Name: single molecule fluorescence energy transfer study of ribosome protein synthesis
Uploaded: 2021-07-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב (R01GM111452) וקרן וולש (E-1721).

1. הכנת ריבוזום ו- tRNA מסומנים לגילוי FRET
<ol><li>לבודד ריבוזום ללא L27 מ זן E. coli IW312 על פי פרוטוקולים סטנדרטיים20,21. לחלץ את ריבוזום רגיל מזן E. coli MRE600.</li>
	<li>שכפל את הגן סל"מ של L27 עם C-terminal שלו-תג לתוך pET-21b (+) plasmid, אשר השתנה ובא לידי ביטוי בתאי BL21(DE3)pLysS15...

<ol>
	<li>Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+have+learned+from+ribosome+structures.">What we have learned from ribosome structures.</a> Biochemical Society Transactions. 36, 567-574 (2008).</li><li>Frank, J., Agrawal, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ratchet-like+inter-subunit+reorganization+of+the+ribosome+during+translocation.">A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation.</a> Nature. 406 (6793), 318-322 (2000).</li><li>Moazed, D., Noller, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermediate+states+in+the+movement+of+transfer+RNA+in+the+ribosome.">Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome.</a> Nature. 342 (6246), 142-148 (1989).</li><li>Schmeing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+the+ribosome+bound+to+EF-Tu+and+aminoacyl-tRNA.">The crystal structure of the ribosome bound to EF-Tu and aminoacyl-tRNA.</a> Science. 326 (5953), 688-694 (2009).</li><li>Valle, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locking+and+unlocking+of+ribosomal+motions.">Locking and unlocking of ribosomal motions.</a> Cell. 114 (1), 123-134 (2003).</li><li>Gromadski, K. B., Rodnina, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+determinants+of+high-fidelity+tRNA+discrimination+on+the+ribosome.">Kinetic determinants of high-fidelity tRNA discrimination on the ribosome.</a> Molecular Cell. 13 (2), 191-200 (2004).</li><li>Blanchard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA+dynamics+on+the+ribosome+during+translation.">tRNA dynamics on the ribosome during translation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).</li><li>Blanchard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA+selection+and+kinetic+proofreading+in+translation.">tRNA selection and kinetic proofreading in translation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 11 (10), 1008-1014 (2004).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+structural+dynamics+of+ef-g-ribosome+interaction+during+translocation.">Single-molecule structural dynamics of ef-g-ribosome interaction during translocation.</a> Biochemistry. 46 (38), 10767-10775 (2007).</li><li>Cornish, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+the+movement+of+the+L1+stalk+between+three+functional+states+in+single+ribosomes.">Following the movement of the L1 stalk between three functional states in single ribosomes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2571-2576 (2009).</li><li>Cornish, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+intersubunit+rotation+in+single+ribosomes.">Spontaneous intersubunit rotation in single ribosomes.</a> Molecular Cell. 30 (5), 578-588 (2008).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+conformational+and+compositional+dynamics+drive+ribosome+translocation.">Coordinated conformational and compositional dynamics drive ribosome translocation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 20 (6), 718-727 (2013).</li><li>Feng, X. A., Poyton, M. F., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+single-molecule+FRET+for+DNA+and+RNA+processes.">Multicolor single-molecule FRET for DNA and RNA processes.</a> Current Opinion in Structural Biology. 70, 26-33 (2021).</li><li>Ly, C. T., Altuntop, M. E., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+study+of+viomycin's+inhibition+mechanism+on+ribosome+translocation.">Single-molecule study of viomycin's inhibition mechanism on ribosome translocation.</a> Biochemistry. 49 (45), 9732-9738 (2010).</li><li>Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+study+of+ribosome+hierarchic+dynamics+at+the+peptidyl+transferase+center.">Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center.</a> Biophysical Journal. 99 (9), 3002-3009 (2010).</li><li>Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+single+molecule+FRET+signals+reveals+multiple+active+ribosome+subpopulations.">Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations.</a> Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).</li><li>Xiao, M., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L27-tRNA+interaction+revealed+by+mutagenesis+and+pH+titration.">L27-tRNA interaction revealed by mutagenesis and pH titration.</a> Biophysical Chemistry. 167, 8-15 (2012).</li><li>Wang, Y., Xiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+ribosomal+protein+L27+revealed+by+single-molecule+FRET+study.">Role of the ribosomal protein L27 revealed by single-molecule FRET study.</a> Protein Science. 21 (11), 1696-1704 (2012).</li><li>Lin, R., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+smFRET+microscope+for+the+quantification+of+label-free+DNA+oligos.">Automated smFRET microscope for the quantification of label-free DNA oligos.</a> Biomedical Optics Express. 10 (2), 682-693 (2019).</li><li>Moazed, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interconversion+of+active+and+inactive+30+S+ribosomal+subunits+is+accompanied+by+a+conformational+change+in+the+decoding+region+of+16+S+rRNA.">Interconversion of active and inactive 30 S ribosomal subunits is accompanied by a conformational change in the decoding region of 16 S rRNA.</a> Journal of Molecular Biology. 191 (3), 483-493 (1986).</li><li>Wower, I. K., Wower, J., Zimmermann, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+protein+L27+participates+in+both+50+S+subunit+assembly+and+the+peptidyl+transferase+reaction.">Ribosomal protein L27 participates in both 50 S subunit assembly and the peptidyl transferase reaction.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (31), 19847-19852 (1998).</li><li>Pan, D., Qin, H., Cooperman, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+functional+activity+of+tRNAs+labeled+with+fluorescent+hydrazides+in+the+D-loop.">Synthesis and functional activity of tRNAs labeled with fluorescent hydrazides in the D-loop.</a> RNA. 15 (2), 346-354 (2009).</li><li>Yang, H., Xiao, M., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+data-driven+algorithm+to+reveal+and+track+the+ribosome+heterogeneity+in+single+molecule+studies.">A novel data-driven algorithm to reveal and track the ribosome heterogeneity in single molecule studies.</a> Biophysical Chemistry. 199, 39-45 (2015).</li><li>Metskas, L. A., Rhoades, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+of+intrinsically+disordered+proteins.">Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 71, 391-414 (2020).</li><li>Hellenkamp, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+accuracy+of+single-molecule+FRET+measurements-a+multi-laboratory+benchmark+study.">Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study.</a> Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).</li><li>Tsai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Efficiency+"-1"+and+"-2"+Ribosomal+Frameshiftings+Revealed+by+Force+Spectroscopy.">High-Efficiency "-1" and "-2" Ribosomal Frameshiftings Revealed by Force Spectroscopy.</a> ACS Chemical Biology. 12 (6), 1629-1635 (2017).</li><li>Yin, H., Xu, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+DNA+rulers+to+study+the+mechanism+of+ribosome+translocation+with+single-nucleotide+resolution.">Dual DNA rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59918 (2019).</li><li>Desai, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-temporal+force+and+fluorescence+measurements+reveal+a+ribosomal+gear+shift+mechanism+of+translation+regulation+by+structured+mRNAs.">Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs.</a> Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).</li></ol>

SmFRET רגיש לאותות רקע. ראשית, יש צורך לצפות את תא המדגם עם 0.05% tween ולאחר מכן להתווסף במקביל עם פתרון ריבוזום לחסום כריכה לא ספציפית של ריבוזום אל פני השטח. כדי לראות פלואורסצנטיות מפליטת Cy5 המקבלת, קוקטייל נבלות החמצן (פתרונות דאוקסי, גלוקוז ותרולוקס) הוא חיוני. ללא פתרון זה, ההלבנה מהירה מדי בע?...

הריבוזום הוא קומפלקס ריבונוקליאופרוטאין גדול של 20 ננומטר של מתחם גדול (50S) ותת-unit קטן (30S). הוא מרכיב פפטידים ארוכים לאורך תבנית mRNA בתהליכים ובשיתוף פעולה. ה-30S של ריבוזום נקשר ל-fMet-tRNAfMet ול-mRNA כדי להתחיל בסינתזת חלבונים, וה-50S מצטרף ויוצר את קומפלקס החניכה של 70S. ה- tRNAs מביאים חומצות אמינו לריבוזום באתר A (אתר כריכת אמינואציל- tRNA), בעוד שרשרת הפפטידיל המוארכת מוחזקת באתר P (אתר כריכת פפטידיל- tRNA). בקומפלקס טרום טרנסלוקציה, שרשרת הפפטידיל מועברת ל- tRNA באתר A עם חומצת אמינו אחת נוספת. בינתיים, TRNA אתר P הוא deacylated. לאחר מכן, A-, P-tRNAs לעבור לאתרי P-, E- כדי ליצור את המתחם שלאחר טרנסלוקציה, שבו האתר האלקטרוני מייצג את אתר היציאה tRNA. במצב זה, הפפטידיל-tRNA חוזר לאתר P. מחזור התארכות ממשיך בין טרום ופוסט-קונפורמציות בעוד ריבוזום translocates על mRNA, קודון אחד בכל פעם1. הריבוזום הוא מאוד מתאם של אתרים פונקציונליים שונים כדי להפוך את התהליך הזה יעיל ומדויק, כגון ratcheting בין subunit2, תנודות הכלאה tRNA3, הפעלות GTPase4, L1 גבעול פתיחה-סגירה5,וכו '. כתוצאה מכך, ריבוזומים במהירות דה פאזה כי כל מולקולה נעה בקצב שלה. השיטות הקונבנציונליות יכולות רק להסיק פרמטרים ממוצעים לכאורה, אבל מינים מאוכלסים נמוכים או קצרי מועד יהיו מוסווים באפקט הממוצע6. שיטת מולקולה אחת יכולה לשבור מגבלה זו על ידי זיהוי כל ריבוזום בנפרד, ואז לזהות מינים שונים באמצעות שחזור סטטיסטי7. אתרי תיוג שונים יושמו כדי לחקור דינמיקה ריבוזום, כגון האינטראקציות בין tRNA-tRNA8, EF-G-L119, L1-tRNA10,וכו '. בנוסף, על ידי תיוג תת-units הגדול והקטן, בהתאמה, קינטיקה בין-תת-יונית ותיאום עם גורמים נצפים11,12. בינתיים, שיטת smFRET יש יישומים רחבים בתהליכים ביולוגיים מרכזיים אחרים, ושיטות FRET מרובות צבעים מתעוררים13.
בעבר פותח זוג FRET ריבוזום רומן14,15. החלבון הריבוסומלי L27 התבטא, טוהר ותויג, ושולב בחזרה לריבוזום. חלבון זה קיים אינטראקציה עם tRNAs במרחק קרוב ועזר לייצב את ה- TRNA של אתר P בקומפלקס שלאחר הטרנסלוקציה. כאשר tRNA עבר מאתר A לאתר P, המרחק בין חלבון זה לבין tRNA מתקצר, אשר ניתן להבחין על ידי אות smFRET. מספר אוכלוסיות ריבוזום זוהו בשיטות סטטיסטיות ומוטאגנזה, וחילופין ספונטני של אוכלוסיות אלה במתחם הטרנסלוקציה שלפני אך לא לאחר הטרנסלוקציה מרמז על כך שהריבוזום גמיש יותר לפני שהוא עובר על ה- mRNA, ונוקשה יותר במהלךפענוח 16,17,18. וריאציות אלה חיוניות לתפקוד ריבוזום. כאן, הפרוטוקול מתאר את הפרטים של תיוג ריבוזום / tRNA, שילובם ריבוזום, הכנת מדגם smFRET, ורכישת נתונים / ניתוח19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aminosilane</td>
			<td>Laysanbio</td>
			<td>MPEG-SIL-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG</td>
			<td>Laysanbio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)pLysS cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>millipore sigma</td>
			<td>C3515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS150FNX Micro Ultracentrifuge</td>
			<td>nuaire</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3/C5-maleimide</td>
			<td>ApexBio</td>
			<td>A8138/A8140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECLIPSE Ti2 inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdgeGARD Laminar Flow Hood</td>
			<td>Baker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>millipore sigma</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histrap HP column (Prepacked sepharose column)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17524701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover slip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470235-792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash4.0 V3 camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG (5,000)</td>
			<td>Laysanbio</td>
			<td>MPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-21b (+) plasmid</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CPX-952-518R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Apexbio</td>
			<td>B6055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trolox</td>
			<td>millipore sigma</td>
			<td>238813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single molecule fluorescence energy transfer study of ribosome protein synthesis

הריבוזום הוא קומפלקס ריבונוקליאופרוטאין גדול שמרכיב חלבונים באופן תהליכי לאורך תבניות mRNA. הקוטר של ריבוזום הוא כ 20 ננומטר כדי להכיל מצעים tRNA גדולים באתרי A,P ו- E. כתוצאה מכך, הדינמיקה ריבוזום הם באופן טבעי דה-phased במהירות. שיטת מולקולה אחת יכולה לזהות כל ריבוזום בנפרד ולהבחין באוכלוסיות אינומוגניות, החיוניות כדי לחשוף את המנגנונים המורכבים של מערכות מרובות רכיבים. אנו מדווחים על הפרטים של שיטת smFRET המבוססת על המיקרוסקופ ההפוך של ניקון Ti2 כדי לחקור את הדינמיקה ריבוזום בין חלבון ריבוזומלי L27 ו tRNAs. ה-L27 מסומן בעמדת Cys 53 הייחודית שלו וממוקם מחדש לריבוזום שתוכנן חסר L27. ה- tRNA מסומן באזור המרפק שלו. כאשר ה- tRNA עובר למקומות שונים בתוך הריבוזום במהלך מחזור התארכות, כגון טרום ולאחר טרנסלוקציה, יעילות FRET ודינמיקה מציגות הבדלים, אשר הציעו תת-אוכלוסין מרובים. אוכלוסין משנה אלה אינם ניתנים לזיהוי בשיטות הרכב. מיקרוסקופ smFRET מבוסס TIRF בנוי על מיקרוסקופ הפוך ידני או ממונע, עם תאורת לייזר ביתית. דגימות הריבוזום מטוהרות על ידי אולטרה-צנטריפוגה, נטענות לתא מדגם רב-ערוצי שנבנה בבית ואז מוארות באמצעות שדה לייזר אוונסנטי. נקודת לייזר השתקפות ניתן להשתמש כדי להשיג שליטה משוב של מיקוד מושלם. אותות הפלואורסצנטיות מופרדים על ידי צריח מסנן ממונע ונאספים על ידי שתי מצלמות CMOS דיגיטליות. האינטנסיביות מאוחזרות באמצעות תוכנת NIS-Elements.

ה-smFRET היה המסומן במיקום האמצעי של תעבורת tRNA, כדי להבחין בין טרנסלוקציה tRNA לבין אתר P (איור 1)15. המרחק בין שאריות תיוג L27 ל- TRNA של אתר A או P הוא 52 או 61 Å, בהתאמה, בהתאמה, בהתאמה ליעילות FRET של 0.47 ו- 0.65. לאחר איסוף התמונות, אוחזרו ועוצמות הפלואורסצנטיות מערוצי התורם והמקב?...

Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis at JoVE.com

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

העברת אנרגיה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת היא שיטה העוקבת אחר הדינמיקה של ה- tRNA במהלך סינתזת חלבונים ריבוזומליים. על ידי מעקב אחר ריבוזומים בודדים, זוהו אוכלוסיות לאהומוגניות, אשר שופכים אור על מנגנונים. שיטה זו יכולה לשמש כדי לעקוב אחר שינויים קונפורמציה ביולוגית באופן כללי כדי לחשוף קשרי גומלין דינמיים-פונקציה במערכות ביולוגיות מורכבות רבות אחרות. שיטות מולקולה בודדת יכולות לבחון צעדים מגבילים שאינם בקצב ומתווכים מרכזיים מאוכלסים נמוך, שאינם נגישים בשיטות הרכב קונבנציונליות בשל האפקט הממוצע.

מולקולה בודדת פלואורסצנטית העברת אנרגיה מחקר של סינתזת חלבון ריבוזום

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

FRET של מולקולה אחת יכול ללכוד דינמיקה המתרחשת במרחקי ננומטר, שהוא קנה המידה הנכון לתהליך הביוסינתזה של חלבון ריבוזומלי. ריבוזום עובד על ידי תיאום גורמים ורכיבים מרובים באופן אלסטרי, שהוא מהותי אינומוגני. שיטת מולקולה אחת יכולה לעקוב אחר כל ריבוזום מבלי להיות מוגבלת על ידי אפקט ממוצע זה inhomogeneous.שיטה זו תחשוף כיצד אנטיביוטיקה מעכבת את תפקוד הריבוזום לפתח תרופות חדשות לזיהומים חיידקיים עמידים לתרופות. התחל על ידי הכנת PRE על ידי ערבוב EFTU החניכה, NOG, ו PAG לערבב ביחס של אחד עד שניים לשניים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות. לאחר הדגירה, לטהר את PRE באמצעות 1.1 כרית סוכרוז טוחנת אולטרה צנטריפוגה לילה ב 100, 000 פעמים G.Prepare את ההודעה על ידי ערבוב EFTU החניכה, WG, ו PHE לערבב ביחס של אחד עד שניים לשניים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.לאחר הדגירה, לטהר את הפוסט באמצעות 1.1 טחנת סוכרוז כרית אולטרה צנטריפוגה לילה ב 100, 000 פעמים G.Clean את שקופיות זכוכית מיקרוסקופ המכיל שישה זוגות של חורים כי הם מילימטר אחד כיסוי זכוכית מיקרוסקופ. אופים את השקופיות הנקיות ומכסה ב-300 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות, ואז מצפים את כיסוי הציפוי באמינסלין. במכסה המנוע הנקי, הניחו כיסוי אחד שטוח על פני השטח.בזהירות טיפה 60 מיקרוליטרים של פתרון PEG בקצה העליון, ואז להניח כיסוי נוסף על גבי זה, ומאפשר אפקט נימי להפיץ את הפתרון ביניהם להבטיח כי אין בועות נוצרו. חזור על שלבים אלה עבור שני זוגות כיסויים נוספים. אחסנו את הכיסויים האלה בקופסת קצה ריקה מלאה במים ודגרו אותם במשך שלוש שעות בחושך.לאחר שלוש שעות, להפריד את כיסויים, לשטוף עם מים בשלושה כור היתוך רצופים לטהר עם זרם חנקן יבש. משכו קצות פיפטה חדות דרך החורים על מגלשות הזכוכית עד שהם מתאימים היטב. לגרד את הקצוות החדים עד שהם שטוחים לחלוטין עם משטח הזכוכית, ולאחר מכן לחתוך קלטת דו פרצופית עם דפוס הערוץ על זה.תקעו את מגלשות הזכוכית בצד השטוח. יש להניח את הכיסוי המצולף על גבי סרט הפנים הכפול ותלחצו עליו כדי ליצור אטם הדוק של תא הדגימה, ולוודא שהצד המצופה פונה פנימה. הפעל את המחשב ואת מתג המיקרוסקופ.התחל את ממשק בקרת הלייזר והפעל את הלייזר. לחץ על לחצן ההפעלה בתיבת בקרת הלייזר כדי לחמם את הלייזר. הפעל את המצלמות ולאחר מכן הפעל את התוכנה המשויכת למיקרוסקופ.לחץ על התריס העליון כבוי ולחץ על המנורה. הכן את ה- TAM10 עם חיץ Tween על-ידי הוספת 10 מיקרוליטרים של 5% Tween-20 למיליליטר אחד של חיץ TAM10. הכן את פתרון deoxy על ידי שקילה של שלושה מיליגרם של גלוקוז אוקסידאז בצינור microcentrifuge קטן ולהוסיף 45 microliters של קטלאז אליו.מערבולת את הצינור בעדינות כדי להמיס את המוצק. ספין ב 20, 000 פעמים G ב microcentrifuge במשך דקה אחת ולקחת את supernatant. הכן 30% פתרון גלוקוז, פתרון טרולוקס 200 מילימולר ו 0.5 מיליגרם למיליליטר של פתרון סטרפטבידין בעקבות הוראות בכתב היד טקסט.הוסף טיפה אחת של שמן הדמיה למטרה דשא. שים את תאי המדגם על המטרה. מלאו את התא ב-10 מיקרוליטרים של תמיסת סטרפטבידין והמתינו דקה אחת.לשטוף את התא עם 30 microliters של TAM10 עם חוצץ Tween, איסוף הפתרון לרוץ דרך עם נייר מסנן מקופל. המתן דקה לאחר הכביסה. לדלל את מתחמי ריבוזום לפני או פוסט לריכוזים 10-15 ננומולר עם TAM10 עם חוצץ Tween.טען 20 מיקרוליטרים של דגימת ריבוזום לתוך הערוץ ולחכות שתי דקות. הפוך את מאגר ההדמיה באמצעות 50 מיקרוליטרים של חיץ TAM10 ו 0.5 מיקרוליטרים כל אחד של פתרון deoxyglucose ו Trolox. מערבבים אותם היטב.לשטוף את התא עם 30 מיליליטר של מאגר ההדמיה. הגדר את המצלמה להשגת תמונות. לחץ על התריס העליון על והמנורה כבויה.התחל את רכישת המצלמה והפץ את התמונות לשלושה חלונות המייצגים שתי מצלמות בודדות ואת שכבת העל. תחת תפריט רכישה, בחר לכידה של זמן ולאחר מכן לחץ על לכידה באופן אוטומטי. הגדר את שם הקובץ, נתיב הקובץ ומספר הלולאות המתאימים ולחץ על הפעל כעת.סגור את החלון המוקפץ לאחר השלמת רכישת התמונה ולאחר מכן פתח את קובץ ND שנרכש. לחץ על ROI, עורך ROI פשוט ובחר את מעגל האפשרויות. בחר את ההבגייה בתמונה ולחץ על סיום לאחר השלמתה.לחץ על מדידה, מדידת זמן כדי להציג את הנתונים כהתוויה או כגליונות אלקטרוניים. פתח את הכרטיסיה ייצוא כדי להגדיר את פרמטרי הייצוא ולאחר מכן לחץ על ייצוא כדי לשמור את האינטנסיביות. לבסוף, פתח את הקובץ שיוצא באמצעות יישום מתאים.המרחק משאריות התוויות L27 לאתר A או ל- TRNA של אתר P הוא 61 או 52 אנגסטרום בהתאמה, בהתאם ליעילות FRET של 0.47 ו- 0.65. עוצמות פלורסנס מערוצי התורם והקבלה אוחזרו ותכננו כזמנים. לאחר הלבנת התורם, שני העקבות התקרבו לקו הבסיס מכיוון שלא ניתן היה להתרחש עירור ישירות על המקבל.לאחר ההלבנה הקבלה, עוצמת התורם גדלה כי פחות מסלולי תגובה פיזרו את אנרגיית העירור. הריבוזומים הבודדים הציגו תנודות שונות בשל התנועה המתנדנדת של tRNAs, אשר גרם תנודות מרחק L27. שיטות אחרות כמו Puromycin assay, בדיקות, צקת בהונות ומפרט מסה הם מחמיאים לשיטת FRET מולקולה אחת לחשוף פרטים נוספים על סינתזת חלבון.למולקולה אחת FRET יש יישום רחב מכיוון שלתהליכים ביולוגיים רבים מתרחשים בטווח הננומטר ובטווחי זמנים של אלפיות השנייה. על ידי תיוג צבעים נכונים בתנוחות מתאימות, ניתן לגלות דינמיקה רבה אחרת.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Transmembrane Transport in Endoplasmic Reticulum and Peroxisomes

SCIENTISTS IN ACTION

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Anisotropy קרינה ככלי לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

מולקולה בודדת מניפולציה של G-quadruplexes על ידי פינצטה מגנטי

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

באמצעות תלת-צבעי קשת/קשתית מולקולה בודדת ללמוד הקורלציה של אינטראקציות חלבון

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

קיבעון קוולנטיות של חלבונים על ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

שימוש בהעברת אנרגיה פלורסצנטיות תהודה חוץ גופית ללמוד את הדינמיקה של חלבון מתחמי בקנה מידה הזמן אלפיות השנייה

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

שליטי ה-DNA כפול ללמוד את המנגנון של טרנסלוקציה הריבוכמה עם פתרון יחיד נוקלאוטיד

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

יצירת חלבון מאוד ספציפי הנגרמת כימית מערכות דימריזציה על ידי בחירת בחירה באמצעות מבחר של קומבינטורית מתחם יחיד בספריית הנוגדן

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

OaAEP1-תיווך אנזימטית והשתק של חלבון פלסטריזציה לספקטרוסקופיית מולקולות יחיד

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

ניתוח תא יחיד של אללים פעילים בתעתיק על ידי מולקולה אחת FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

מדידות העברת אנרגיה תהודה Förster בתאי צמח חיים

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...