Name: single molecule fluorescence energy transfer study of ribosome protein synthesis
Uploaded: 2021-07-06T15:00:00
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Diese Arbeit wird von den US National Institutes of Health (R01GM111452) und der Welch Foundation (E-1721) unterstützt.

1. Herstellung von markiertem Ribosom und tRNA für den FRET-Nachweis
<ol><li>Ribosom ohne L27 aus E. coli Stamm IW312 nach Standardprotokollen20,21 isolieren. Extrahieren Sie das normale Ribosom aus dem E. coli-Stamm MRE600.</li>
	<li>Klonen Sie das rpmA-Gen des L27 mit C-terminalen His-Tag in pET-21b (+) Plasmid, das in BL21(DE3)pLysS-Zellen15transformiert und exprimiert wird. Reinigen Sie das Protein über eine vorve...

<ol>
	<li>Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+have+learned+from+ribosome+structures.">What we have learned from ribosome structures.</a> Biochemical Society Transactions. 36, 567-574 (2008).</li><li>Frank, J., Agrawal, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ratchet-like+inter-subunit+reorganization+of+the+ribosome+during+translocation.">A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation.</a> Nature. 406 (6793), 318-322 (2000).</li><li>Moazed, D., Noller, H. 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T., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+study+of+ribosome+hierarchic+dynamics+at+the+peptidyl+transferase+center.">Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center.</a> Biophysical Journal. 99 (9), 3002-3009 (2010).</li><li>Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+single+molecule+FRET+signals+reveals+multiple+active+ribosome+subpopulations.">Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations.</a> Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).</li><li>Xiao, M., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L27-tRNA+interaction+revealed+by+mutagenesis+and+pH+titration.">L27-tRNA interaction revealed by mutagenesis and pH titration.</a> Biophysical Chemistry. 167, 8-15 (2012).</li><li>Wang, Y., Xiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+ribosomal+protein+L27+revealed+by+single-molecule+FRET+study.">Role of the ribosomal protein L27 revealed by single-molecule FRET study.</a> Protein Science. 21 (11), 1696-1704 (2012).</li><li>Lin, R., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+smFRET+microscope+for+the+quantification+of+label-free+DNA+oligos.">Automated smFRET microscope for the quantification of label-free DNA oligos.</a> Biomedical Optics Express. 10 (2), 682-693 (2019).</li><li>Moazed, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interconversion+of+active+and+inactive+30+S+ribosomal+subunits+is+accompanied+by+a+conformational+change+in+the+decoding+region+of+16+S+rRNA.">Interconversion of active and inactive 30 S ribosomal subunits is accompanied by a conformational change in the decoding region of 16 S rRNA.</a> Journal of Molecular Biology. 191 (3), 483-493 (1986).</li><li>Wower, I. K., Wower, J., Zimmermann, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+protein+L27+participates+in+both+50+S+subunit+assembly+and+the+peptidyl+transferase+reaction.">Ribosomal protein L27 participates in both 50 S subunit assembly and the peptidyl transferase reaction.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (31), 19847-19852 (1998).</li><li>Pan, D., Qin, H., Cooperman, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+functional+activity+of+tRNAs+labeled+with+fluorescent+hydrazides+in+the+D-loop.">Synthesis and functional activity of tRNAs labeled with fluorescent hydrazides in the D-loop.</a> RNA. 15 (2), 346-354 (2009).</li><li>Yang, H., Xiao, M., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+data-driven+algorithm+to+reveal+and+track+the+ribosome+heterogeneity+in+single+molecule+studies.">A novel data-driven algorithm to reveal and track the ribosome heterogeneity in single molecule studies.</a> Biophysical Chemistry. 199, 39-45 (2015).</li><li>Metskas, L. A., Rhoades, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+of+intrinsically+disordered+proteins.">Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 71, 391-414 (2020).</li><li>Hellenkamp, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+accuracy+of+single-molecule+FRET+measurements-a+multi-laboratory+benchmark+study.">Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study.</a> Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).</li><li>Tsai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Efficiency+"-1"+and+"-2"+Ribosomal+Frameshiftings+Revealed+by+Force+Spectroscopy.">High-Efficiency "-1" and "-2" Ribosomal Frameshiftings Revealed by Force Spectroscopy.</a> ACS Chemical Biology. 12 (6), 1629-1635 (2017).</li><li>Yin, H., Xu, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+DNA+rulers+to+study+the+mechanism+of+ribosome+translocation+with+single-nucleotide+resolution.">Dual DNA rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59918 (2019).</li><li>Desai, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-temporal+force+and+fluorescence+measurements+reveal+a+ribosomal+gear+shift+mechanism+of+translation+regulation+by+structured+mRNAs.">Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs.</a> Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).</li></ol>

SmFRET reagiert empfindlich auf Hintergrundsignale. Zuerst ist es notwendig, die Probenkammer mit 0,05% Tween zu beschichten und dann gleichzeitig mit der Ribosomenlösung hinzugefügt zu werden, um eine unspezifische Bindung des Ribosoms an die Oberfläche zu blockieren. Um die Fluoreszenz der Cy5-Emission des Akzeptors zu sehen, ist der Sauerstofffängercocktail (Desoxy-, Glukose- und Trolox-Lösungen) unerlässlich. Ohne diese Lösung ist das Bleichen im Akzeptorkanal zu schnell, um nützliche Informationen zu erhalte...

Das Ribosom ist ein ø 20 nm großer Ribonukleoproteinkomplex aus einer großen (50S) und einer kleinen (30S) Untereinheit. Es setzt lange Peptide entlang der mRNA-Schablone prozessiv und kooperativ zusammen. Das Ribosom 30S bindet an die fMet-tRNAfMet und mRNA, um die Proteinsynthese zu starten, und das 50S verbindet sich dann zum 70S-Initiationskomplex. Die tRNAs bringen Aminosäuren an der A-Stelle (Aminoacyl-tRNA-Bindungsstelle) zum Ribosom, während die längliche Peptidylkette an der P-Stelle (Peptidyl-tRNA-Bindungsstelle) gehalten wird. Im Prätranslokationskomplex wird die Peptidylkette mit einer Aminosäure auf die tRNA an der A-Stelle übertragen. Währenddessen wird die P-Site tRNA deacyliert. Dann bewegen sich die A-, P-tRNAs zu den P-, E-Stellen, um den Post-Translokationskomplex zu bilden, in dem die E-Stelle die tRNA-Austrittsstelle darstellt. In diesem Zustand bewegt sich die Peptidyl-tRNA zurück zur P-Stelle. Der Dehnungszyklus setzt sich zwischen den Prä- und Postkonformationen fort, während das Ribosom auf der mRNA transloziert, ein Codon nach dem anderen1. Das Ribosom ist in hohem Maße koordinaliv von verschiedenen funktionellen Stellen, um diesen Prozess effizient und genau zu machen, wie z. B. Inter-Subunit-Ratschen2,tRNA-Hybridisierungsschwankungen3,GTPase-Aktivierungen4,L1-Stielöffnung und-schließung 5usw. Folglich entphasen ribosomen schnell, da sich jedes Molekül in seinem eigenen Tempo bewegt. Die herkömmlichen Methoden können nur scheinbare Durchschnittsparameter ableiten, aber dünn besiedelte oder kurzlebige Arten werden im durchschnittlichen Effekt maskiert6. Die Einzelmolekülmethode kann diese Einschränkung durchbrechen, indem jedes Ribosom einzeln nachgewiesen und dann verschiedene Spezies durch statistische Rekonstruktion identifiziert werden7. Verschiedene Markierungsstellen wurden implementiert, um die Ribosomendynamik zu untersuchen, wie z.B. die Wechselwirkungen zwischen tRNA-tRNA8, EF-G-L119, L1-tRNA10usw. Darüber hinaus werden durch die Markierung der großen bzw. kleinen Untereinheiten die Ratschenkinetik zwischen den Untereinheiten und die Koordination mit Faktoren beobachtet11,12. Inzwischen hat die smFRET-Methode breite Anwendungen in anderen zentralen biologischen Prozessen, und mehrfarbige FRET-Methoden entstehen13.
Zuvor wurde ein neuartiges Ribosomen-FRET-Paar entwickelt14,15. Das rekombinante ribosomale Protein L27 wurde exprimiert, gereinigt und markiert und wieder in das Ribosom eingebaut. Dieses Protein interagierte mit den tRNAs aus nächster Nähe und half bei der Stabilisierung der P-Site-tRNA im Posttranslokationskomplex. Wenn sich die tRNA von der A- zur P-Stelle bewegt, verkürzt sich der Abstand zwischen diesem Protein und der tRNA, was durch das smFRET-Signal unterschieden werden kann. Mehrere Ribosomen-Subpopulationen wurden mit statistischen Methoden und Mutagenese identifiziert, und der spontane Austausch dieser Populationen im Prä-, aber nicht Nachtranslokationskomplex deutet darauf hin, dass das Ribosom flexibler ist, bevor es sich auf der mRNA bewegt, und steifer während der Entschlüsselung16,17,18. Diese Variationen sind essentiell für die Ribosomenfunktion. Hier beschreibt das Protokoll die Details der Ribosom/tRNA-Markierung, deren Einbau in das Ribosom, smFRET-Probenvorbereitung und Datenerfassung/-analyse19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aminosilane</td>
			<td>Laysanbio</td>
			<td>MPEG-SIL-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG</td>
			<td>Laysanbio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)pLysS cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>millipore sigma</td>
			<td>C3515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS150FNX Micro Ultracentrifuge</td>
			<td>nuaire</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3/C5-maleimide</td>
			<td>ApexBio</td>
			<td>A8138/A8140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECLIPSE Ti2 inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdgeGARD Laminar Flow Hood</td>
			<td>Baker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>millipore sigma</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histrap HP column (Prepacked sepharose column)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17524701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover slip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470235-792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash4.0 V3 camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG (5,000)</td>
			<td>Laysanbio</td>
			<td>MPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-21b (+) plasmid</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CPX-952-518R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Apexbio</td>
			<td>B6055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trolox</td>
			<td>millipore sigma</td>
			<td>238813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single molecule fluorescence energy transfer study of ribosome protein synthesis

Das Ribosom ist ein großer Ribonukleoproteinkomplex, der Proteine prozessiv entlang von mRNA-Schablonen zusammensetzt. Der Durchmesser des Ribosoms beträgt etwa 20 nm, um große tRNA-Substrate an den A-, P- und E-Stellen aufzunehmen. Folglich wird die Ribosomendynamik auf natürliche Weise schnell dephasediert. Die Einzelmolekülmethode kann jedes Ribosom separat detektieren und inhomogene Populationen unterscheiden, was wesentlich ist, um die komplizierten Mechanismen von Mehrkomponentensystemen aufzudecken. Wir berichten über die Details einer smFRET-Methode auf Basis des Nikon Ti2 invertierten Mikroskops zur Untersuchung der Ribosomendynamik zwischen dem ribosomalen Protein L27 und tRNAs. Der L27 wird an seiner einzigartigen Cys 53-Position markiert und zu einem Ribosom rekonstituiert, das so konstruiert ist, dass L27 fehlt. Die tRNA ist an ihrer Ellenbogenregion markiert. Da sich die tRNA während des Dehnungszyklus an verschiedene Stellen innerhalb des Ribosoms bewegt, z. B. vor und nach der Translokation, weisen die FRET-Wirkungsgrade und -Dynamiken Unterschiede auf, die auf mehrere Subpopulationen hindeuteten. Diese Subpopulationen sind mit Ensemble-Methoden nicht nachweisbar. Das TIRF-basierte smFRET-Mikroskop basiert auf einem manuellen oder motorisierten invertierten Mikroskop mit selbstgebauter Laserbeleuchtung. Die Ribosomenproben werden durch Ultrazentrifugation gereinigt, in eine selbstgebaute Mehrkanal-Probenzelle geladen und dann über ein evaneszentes Laserfeld beleuchtet. Der Reflexionslaserspot kann verwendet werden, um eine Rückkopplungskontrolle mit perfektem Fokus zu erreichen. Die Fluoreszenzsignale werden durch einen motorisierten Filterrevolver getrennt und von zwei digitalen CMOS-Kameras gesammelt. Die Intensitäten werden über die NIS-Elements Software abgerufen.

Das smFRET hatte das Ribosom an der mittleren Position des tRNA-Verkehrs markiert, um die tRNA-Translokation von der A- zur P-Stelle zu unterscheiden (Abbildung 1)15. Der Abstand vom L27-Markierungsrest zur A- oder P-Stelle tRNA beträgt 52 bzw. 61 Å, was einer FRET-Effizienz von 0,47 bzw. 0,65 entspricht. Nach der Bildaufnahme wurden Fluoreszenzdicken aus den Donor- und Akzeptorkanälen abgerufen und als Zeitraffer aufgezeichnet (Abbildung 1</st...

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Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Der Einzelmolekül-Fluoreszenz-Energietransfer ist eine Methode, die die tRNA-Dynamik während der ribosomalen Proteinsynthese verfolgt. Durch die Verfolgung einzelner Ribosomen werden inhomogene Populationen identifiziert, die Aufschluss über Mechanismen geben. Diese Methode kann verwendet werden, um biologische Konformationsänderungen im Allgemeinen zu verfolgen, um dynamische Funktionsbeziehungen in vielen anderen komplexen Biosystemen aufzudecken. Einzelmolekülmethoden können nicht-ratenlimitierende Schritte und dünn besiedelte Schlüsselzwischenprodukte beobachten, die mit herkömmlichen Ensemblemethoden aufgrund des durchschnittlichen Effekts nicht zugänglich sind.

Einzelmolekül-Fluoreszenz-Energieübertragungsstudie zur Ribosomenproteinsynthese

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

Einzelmolekül-FRET kann Dynamiken erfassen, die in Nanometerentfernungen stattfinden, was die richtige Skala für den ribosomalen Proteinbiosyntheseprozess ist. Ribosomen arbeiten, indem es mehrere Faktoren und Komponenten allosterisch koordiniert, was intrinsisch inhomogen ist. Die Einzelmolekülmethode kann jedes Ribosom verfolgen, ohne durch diesen inhomogenen Durchschnittseffekt eingeschränkt zu werden.Diese Methode wird zeigen, wie Antibiotika die Ribosomenfunktion hemmen, um neue Medikamente gegen arzneimittelresistente bakterielle Infektionen zu entwickeln. Beginnen Sie mit der Vorbereitung des PRE, indem Sie die Initiierungsmischung EFTU, NOG und PAG im Verhältnis von eins zu zwei zu zwei bei 37 Grad Celsius für zwei Minuten mischen. Reinigen Sie nach der Inkubation den PRE mit 1,1 molarer Saccharosekissen-Ultrazentrifugation über Nacht bei 100.000 mal G.Bereiten Sie den POST vor, indem Sie die Initiationsmischung EFTU, WG und PHE in einem Verhältnis von eins zu zwei zu zwei bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten mischen.Reinigen Sie den POST nach der Inkubation mit 1,1 molarer Saccharosekissen-Ultrazentrifugation über Nacht bei 100.000-fach G.Reinigen Sie die Mikroskopglasobjektträger mit sechs Löcherpaaren mit einem Durchmesser von einem Millimeter und den Mikroskopglasabdeckungen Nummer 1,5. Die sauberen Slides und Deckschichten bei 300 Grad Celsius drei Stunden lang backen und anschließend den Coverslip mit Aminosaline beschichten. Legen Sie in einer sauberen laminaren Kapuze einen Deckdeckel flach auf die Oberfläche.Lassen Sie vorsichtig 60 Mikroliter PEG-Lösung auf die Oberkante fallen, legen Sie dann einen weiteren Deckslip darauf, so dass der Kapillareffekt die Lösung zwischen ihnen verteilt, um sicherzustellen, dass keine Blasen gebildet werden. Wiederholen Sie diese Schritte für zwei weitere Paar Coverlips. Bewahren Sie diese Coverlips in einer leeren, mit Wasser gefüllten Tipbox auf und inkubieren Sie sie drei Stunden lang im Dunkeln.Nach drei Stunden die Abdeckungslippen trennen, in drei aufeinanderfolgenden Tiegeln mit Wasser abspülen und mit einem trockenen Stickstoffstrom reinigen. Ziehen Sie scharfe Pipettenspitzen durch die Löcher auf den Glasschlitten, bis sie fest anliegen. Kratzen Sie die scharfen Enden ab, bis sie vollständig flach mit der Glasoberfläche sind, und schneiden Sie dann ein doppelseitiges Band mit dem Kanalmuster darauf.Kleben Sie die auf die Glasträger auf der flachen Seite. Kleben Sie den beschichteten Deckblatt auf das Doppelband und drücken Sie darauf, um die Probenkammer dicht zu versiegeln und sicherzustellen, dass die beschichtete Seite nach innen zeigt. Schalten Sie den Computer und den Mikroskopschalter ein.Starten Sie die Lasersteuerungsschnittstelle und schalten Sie den Laser ein. Drücken Sie die Aktivierungstaste an der Lasersteuerbox, um den Laser aufzuwärmen. Schalten Sie die Kameras ein und starten Sie dann das mikroskopbezogene Softwareprogramm.Klicken Sie auf die obere Verschlussklappe und dann auf die Lampe. Bereiten Sie den TAM10 mit Tween-Puffer vor, indem Sie 10 Mikroliter 5% Tween-20 in einen Milliliter TAM10-Puffer hinzufügen. Bereiten Sie die Desoxylösung vor, indem Sie drei Milligramm Glukoseoxidase in einem kleinen Mikrozentrifugenröhrchen wiegen und 45 Mikroliter Katalase hinzufügen.Wirbeln Sie das Rohr vorsichtig vor, um den Feststoff aufzulösen. Drehen Sie bei 20.000 mal G in einer Mikrozentrifuge für eine Minute und nehmen Sie den Überstand. Bereiten Sie 30% ige Glukoselösung, 200 Millimolar trolox-Lösung und 0,5 Milligramm pro Milliliter Streptavidinlösung gemäß den Anweisungen im Textmanuskript vor.Fügen Sie dem Rasenobjektiv einen Tropfen Bildöl hinzu. Legen Sie die Probenkammern auf das Objektiv. Füllen Sie die Kammer mit 10 Mikrolitern Streptavidinlösung und warten Sie eine Minute.Waschen Sie die Kammer mit 30 Mikrolitern TAM10 mit Tween-Puffer und sammeln Sie die Durchlauflösung mit einem gefalteten Filterpapier. Warten Sie eine Minute nach dem Waschen. Verdünnen Sie die Ribosomenkomplexe PRE oder POST auf 10-15 nanomolare Konzentrationen mit TAM10 mit Tween-Puffer.Laden Sie 20 Mikroliter der Ribosomenprobe in den Kanal und warten Sie zwei Minuten. Machen Sie den Bildgebungspuffer mit 50 Mikrolitern TAM10-Puffer und jeweils 0,5 Mikrolitern Desoxyglucose und Trolox-Lösung. Mischen Sie sie gut.Spülen Sie die Kammer mit 30 Millilitern des Bildpuffers. Stellen Sie die Kamera für die Aufnahme von Bildern ein. Klicken Sie auf den oberen Verschluss und die Lampe auf aus.Starten Sie die Kameraaufnahme und verteilen Sie die Bilder in drei Fenster, die zwei einzelne Kameras und das Overlay darstellen. Wählen Sie im Menü "Erfassen" die Option "Zeitraffer aufnehmen" aus, und klicken Sie dann auf "Automatisch erfassen". Legen Sie den entsprechenden Dateinamen, Dateipfad und die Anzahl der Schleifen fest und klicken Sie auf Jetzt ausführen.Schließen Sie das Popup-Fenster, sobald die Bildaufnahme abgeschlossen ist, und öffnen Sie dann die erfasste ND-Datei. Klicken Sie auf ROI, einfacher ROI-Editor und wählen Sie den Optionskreis. Wählen Sie den ROI auf dem Bild aus und klicken Sie auf Fertig stellen, wenn es fertig ist.Klicken Sie auf Messung, Zeitmessung, um die Daten entweder als Diagramm oder als Tabelle anzuzeigen. Öffnen Sie die Registerkarte Export, um die Exportparameter festzulegen, und klicken Sie dann auf Exportieren, um die Dichten zu speichern. Öffnen Sie abschließend die Datei, die mit einer geeigneten Anwendung exportiert wurde.Der Abstand vom L27-Markierungsrest zur A-Stelle oder P-Stelle tRNA beträgt 61 bzw. 52 Angström, was einer FRET-Effizienz von 0,47 bzw. 0,65 entspricht. Floreszenzdicken aus den Spender- und Akzeptorkanälen wurden abgerufen und als Zeitraffer aufgezeichnet. Nach dem Ausbleichen des Spenders näherten sich beide Spuren dem Ausgangswert, da keine Erregung direkt am Akzeptor auftreten konnte.Nach dem Akzeptorbleichen nahm die Intensität des Spenders zu, da weniger Reaktionswege die Anregungsenergie ableiteten. Die einzelnen Ribosomen wiesen aufgrund der wackelnden Bewegung der tRNAs unterschiedliche Schwankungen auf, was zu Abstandsschwankungen zum L27 führte. Andere Methoden wie Puromycin-Assay, Assay, Toeprinting-Assay und Massenspezifikation ergänzen die Einzelmolekül-FRET-Methode und geben weitere Details zur Proteinsynthese preis.Einzelmolekül-FRET hat eine breite Anwendung, da viele biologische Prozesse im Nanometerbereich und auf Millisekunden-Zeitskalen ablaufen. Durch das Markieren der richtigen Farbstoffe an den richtigen Positionen können viele andere Dynamiken aufgedeckt werden.

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Transmembrane Transport in Endoplasmic Reticulum and Peroxisomes

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Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluoreszenzanisotropiemessungen als Werkzeug Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen

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Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Einzelmolekül-Manipulation von G-Quadruplexe von magnetischen Pinzette

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Verwendung von dreifarbigen Einzelmolekül-Bund, die Korrelation von Protein-Interaktionen zu studieren

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalente Immobilisierung von Proteinen für die Einzelmolekül-Spektroskopie Kraft

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

In-vitro-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer verwenden, um die Dynamik der Proteinkomplexe auf einer Millisekunde Zeitskala studieren

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Erstellen hochspezifischer chemisch induzierter Proteindimerisierungssysteme durch schrittweise Phage-Auswahl einer kombinatorischen Single-Domain-Antikörperbibliothek

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F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

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