Name: single molecule fluorescence energy transfer study of ribosome protein synthesis
Uploaded: 2021-07-06T15:00:00
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Este trabajo cuenta con el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (R01GM111452) y la Fundación Welch (E-1721).

1. Preparación de ribosoma y ARNt etiquetados para la detección de FRET
<ol><li>Aislar ribosoma sin L27 de la cepa de E. coli IW312 según protocolos estándar20,21. Extraiga el ribosoma regular de la cepa MRE600 de E. coli.</li>
	<li>Clonar el gen rpmA de L27 con C-terminal His-tag en plásmido pET-21b (+), que se transforma y se expresa en células BL21(DE3)pLysS15. Purificar la proteína a través de una columna de...

<ol>
	<li>Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+have+learned+from+ribosome+structures.">What we have learned from ribosome structures.</a> Biochemical Society Transactions. 36, 567-574 (2008).</li><li>Frank, J., Agrawal, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ratchet-like+inter-subunit+reorganization+of+the+ribosome+during+translocation.">A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation.</a> Nature. 406 (6793), 318-322 (2000).</li><li>Moazed, D., Noller, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermediate+states+in+the+movement+of+transfer+RNA+in+the+ribosome.">Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome.</a> Nature. 342 (6246), 142-148 (1989).</li><li>Schmeing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+the+ribosome+bound+to+EF-Tu+and+aminoacyl-tRNA.">The crystal structure of the ribosome bound to EF-Tu and aminoacyl-tRNA.</a> Science. 326 (5953), 688-694 (2009).</li><li>Valle, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locking+and+unlocking+of+ribosomal+motions.">Locking and unlocking of ribosomal motions.</a> Cell. 114 (1), 123-134 (2003).</li><li>Gromadski, K. B., Rodnina, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+determinants+of+high-fidelity+tRNA+discrimination+on+the+ribosome.">Kinetic determinants of high-fidelity tRNA discrimination on the ribosome.</a> Molecular Cell. 13 (2), 191-200 (2004).</li><li>Blanchard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA+dynamics+on+the+ribosome+during+translation.">tRNA dynamics on the ribosome during translation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).</li><li>Blanchard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA+selection+and+kinetic+proofreading+in+translation.">tRNA selection and kinetic proofreading in translation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 11 (10), 1008-1014 (2004).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+structural+dynamics+of+ef-g-ribosome+interaction+during+translocation.">Single-molecule structural dynamics of ef-g-ribosome interaction during translocation.</a> Biochemistry. 46 (38), 10767-10775 (2007).</li><li>Cornish, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+the+movement+of+the+L1+stalk+between+three+functional+states+in+single+ribosomes.">Following the movement of the L1 stalk between three functional states in single ribosomes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2571-2576 (2009).</li><li>Cornish, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+intersubunit+rotation+in+single+ribosomes.">Spontaneous intersubunit rotation in single ribosomes.</a> Molecular Cell. 30 (5), 578-588 (2008).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+conformational+and+compositional+dynamics+drive+ribosome+translocation.">Coordinated conformational and compositional dynamics drive ribosome translocation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 20 (6), 718-727 (2013).</li><li>Feng, X. A., Poyton, M. F., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+single-molecule+FRET+for+DNA+and+RNA+processes.">Multicolor single-molecule FRET for DNA and RNA processes.</a> Current Opinion in Structural Biology. 70, 26-33 (2021).</li><li>Ly, C. T., Altuntop, M. E., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+study+of+viomycin's+inhibition+mechanism+on+ribosome+translocation.">Single-molecule study of viomycin's inhibition mechanism on ribosome translocation.</a> Biochemistry. 49 (45), 9732-9738 (2010).</li><li>Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+study+of+ribosome+hierarchic+dynamics+at+the+peptidyl+transferase+center.">Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center.</a> Biophysical Journal. 99 (9), 3002-3009 (2010).</li><li>Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+single+molecule+FRET+signals+reveals+multiple+active+ribosome+subpopulations.">Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations.</a> Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).</li><li>Xiao, M., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L27-tRNA+interaction+revealed+by+mutagenesis+and+pH+titration.">L27-tRNA interaction revealed by mutagenesis and pH titration.</a> Biophysical Chemistry. 167, 8-15 (2012).</li><li>Wang, Y., Xiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+ribosomal+protein+L27+revealed+by+single-molecule+FRET+study.">Role of the ribosomal protein L27 revealed by single-molecule FRET study.</a> Protein Science. 21 (11), 1696-1704 (2012).</li><li>Lin, R., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+smFRET+microscope+for+the+quantification+of+label-free+DNA+oligos.">Automated smFRET microscope for the quantification of label-free DNA oligos.</a> Biomedical Optics Express. 10 (2), 682-693 (2019).</li><li>Moazed, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interconversion+of+active+and+inactive+30+S+ribosomal+subunits+is+accompanied+by+a+conformational+change+in+the+decoding+region+of+16+S+rRNA.">Interconversion of active and inactive 30 S ribosomal subunits is accompanied by a conformational change in the decoding region of 16 S rRNA.</a> Journal of Molecular Biology. 191 (3), 483-493 (1986).</li><li>Wower, I. K., Wower, J., Zimmermann, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+protein+L27+participates+in+both+50+S+subunit+assembly+and+the+peptidyl+transferase+reaction.">Ribosomal protein L27 participates in both 50 S subunit assembly and the peptidyl transferase reaction.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (31), 19847-19852 (1998).</li><li>Pan, D., Qin, H., Cooperman, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+functional+activity+of+tRNAs+labeled+with+fluorescent+hydrazides+in+the+D-loop.">Synthesis and functional activity of tRNAs labeled with fluorescent hydrazides in the D-loop.</a> RNA. 15 (2), 346-354 (2009).</li><li>Yang, H., Xiao, M., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+data-driven+algorithm+to+reveal+and+track+the+ribosome+heterogeneity+in+single+molecule+studies.">A novel data-driven algorithm to reveal and track the ribosome heterogeneity in single molecule studies.</a> Biophysical Chemistry. 199, 39-45 (2015).</li><li>Metskas, L. A., Rhoades, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+of+intrinsically+disordered+proteins.">Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 71, 391-414 (2020).</li><li>Hellenkamp, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+accuracy+of+single-molecule+FRET+measurements-a+multi-laboratory+benchmark+study.">Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study.</a> Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).</li><li>Tsai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Efficiency+"-1"+and+"-2"+Ribosomal+Frameshiftings+Revealed+by+Force+Spectroscopy.">High-Efficiency "-1" and "-2" Ribosomal Frameshiftings Revealed by Force Spectroscopy.</a> ACS Chemical Biology. 12 (6), 1629-1635 (2017).</li><li>Yin, H., Xu, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+DNA+rulers+to+study+the+mechanism+of+ribosome+translocation+with+single-nucleotide+resolution.">Dual DNA rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59918 (2019).</li><li>Desai, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-temporal+force+and+fluorescence+measurements+reveal+a+ribosomal+gear+shift+mechanism+of+translation+regulation+by+structured+mRNAs.">Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs.</a> Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).</li></ol>

SmFRET es sensible a las señales de fondo. Primero, es necesario recubrir la cámara de muestra con una interpolación al 0,05% y luego agregarse simultáneamente con la solución de ribosoma para bloquear la unión no específica del ribosoma a la superficie. Para ver la fluorescencia de la emisión de Cy5 aceptor, el cóctel eliminador de oxígeno (soluciones deoxy, glucosa y Trolox) es esencial. Sin esta solución, el blanqueo es demasiado rápido en el canal aceptor para obtener información útil. Otro paso crític...

El ribosoma es un complejo de ribonucleoproteína grande de ø 20 nm de una subunidad grande (50S) y una pequeña (30S). Ensambla péptidos largos a lo largo de la plantilla de ARNm de manera procesiva y cooperativa. El ribosoma 30S se une al fMet-tRNAfMet y al ARNm para iniciar la síntesis de proteínas, y el 50S luego se une para formar el complejo de iniciación 70S. Los ARNt llevan aminoácidos al ribosoma en el sitio A (sitio de unión aminoacil-ARNt), mientras que la cadena peptidilada alargada se mantiene en el sitio P (sitio de unión peptidil-ARNt). En el complejo de pre-translocación, la cadena de peptidil se transfiere al ARNt en el sitio A con un aminoácido añadido. Mientras tanto, el ARNt del sitio P está desacilado. Luego, los ARNt A-, P- se mueven a los sitios P-, E- para formar el complejo post-translocación, en el que el sitio E representa el sitio de salida del ARNt. En este estado, el PEPTIDIL-ARNt se mueve de vuelta al sitio P. El ciclo de elongación continúa entre las pre y postconformaciones mientras que el ribosoma se transloca en el ARNm, un codón a la vez1. El ribosoma es altamente coordinativo de diferentes sitios funcionales para hacer que este proceso sea eficiente y preciso, como el trinquete intersubunidad2,las fluctuaciones de hibridación de ARNt3,las activaciones de GTPasa4,la apertura-cierre del tallo L15,etc. En consecuencia, los ribosomas se desespaspas rápidamente porque cada molécula se mueve a su propio ritmo. Los métodos convencionales solo pueden deducir parámetros medios aparentes, pero las especies poco pobladas o de corta duración se enmascararán en el efecto medio6. El método de molécula única puede romper esta limitación detectando cada ribosoma individualmente, luego identificar diferentes especies a través de la reconstrucción estadística7. Se han implementado diferentes sitios de etiquetado para sondear la dinámica de los ribosomas, como las interacciones entre tRNA-ARNt8,EF-G-L119,L1-ARNt10,etc. Además, al etiquetar las subunidades grandes y pequeñas, respectivamente, se observa la cinética de trinquete entre subunidades y la coordinación con los factores11,12. Mientras tanto, el método smFRET tiene amplias aplicaciones en otros procesos biológicos centrales, y están surgiendo métodos FRET multicolor13.
Anteriormente se desarrolló un nuevo par de RIBOSOMAS FRET14,15. La proteína ribosómica recombinante L27 ha sido expresada, purificada y etiquetada, e incorporada de nuevo al ribosoma. Esta proteína interactuó con los ARNt a corta distancia y ayudó a estabilizar el ARNt del sitio P en el complejo post-translocación. Cuando el ARNt se mueve del sitio A- al P, la distancia entre esta proteína y el ARNt se acorta, lo que puede distinguirse por la señal smFRET. Se han identificado múltiples subpoblaciones de ribosomas utilizando métodos estadísticos y mutagénesis, y el intercambio espontáneo de estas poblaciones en el complejo pre- pero no post- translocación sugiere que el ribosoma es más flexible antes de moverse sobre el ARNm, y más rígido durante la decodificación16,17,18. Estas variaciones son esenciales para la función del ribosoma. Aquí, el protocolo describe los detalles del etiquetado ribosómico/ARNt, su incorporación en el ribosoma, la preparación de muestras smFRET y la adquisición/análisis de datos19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aminosilane</td>
			<td>Laysanbio</td>
			<td>MPEG-SIL-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG</td>
			<td>Laysanbio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)pLysS cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>millipore sigma</td>
			<td>C3515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS150FNX Micro Ultracentrifuge</td>
			<td>nuaire</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3/C5-maleimide</td>
			<td>ApexBio</td>
			<td>A8138/A8140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECLIPSE Ti2 inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdgeGARD Laminar Flow Hood</td>
			<td>Baker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>millipore sigma</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histrap HP column (Prepacked sepharose column)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17524701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover slip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470235-792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash4.0 V3 camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG (5,000)</td>
			<td>Laysanbio</td>
			<td>MPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-21b (+) plasmid</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CPX-952-518R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Apexbio</td>
			<td>B6055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trolox</td>
			<td>millipore sigma</td>
			<td>238813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single molecule fluorescence energy transfer study of ribosome protein synthesis

El ribosoma es un gran complejo de ribonucleoproteínas que ensambla proteínas procesivamente a lo largo de plantillas de ARNm. El diámetro del ribosoma es de aproximadamente 20 nm para acomodar grandes sustratos de ARNt en los sitios A, P y E. En consecuencia, la dinámica del ribosoma se desesfálice naturalmente rápidamente. El método de molécula única puede detectar cada ribosoma por separado y distinguir poblaciones no homogéneas, lo cual es esencial para revelar los complicados mecanismos de los sistemas de múltiples componentes. Informamos los detalles de un método smFRET basado en el microscopio invertido Nikon Ti2 para sondear la dinámica de los ribosomas entre la proteína ribosómica L27 y los ARNt. El L27 está etiquetado en su posición única Cys 53 y reconstituido en un ribosoma que está diseñado para carecer de L27. El ARNt está etiquetado en la región del codo. A medida que el ARNt se mueve a diferentes ubicaciones dentro del ribosoma durante el ciclo de elongación, como la pre y post-translocación, las eficiencias y dinámicas de FRET exhiben diferencias, lo que ha sugerido múltiples subpoblaciones. Estas subpoblaciones no son detectables por métodos de conjunto. El microscopio smFRET basado en TIRF está construido sobre un microscopio invertido manual o motorizado, con iluminación láser casera. Las muestras de ribosomas se purifican mediante ultracentrifugación, se cargan en una célula de muestra multicanal construida en casa y luego se iluminan a través de un campo láser evanescente. El punto láser de reflexión se puede utilizar para lograr el control de retroalimentación del enfoque perfecto. Las señales de fluorescencia están separadas por una torreta de filtro motorizada y recogidas por dos cámaras CMOS digitales. Las intensidades se recuperan a través del software NIS-Elements.

El smFRET tenía el ribosoma etiquetado en la posición media del tráfico de ARNt, para distinguir la translocación del ARNt del sitio A- al P (Figura 1)15. La distancia desde el residuo de etiquetado L27 hasta el ARNt del sitio A o P es de 52 o 61 Å, respectivamente, lo que corresponde a una eficiencia FRET de 0,47 y 0,65. Después de la recolección de imágenes, las intensidades de fluorescencia de los canales donante y aceptor se recuperaron y trazaron como lap...

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Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

La transferencia de energía de fluorescencia de molécula única es un método que rastrea la dinámica del ARNt durante la síntesis de proteínas ribosómicas. Al rastrear ribosomas individuales, se identifican poblaciones no homogéneas, lo que arroja luz sobre los mecanismos. Este método se puede utilizar para rastrear cambios biológicos conformacionales en general para revelar relaciones de función dinámica en muchos otros biosistemas complejados. Los métodos de molécula única pueden observar pasos no limitantes de velocidad e intermedios clave poco poblados, a los que no son accesibles los métodos de conjunto convencionales debido al efecto promedio.

Estudio de transferencia de energía de fluorescencia de molécula única de síntesis de proteínas ribosómicas

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

FreT de molécula única puede capturar la dinámica que ocurre a distancias nanométricas, que es la escala correcta para el proceso de biosíntesis de proteínas ribosómicas. El ribosoma funciona coordinando múltiples factores y componentes alostéricamente, lo que es intrínsecamente no homogéneo. El método de una sola molécula puede rastrear cada ribosoma sin estar limitado por este efecto promedio no homogéneo.Este método revelará cómo los antibióticos inhiben la función del ribosoma para desarrollar nuevos medicamentos contra las infecciones bacterianas resistentes a los medicamentos. Comience por preparar el PRE mezclando la mezcla de iniciación EFTU, NOG y PAG en la proporción de uno a dos a 37 grados Celsius durante dos minutos. Después de la incubación, purifique el PRE usando ultracentrifugación de cojín de sacarosa molar 1.1 durante la noche a 100, 000 veces G.Prepare el POST mezclando la mezcla de iniciación EFTU, WG y PHE en una proporción de uno a dos a 37 grados Celsius durante 10 minutos.Después de la incubación, purifique el POST usando un cojín de sacarosa molar 1.1 ultracentrifugación durante la noche a 100, 000 veces G.Limpie los portaobjetos de vidrio del microscopio que contienen seis pares de orificios de un milímetro de diámetro y las cubiertas de vidrio del microscopio número 1.5. Hornea los toboganes limpios y los cubreboganes a 300 grados centígrados durante tres horas, luego cubre el cobierno con aminosalina. En una campana laminar limpia, coloca una cubierta plana sobre la superficie.Deje caer cuidadosamente 60 microlitros de solución de PEG en el borde superior, luego coloque otra cubierta sobre ella, dejando que el efecto capilar extienda la solución entre ellos asegurando que no se formen burbujas. Repita estos pasos para dos pares más de fundas. Guarde estos recuestos en una caja de punta vacía llena de agua e incube durante tres horas en la oscuridad.Después de tres horas, separe los cubrecubres, enjuague con agua en tres crisoles consecutivos y purgue con una corriente de nitrógeno seco. Tire de las puntas de pipeta afiladas a través de los orificios de los portaobjetos de vidrio hasta que encajen bien. Raspe los extremos afilados hasta que estén completamente planos con la superficie de vidrio, luego corte una cinta de doble cara con el patrón de canal.Pegue el en los toboganes de vidrio en el lado plano. Pegue la cubierta recubierta en la cinta de doble cara y presión sobre ella para hacer un sello hermético de la cámara de muestra, asegurándose de que el lado recubierto esté orientado hacia adentro. Encienda la computadora y el interruptor del microscopio.Inicie la interfaz de control láser y encienda el láser. Presione el botón de activación en la caja de control del láser para calentar el láser. Encienda las cámaras y, a continuación, inicie el programa de software asociado al microscopio.Haga clic en el obturador superior apagado y haga clic en la lámpara encendida. Prepare el TAM10 con el búfer Tween agregando 10 microlitros de 5%Tween-20 en un mililitro de búfer TAM10. Prepare la solución desoxi pesando tres miligramos de glucosa oxidasa en un pequeño tubo de microcentrífuga y agréguele 45 microlitros de catalasa.Vórtice el tubo suavemente para disolver el sólido. Gire a 20, 000 veces G en una microcentrífuga durante un minuto y tome el sobrenadante. Prepare una solución de glucosa al 30%, una solución de Trolox de 200 milimolares y 0,5 miligramos por mililitro de solución de estreptavidina siguiendo las instrucciones del manuscrito de texto.Agregue una gota de aceite de imagen al objetivo de césped. Coloque las cámaras de muestra en el objetivo. Llene la cámara con 10 microlitros de solución de estreptavidina y espere un minuto.Lave la cámara con 30 microlitros de TAM10 con tampón Tween, recogiendo la solución de correntía con un papel de filtro doblado. Espere un minuto después del lavado. Diluya los complejos de ribosomas PRE o POST a concentraciones nanomolares de 10-15 con TAM10 con tampón Tween.Cargue 20 microlitros de la muestra de ribosoma en el canal y espere dos minutos. Haga el tampón de imágenes utilizando 50 microlitros de tampón TAM10 y 0,5 microlitros cada uno de desoxiglucosa y solución Trolox. Mézclalos bien.Enjuague la cámara con 30 mililitros del búfer de imágenes. Configure la cámara para adquirir imágenes. Haga clic en el obturador superior y apague la lámpara.Inicie la adquisición de la cámara y difunda las imágenes en tres ventanas que representan dos cámaras individuales y la superposición. En el menú Adquirir, seleccione Capturar lapso de tiempo y luego haga clic en capturar automáticamente. Establezca el nombre de archivo apropiado, la ruta del archivo y el número de bucles y haga clic en ejecutar ahora.Cierre la ventana emergente una vez que se complete la adquisición de la imagen y luego abra el archivo ND adquirido. Haga clic en ROI, editor de ROI simple y elija el círculo de opciones. Seleccione el ROI en la imagen y haga clic en finalizar cuando se complete.Haga clic en medición, medición de tiempo para mostrar los datos como una gráfica o una hoja de cálculo. Abra la pestaña de exportación para establecer los parámetros de exportación, luego haga clic en exportar para guardar las intensidades. Finalmente, abra el archivo que se ha exportado utilizando una aplicación adecuada.La distancia desde el residuo de etiquetado L27 hasta el ARNt del sitio A o del sitio P es de 61 o 52 angstrom respectivamente, lo que corresponde a una eficiencia FRET de 0.47 y 0.65. Las intensidades de florescencia de los canales donante y aceptor se recuperaron y se trazaron como lapsos de tiempo. Después del blanqueamiento del donante, ambos rastros se acercaron a la línea de base porque no se podía producir excitación directamente en el aceptor.Después del blanqueamiento del aceptor, la intensidad del donante aumentó porque menos vías de reacción disiparon la energía de excitación. Los ribosomas individuales exhibieron diferentes fluctuaciones debido al movimiento tambaleante de los ARNet, lo que causó fluctuaciones de distancia al L27. Otros métodos como el ensayo de puromicina, el ensayo, el ensayo de impresión de dedos de dedos y la especificación de masa se complementan con el método FRET de molécula única y revelan más detalles sobre la síntesis de proteínas.El FRET de una sola molécula tiene una amplia aplicación porque muchos procesos biológicos ocurren en el rango de nanómetros y en escalas de tiempo de milisegundos. Al etiquetar los tintes adecuados en las posiciones adecuadas, se pueden revelar muchas otras dinámicas.

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Transmembrane Transport in Endoplasmic Reticulum and Peroxisomes

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Investigación

Bioquímica

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F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

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