., O'Brien, S. J., Galandiuk, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+dysfunction+and+early-onset+colorectal+cancer+-+how+macrophages+build+the+bridge.">Metabolic dysfunction and early-onset colorectal cancer - how macrophages build the bridge.</a> Cancer Medicine. 9 (18), 6679-6693 (2020).</li><li>Bosshart, H., Heinzelmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THP-1+cells+as+a+model+for+human+monocytes.">THP-1 cells as a model for human monocytes.</a> Annals of Translational Medicine. 4 (21), 438 (2016).</li><li>. The American Type Culture Collection (ATCC) Available from: <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx#generalinformation">https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx#generalinformation</a> (2021)</li><li>Baxter, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+protocols+for+differentiation+of+THP-1+cells+to+macrophages+with+distinct+M(IFNgamma+LPS),+M(IL-4),+and+M(IL-10)+phenotypes.">Standardized protocols for differentiation of THP-1 cells to macrophages with distinct M(IFNgamma+LPS), M(IL-4), and M(IL-10) phenotypes.</a> Journal of Immunological Methods. 478, 112721 (2020).</li><li>Genin, M., Clement, F., Fattaccioli, A., Raes, M., Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M1+and+M2+macrophages+derived+from+THP-1+cells+differentially+modulate+the+response+of+cancer+cells+to+etoposide.">M1 and M2 macrophages derived from THP-1 cells differentially modulate the response of cancer cells to etoposide.</a> BMC Cancer. 15, 577 (2015).</li><li>Starr, T., Bauler, T. J., Malik-Kale, P., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phorbol+12-myristate-13-acetate+differentiation+protocol+is+critical+to+the+interaction+of+THP-1+macrophages+with+Salmonella+Typhimurium.">The phorbol 12-myristate-13-acetate differentiation protocol is critical to the interaction of THP-1 macrophages with Salmonella Typhimurium.</a> PLoS One. 13 (3), 0193601 (2018).</li><li>Lund, M. E., To, J., O'Brien, B. A., Donnelly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choice+of+phorbol+12-myristate+13-acetate+differentiation+protocol+influences+the+response+of+THP-1+macrophages+to+a+pro-inflammatory+stimulus.">The choice of phorbol 12-myristate 13-acetate differentiation protocol influences the response of THP-1 macrophages to a pro-inflammatory stimulus.</a> Journal of Immunological Methods. 430, 64-70 (2016).</li><li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-6/STAT3+pathway+intermediates+M1/M2+macrophage+polarization+during+the+development+of+hepatocellular+carcinoma.">IL-6/STAT3 pathway intermediates M1/M2 macrophage polarization during the development of hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 119 (11), 9419-9432 (2018).</li><li>O'Neill, L. A. J., Artyomov, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Itaconate:+the+poster+child+of+metabolic+reprogramming+in+macrophage+function.">Itaconate: the poster child of metabolic reprogramming in macrophage function.</a> Nature Reviews Immunology. 19 (5), 273-281 (2019).</li><li>Luig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-induced+IL-6+functions+as+a+natural+brake+on+macrophages+and+limits+gn.">Inflammation-induced IL-6 functions as a natural brake on macrophages and limits gn.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1597-1607 (2015).</li><li>Maruyama, K., Nemoto, E., Yamada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+macrophage+function+-+cyclic+tensile+force+inhibits+NLRP3+inflammasome-dependent+IL-1beta+secretion+in+murine+macrophages.">Mechanical regulation of macrophage function - cyclic tensile force inhibits NLRP3 inflammasome-dependent IL-1beta secretion in murine macrophages.</a> Inflammation and Regeneration. 39, 3 (2019).</li><li>Gatto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PMA-Induced+THP-1+Macrophage+Differentiation+is+Not+Impaired+by+Citrate-Coated+Platinum+Nanoparticles.">PMA-Induced THP-1 Macrophage Differentiation is Not Impaired by Citrate-Coated Platinum Nanoparticles.</a> Nanomaterials (Basel). 7 (10), (2017).</li><li>Maess, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+PMA+enhances+the+responsiveness+of+transfected+THP-1+macrophages+to+polarizing+stimuli.">Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli.</a> Journal of Immunological Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).</li><li>Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+PMA-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages.">The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).</li><li>Raggi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+human+macrophage+M1-M2+polarization+balance+by+hypoxia+and+the+triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-1.">Regulation of human macrophage M1-M2 polarization balance by hypoxia and the triggering receptor expressed on myeloid cells-1.</a> Frontiers in Immunology. 8, 11097 (2017).</li><li>Neutelings, T., Lambert, C. A., Nusgens, B. V., Colige, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mild+cold+shock+(25+degrees+C)+followed+by+warming+up+at+37+degrees+C+on+the+cellular+stress+response.">Effects of mild cold shock (25 degrees C) followed by warming up at 37 degrees C on the cellular stress response.</a> PLoS One. 8 (7), 69687 (2013).</li><li>Kurashina, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-free+release+of+adhered+cells+from+standard+culture+dishes+using+intermittent+ultrasonic+traveling+waves.">Enzyme-free release of adhered cells from standard culture dishes using intermittent ultrasonic traveling waves.</a> Communications Biology. 2, 393 (2019).</li><li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function.">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).</li><li>Bailey, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+murine+bone+marrow-derived+macrophages+for+nitric+oxide+and+redox+biology.">Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology.</a> Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).</li></ol>

Detta protokoll om differentiering och polariserande THP-1 monocyt-liknande celler inom 14 dagar ger en metod för att erhålla makrofager med en distinkt M2-liknande fenotyp på grund av lång behandling inkubation av celler med tillräckliga viloperioder mellan steg.
Vissa steg är viktiga för det här protokollet. Fördubblingstiden för THP-1 monocyter är cirka 26 timmar. Cellerna kan delas med en celltäthet på 9 x 105/ml och ska sås med en densitet på 3 x 105/m...

Tumör-associerade makrofager (TAM) och deras roll i kronisk inflammation, uppkomsten av cancer och tumörutveckling är viktiga mål i ny forskning1,2. Perifera blod monocyter som rekryteras till vävnad mikromiljön av den utvecklande tumör skilja sig åt i makrofager och kan polariseras till två huvudsakliga subtyper av makrofager3. Den klassiskt aktiverade makrofaget representerar den främst proinflammatoriska M1-liknande fenotypen och den alternativt aktiverade M2-liknande subtypen visar övervägande antiinflammatoriska egenskaper4. Makrofager kan växla dynamiskt mellan dessa två huvudsakliga fenotyper beroende på deras cellulära metabolism, med mellanliggande subtyper som har både inflammatoriska och antiinflammatoriska attribut5. TAM representerar en heterogen population av båda fenotyperna. En tumörfrämjande funktion och dålig prognos i olika typer av cancer är dock särskilt förknippad med M2-liknande makrofager6,7,8.
De funktionella profilerna för makrofager och deras interaktion med andra celler i tumörmikromiljön är komplexa och utmanande att fånga i en ständigt föränderlig miljö under pågående tumörutveckling. Cellinjer kan ge en homogen cellpopulation stabil livskraft i kulturen, vilket kan underlätta processen att demonstrera definierade cellulära och intercellulära mekanismer. Den monocytliknande THP-1-cellinjen är ett legitimt modellsystem för primära mänskliga monocyter9. Denna spontant odödliga cellinje har erhållits från perifert blod av ett ettårigt spädbarn med akut monocytisk leukemi9,10. Differentiering och polarisering av THP-1 celler har rapporterats av flera studier och har utförts på flera olika sätt11,12,13,14. Aktivering och därmed polarisering av makrofager till en M1-liknande fenotyp följs av en kompensatorisk antiinflammatorisk rebound-mekanism, som främjar en M2-liknande fenotyp genom cytokiner som produceras av inflammatoriska makrofager, såsom interleukin 6 (IL-6) eller itakonat15,16. Detta kan fungera som en brytmekanism för att dämpa ett översnynde inflammatoriskt svar efter cellaktivering17. Processen att differentiera och polarisera monocyter och THP-1 monocytliknande celler till en antiinflammatorisk M2-liknande fenotyp åtföljs också av proinflammatoriska stimuli som måste övervinnas. Ett inflammatoriskt cytokinsvar kan orsakas av mekanisk stress18, såsom att byta media för att mata cellerna, eller lägga till kemiska föreningar för att skilja THP-1-celler, såsom phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA), och inducera produktion av tumörnekrosfaktor α (TNFα), interleukin 1β (IL-1β) eller IL-619. Denna ändrade cytokin uttryck profil som ett svar på PMA kan påverka och förhindra efterföljande makrofag polarisering20. Adekvata viloperioder, som rapporterats före efter PMA behandling, tillåter dessa inflammatoriska svar att minska och underlätta cellpolarisering till en distinkt M2-liknande fenotyp21.
Detta protokoll visar en metod för att differentiera och polarisera THP-1 monocyt-liknande celler i en M2-liknande fenotyp av makrofager inom 14 dagar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% trypan blue</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>152-5061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, USA</td>
			<td>1615-5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>&#160;89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L TipOne pipet tips</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, USA</td>
			<td>1111-2821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL&#160; Centrifuge tube</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>89039-664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L TipOne pipet tips</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, USA</td>
			<td>1120-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L TipOne pipet tips</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, USA</td>
			<td>1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipet</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>&#160;89130-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipet</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>&#160;89130-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tube</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>89039-662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase solution 500 mL</td>
			<td>Sigma, St. Louis, USA</td>
			<td>A6964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized</td>
			<td>Sigma, St. Louis, USA</td>
			<td>A5955-100 mL</td>
			<td>with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 &#956;g of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binder CO2 Incubator</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>C170-ULE3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoOne T-75cm flask with filter cap</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, USA</td>
			<td>CC7682-4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma, St. Louis, USA</td>
			<td>D8537-500 mL</td>
			<td>PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated)</td>
			<td>Eppendorf, Enfield, USA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol (70%)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCalibur flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences, San Diego, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 24-well plate</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ATCC, Manassas, USA</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse Anti-Human CD14</td>
			<td>BD Biosciences, San Diego, USA</td>
			<td>555397</td>
			<td>Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse Anti-Human CD80</td>
			<td>BD Pharmingen, San Diego, USA</td>
			<td>557226</td>
			<td>Flow cytometry, M1 marker (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1 &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Pharmingen, San Diego, USA</td>
			<td>555748</td>
			<td>Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG2a, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences, San Diego, USA</td>
			<td>553456</td>
			<td>Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BD Fc Block</td>
			<td>BD Biosciences, San Diego, USA</td>
			<td>564220</td>
			<td>Flow cytometry, Fc block (0.25 mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human interleukin 13 (IL-13)</td>
			<td>R&#38;D, Minneapolis, USA</td>
			<td>IL-771-10 &#956;g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human interleukin 4 (IL-4)</td>
			<td>R&#38;D, Minneapolis, USA</td>
			<td>SRP3093-20 &#956;g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213)</td>
			<td>Labconco, Kansas City, USA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine Solution, 200 mM</td>
			<td>ATCC, Manassas, USA</td>
			<td>30-2214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4</td>
			<td>Sigma, St. Louis, USA</td>
			<td>L2630-100 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Cell Scrapers</td>
			<td>Biotium, Fremont, USA</td>
			<td>22003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>02-671-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse inverted microscope TS100</td>
			<td>Nikon, Melville, USA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, USA</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Light Microscope RH-2</td>
			<td>Microscope Central, Feasterville, USA</td>
			<td>40888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 variable pipet- Gilson</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>76180-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 variable pipet-Gilson</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>76177-990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 variable pipet- Gilson</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>76177-988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD11b</td>
			<td>BD Biosciences, San Diego, USA</td>
			<td>555388</td>
			<td>Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences, San Diego, USA</td>
			<td>555749</td>
			<td>Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206</td>
			<td>BD Pharmingen, San Diego, USA</td>
			<td>551136</td>
			<td>Flow cytometry, M2 marker (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy 5 Mouse IgG1 &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Pharmingen, San Diego, USA</td>
			<td>555750</td>
			<td>Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma, St. Louis, USA</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerpette Plus pipettor</td>
			<td>VWR, Radnor, USA</td>
			<td>75856-448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Water bath (model 183)</td>
			<td>Precision Scientific, Chicago, USA</td>
			<td>66551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>ATCC, Manassas, USA</td>
			<td>30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>ATCC, Manassas, USA</td>
			<td>TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

macrophage differentiation and polarization into an m2-like phenotype using a human monocyte-like thp-1 leukemia cell line

Tumör-associerade makrofager (TAM) kan byta uttryck och cytokin profil enligt externa stimuli. Denna anmärkningsvärda plasticitet gör det möjligt för TAM att anpassa sig till pågående förändringar inom tumör mikromiljön. Makrofager kan ha antingen främst proinflammatoriska (M1-liknande) eller antiinflammatoriska (M2-liknande) attribut och kan kontinuerligt växla mellan dessa två huvudstater. M2-liknande makrofager i tumörmiljön är förknippade med cancerprogression och dålig prognos i flera typer av cancer. Många olika metoder för att inducera differentiering och polarisering av THP-1 celler används för att undersöka cellulära och intercellulära mekanismer och effekterna av TAM inom mikromiljön av tumörer. För närvarande finns det ingen etablerad modell för M2-liknande makrofagpolarisering med THP-1-cellinjen, och resultaten av uttrycks- och cytokinprofiler av makrofager på grund av vissa in vitro-stimuli varierar mellan studierna. Detta protokoll fungerar som detaljerad vägledning för att skilja THP-1 monocyt-liknande celler till M0 makrofager och att ytterligare polarisera celler till en M2-liknande fenotyp inom 14 dagar. Vi visar morfologiska förändringar av THP-1 monocyt-liknande celler, differentierade makrofager och polariserade M2-liknande makrofager med hjälp av lätta mikroskopi. Denna modell är grunden för cellinjemodeller som undersöker de antiinflammatoriska effekterna av TAM och deras interaktioner med andra cellpopulationer i tumörmikromiljön.

M2-liknande makrofager karakteriserades, och M2-polarisering validerades med hjälp av flödescytometri för cd-markörer (Cluster of Differentiation Markers), CD14, CD11b, CD80 (M1-liknande markör) och CD206 (M2-liknande markör). Flöde cytometri färgning utfördes enligt tillverkarens instruktioner. Makrofager tvättades med PBS/5% FBS och inkuberades med Fcγ-receptor block för att undvika ospecificerad bindning. Cellerna färgades sedan med FITC-konjugerade musantimänskliga CD14- och CD80-antikroppar, med PE-kon...

Watch this Scientific Journal Video about Macrophage Differentiation and Polarization into an M2-Like Phenotype using a Human Monocyte-Like THP-1 Leukemia Cell Line at JoVE.com

Macrophage Differentiation and Polarization into an M2-Like Phenotype using a Human Monocyte-Like THP-1 Leukemia Cell Line

M2-liknande tumör-associerade makrofager (TAM) är associerade med tumör progression och dålig prognos i cancer. Detta protokoll fungerar som en detaljerad guide för att reproducerbart skilja och polarisera THP-1 monocytliknande celler i M2-liknande makrofager inom 14 dagar. Denna modell är grunden för att undersöka de antiinflammatoriska effekterna av TAM inom tumörmikromiljön.

Makrofag differentiering och polarisering till en M2-liknande fenotyp med hjälp av en mänsklig monocytliknande THP-1 leukemi cellinje

Tumor-associated macrophages (TAM) can switch their expression and cytokine profile according to external stimuli. This remarkable plasticity enables TAM ...

Antiinflammatoriska tumör associerade makrofager är kopplade till progression och dålig prognos vid cancer. Detta protokoll är en guide för att differentiera och polarisera THP-1 monocytliknande celler till M2-liknande makrofager inom 14 dagar. För närvarande finns det ingen etablerad modell för antiinflammatorisk THP-1 polarisering.Detta protokoll använder adekvata viloperioder och en långvarig polariseringsprocess för att skapa en distinkt M2-liknande makrofagundertyp. Tumörutveckling, till exempel vid tjocktarmscancer och vävnadsrenovering, styrs av antiinflammatoriska makrofager. Bland studier som undersöker deras funktion säkerställer standardiserad skapande av en distinkt M2-liknande undertyp reproducerbara resultat.Börja med att ställa in en timer i 150 sekunder. Ta bort den frysta injektionsflaskan som innehåller THP-1-cellinjen från det flytande kvävet och tina injektionsflaskan omedelbart vid 37 grader Celsius i ett rent vattenbad, starta timern så snart injektionsflaskan sätts i vattenbadet. Lossa locket för att frigöra det uppbyggda trycket på grund av upptiningsprocessen, se till att röröppningen inte kommer i kontakt med vattnet för att undvika förorening.Tina cellfjädringen tills ett ischip cirka fyra millimeter i storlek lämnas kvar i injektionsflaskan och fortsätt till nästa steg omedelbart. Överför cellfjädringens vätskefas till ett 15 milliliter rör som innehåller nio milliliter varmt tillväxtmedier. Överför sedan en milliliter av denna varma medelcellsupphängning till THP-1-flaskan och tillbaka till 15 milliliterröret för att smälta det återstående ischipet och spola injektionsflaskan för att säkerställa att inga celler lämnas kvar.Blanda fjädringen försiktigt genom att pipettera den upp och ner med en en milliliter pipett. Ta bort cirka 10 mikroliter av provet för att räkna cellerna för livskraft med trypanblått. Cellerna med klar cytoplasma är livskraftiga, en blå cytoplasma indikerar celldöd.Medan du räknar, snurra ner den varma cellupphängningen vid 200 gånger G i sju minuter vid 37 grader Celsius. Ta bort supernaten helt och återanvänd cellerna i tillväxtmedium för att uppnå en celltäthet på 500 000 celler per milliliter. Blanda fjädringen försiktigt och överför 22 milliliter till T75-cellkulturkolvar vardera.Förvara flaskorna upprätt i en inkubator vid 37 grader Celsius med en 5%koldioxidkoncentration och byt tillväxtmedierna var tredje till fjärde dag. Förbered cellupphängningen för att så cellerna med en densitet av 300 000 per milliliter per brunn i 24-brunns cellkulturplattor. Blanda mediet försiktigt och förbered alikvoter på 26 milliliter i 50 milliliter rör.Överför en milliliter av det cellinnehållande mediet till varje brunn på en 24-brunnsplatta. Blanda mediet försiktigt genom att pipetting det upp och ner mellan överföringar. Håll den nyberedda arbetslösningen av PMA på is och tillsätt 100 nanogram PMA per brunn.Inkubera plattorna i inkubatorn utan ytterligare behandling i 72 timmar. Efter 72 timmar, ta bort tillväxtmediet och ersätt det med en milliliter färskt tillväxtmedium, vilket säkerställer att du inte rör brunnens botten med pipettspetsar. Låt cellerna vila i ytterligare 96 timmar i inkubatorn.Ta bort tillväxtmediet och ersätt det med en milliliter färskt tillväxtmedium. Tillsätt 20 nanogram interleukin 4 och 20 nanogram interleukin 13 per brunn. Låt sedan cellerna vila i 48 timmar i inkubatorn.Upprepa hela processen efter 48 timmar och låt cellerna vila i ytterligare 48 timmar i inkubatorn. Ta bort tillväxtmediet och ersätt det med en milliliter färskt tillväxtmedium. Låt sedan cellerna vila i 48 timmar i inkubatorn.Ta bort det varma cellmediet från varje brunn och ersätt det med en milliliter blandning av iskall PBS utan kalcium och magnesium och 5%FBS. Placera sedan omedelbart cellplattan på is i 45 minuter. Efter 45 minuter på is skrapar du av cellerna med minicellsskrapor.Överför försiktigt de fristående makrofagerna till kall PBS och 5%FBS i ett 15 milliliter rör som hålls på is. Makrofagerna som härleds från polariseringsmetoden visar uttrycket av CD14, liksom CD11b-markörer. Monocyt- och makrofagmarkörerna CD14 och CD11b uttrycktes i 70,9% respektive 74,7%av cellerna.Cellerna visade låga ytnivåer av den M1-liknande markören CD80 i 0,2%av cellerna och höga ytnivåer av M2-liknande markör CD206 i 62,6%av cellerna. Eftersom THP-1-celler i medium tenderar att sjunka till botten av en flaska och är lätta att aktivera genom mekanisk stress är det viktigt att försiktigt blanda och hantera cellerna. M2-liknande makrofager skapas reproducerbart och har karakteriserats med QR-TPCR, ELISA och flödescytometri.Detta är grunden för att undersöka antiinflammatoriska mekanismer i cancerutveckling eller vävnadsrenovering.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

En parasit Rescue och Transformation analys för Antileishmanial screening mot intracellulära<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotes i THP1 Human akut monocytisk leukemicellinjen

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

Utredning av Makrofag Polarisering Använda benmärg makrofager

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Ett<em&gt; In vitro</em&gt; Modell för att studera skillnader mellan de mänskliga makrofagdifferentiering och polarisation

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Inrättande av en<em&gt; In vitro</em&gt; System för att studera intracellulära Beteende<em&gt; Candida glabrata</em&gt; I Human THP-1 makrofager

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Bedömning av Innate Sensing av HIV-1 infekterade CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-celler från Plasmacytoid dendritiska celler med en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Samodlingssystemet.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Mycket effektiv Transfektion av mänskliga THP-1 makrofager från Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mus Naiv CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolering och<em&gt; In vitro</em&gt; Differentiering i T cellundergrupper

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualisera makrofag extracellulära fällor med konfokalmikroskopi

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Ett sug Blister protokoll att studera mänsklig T-cell Recall Svaren In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis

En Immunohistopathologic studie att profilera den folat Receptor Beta makrofag och vaskulär immun närmiljön i jätte Cell arterit

Giant cell arteritis (GCA) is a chronic immune-mediated disease of medium-to-large sized arteries that affects older adults. GCA manifests with arthritis ...