Name: single molecule fluorescence energy transfer study of ribosome protein synthesis
Uploaded: 2021-07-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis at JoVE.com

Bu çalışma ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01GM111452) ve Welch Vakfı (E-1721) tarafından desteklenmektedir.

1. FRET tespiti için etiketli ribozom ve tRNA hazırlanması
<ol><li>L27 olmadan ribozomları standart protokollere göre E. coli strain IW312'den izole edin20,21. Normal ribozomları E. coli strain MRE600'den çıkarın.</li>
	<li>L27'nin rpmA genini C-terminal His-tag ile BL21(DE3)pLysS hücreleri15'tedönüştürülen ve ifade edilen pET-21b (+) plazmid içine klonla. Proteini önceden paketlenmiş bir sepharose sü...

<ol>
	<li>Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+have+learned+from+ribosome+structures.">What we have learned from ribosome structures.</a> Biochemical Society Transactions. 36, 567-574 (2008).</li><li>Frank, J., Agrawal, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ratchet-like+inter-subunit+reorganization+of+the+ribosome+during+translocation.">A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation.</a> Nature. 406 (6793), 318-322 (2000).</li><li>Moazed, D., Noller, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermediate+states+in+the+movement+of+transfer+RNA+in+the+ribosome.">Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome.</a> Nature. 342 (6246), 142-148 (1989).</li><li>Schmeing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+the+ribosome+bound+to+EF-Tu+and+aminoacyl-tRNA.">The crystal structure of the ribosome bound to EF-Tu and aminoacyl-tRNA.</a> Science. 326 (5953), 688-694 (2009).</li><li>Valle, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locking+and+unlocking+of+ribosomal+motions.">Locking and unlocking of ribosomal motions.</a> Cell. 114 (1), 123-134 (2003).</li><li>Gromadski, K. B., Rodnina, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+determinants+of+high-fidelity+tRNA+discrimination+on+the+ribosome.">Kinetic determinants of high-fidelity tRNA discrimination on the ribosome.</a> Molecular Cell. 13 (2), 191-200 (2004).</li><li>Blanchard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA+dynamics+on+the+ribosome+during+translation.">tRNA dynamics on the ribosome during translation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).</li><li>Blanchard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA+selection+and+kinetic+proofreading+in+translation.">tRNA selection and kinetic proofreading in translation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 11 (10), 1008-1014 (2004).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+structural+dynamics+of+ef-g-ribosome+interaction+during+translocation.">Single-molecule structural dynamics of ef-g-ribosome interaction during translocation.</a> Biochemistry. 46 (38), 10767-10775 (2007).</li><li>Cornish, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+the+movement+of+the+L1+stalk+between+three+functional+states+in+single+ribosomes.">Following the movement of the L1 stalk between three functional states in single ribosomes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2571-2576 (2009).</li><li>Cornish, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+intersubunit+rotation+in+single+ribosomes.">Spontaneous intersubunit rotation in single ribosomes.</a> Molecular Cell. 30 (5), 578-588 (2008).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+conformational+and+compositional+dynamics+drive+ribosome+translocation.">Coordinated conformational and compositional dynamics drive ribosome translocation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 20 (6), 718-727 (2013).</li><li>Feng, X. A., Poyton, M. F., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+single-molecule+FRET+for+DNA+and+RNA+processes.">Multicolor single-molecule FRET for DNA and RNA processes.</a> Current Opinion in Structural Biology. 70, 26-33 (2021).</li><li>Ly, C. T., Altuntop, M. E., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+study+of+viomycin's+inhibition+mechanism+on+ribosome+translocation.">Single-molecule study of viomycin's inhibition mechanism on ribosome translocation.</a> Biochemistry. 49 (45), 9732-9738 (2010).</li><li>Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+study+of+ribosome+hierarchic+dynamics+at+the+peptidyl+transferase+center.">Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center.</a> Biophysical Journal. 99 (9), 3002-3009 (2010).</li><li>Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+single+molecule+FRET+signals+reveals+multiple+active+ribosome+subpopulations.">Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations.</a> Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).</li><li>Xiao, M., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L27-tRNA+interaction+revealed+by+mutagenesis+and+pH+titration.">L27-tRNA interaction revealed by mutagenesis and pH titration.</a> Biophysical Chemistry. 167, 8-15 (2012).</li><li>Wang, Y., Xiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+ribosomal+protein+L27+revealed+by+single-molecule+FRET+study.">Role of the ribosomal protein L27 revealed by single-molecule FRET study.</a> Protein Science. 21 (11), 1696-1704 (2012).</li><li>Lin, R., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+smFRET+microscope+for+the+quantification+of+label-free+DNA+oligos.">Automated smFRET microscope for the quantification of label-free DNA oligos.</a> Biomedical Optics Express. 10 (2), 682-693 (2019).</li><li>Moazed, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interconversion+of+active+and+inactive+30+S+ribosomal+subunits+is+accompanied+by+a+conformational+change+in+the+decoding+region+of+16+S+rRNA.">Interconversion of active and inactive 30 S ribosomal subunits is accompanied by a conformational change in the decoding region of 16 S rRNA.</a> Journal of Molecular Biology. 191 (3), 483-493 (1986).</li><li>Wower, I. K., Wower, J., Zimmermann, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+protein+L27+participates+in+both+50+S+subunit+assembly+and+the+peptidyl+transferase+reaction.">Ribosomal protein L27 participates in both 50 S subunit assembly and the peptidyl transferase reaction.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (31), 19847-19852 (1998).</li><li>Pan, D., Qin, H., Cooperman, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+functional+activity+of+tRNAs+labeled+with+fluorescent+hydrazides+in+the+D-loop.">Synthesis and functional activity of tRNAs labeled with fluorescent hydrazides in the D-loop.</a> RNA. 15 (2), 346-354 (2009).</li><li>Yang, H., Xiao, M., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+data-driven+algorithm+to+reveal+and+track+the+ribosome+heterogeneity+in+single+molecule+studies.">A novel data-driven algorithm to reveal and track the ribosome heterogeneity in single molecule studies.</a> Biophysical Chemistry. 199, 39-45 (2015).</li><li>Metskas, L. A., Rhoades, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+of+intrinsically+disordered+proteins.">Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 71, 391-414 (2020).</li><li>Hellenkamp, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+accuracy+of+single-molecule+FRET+measurements-a+multi-laboratory+benchmark+study.">Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study.</a> Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).</li><li>Tsai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Efficiency+"-1"+and+"-2"+Ribosomal+Frameshiftings+Revealed+by+Force+Spectroscopy.">High-Efficiency "-1" and "-2" Ribosomal Frameshiftings Revealed by Force Spectroscopy.</a> ACS Chemical Biology. 12 (6), 1629-1635 (2017).</li><li>Yin, H., Xu, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+DNA+rulers+to+study+the+mechanism+of+ribosome+translocation+with+single-nucleotide+resolution.">Dual DNA rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59918 (2019).</li><li>Desai, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-temporal+force+and+fluorescence+measurements+reveal+a+ribosomal+gear+shift+mechanism+of+translation+regulation+by+structured+mRNAs.">Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs.</a> Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).</li></ol>

SmFRET arka plan sinyallerine duyarlıdır. İlk olarak, numune odasını% 0.05 ara ile kaplamak ve daha sonra ribozom çözeltisi ile eşzamanlı olarak ribozom çözeltisi ile birlikte ribozomun yüzeye spesifik olmayan bağlanmasını engellemek için eklenebilir. Kabul eden Cy5 emisyonundan floresan görmek için oksijen çöpçü kokteyli (deoksi, glikoz ve Trolox çözeltileri) gereklidir. Bu çözüm olmadan, beyazlatma, yararlı bilgi elde etmek için kabul eden kanalda çok hızlıdır. Ribozom deneyleri için ?...

Ribozom, büyük (50S) ve küçük (30S) bir alt birenin ø 20 nm büyük ribonükleoprotein kompleksidir. mRNA şablonu boyunca uzun peptitleri işlemsel ve işbirliği içinde birleştirir. Ribozom 30S, protein sentezine başlamak içinfMet-tRNA fMet ve mRNA'ya bağlanır ve 50S daha sonra 70S başlatma kompleksini oluşturmak için birleşir. TRNA'lar amino asitleri A-sitesindeki (aminoasil- tRNA bağlama bölgesi) ribozomlara getirirken, uzun peptidil zinciri P-sitesinde (peptidyl- tRNA bağlama bölgesi) tutulur. Ön translokasyon kompleksinde, peptidyl zinciri bir amino asit eklenerek A sahasındaki tRNA'ya aktarılır. Bu arada, P-site tRNA'sı devre dışı bırakılır. Daha sonra, A-, P-tRNA'lar, E-sitenin tRNA çıkış sitesini temsil ettiği translokasyon sonrası kompleksini oluşturmak için P-, E-sitelerine taşınır. Bu durumda, peptidyl-tRNA P bölgesine geri döner. Ribozom mRNA üzerinde yer alırken, uzama döngüsü öncesi ve sonrası konformasyonlar arasında devam eder, her seferinde bir kodon1. Ribozom, bu işlemi verimli ve doğru hale getirmek için farklı fonksiyonel sitelerin son derece koordine edicidir, örneğin alt biralar arası cırcır2, tRNA hibridizasyon dalgalanmaları3, GTPase aktivasyonları4, L1 sap açma-kapama5,vb. Sonuç olarak, ribozomlar hızla fazdan arındırılır, çünkü her molekül kendi hızında hareket eder. Geleneksel yöntemler sadece belirgin ortalama parametreleri ortaya yaratabilir, ancak düşük nüfuslu veya kısa ömürlü türler ortalama etki6' da maskelenecektir. Tek molekül yöntemi, her ribozom ayrı ayrı tespit ederek bu sınırlamayı kırabilir, daha sonra istatistiksel rekonstrüksiyon ile farklı türleri tanımlayabilir7. tRNA-tRNA8, EF-G-L119,L1-tRNA10vb. Ek olarak, sırasıyla büyük ve küçük alt ünlemler etiketlenerek, alt biralar arası cırcır kinetiği ve faktörlerle koordinasyon gözlenir11,12. Bu arada, smFRET yöntemi diğer merkezi biyolojik süreçlerde geniş uygulamalara sahiptir ve çok renkli FRET yöntemleri ortaya13.
Daha önce yeni bir ribozom FRET çifti geliştirildi14,15. Rekombinant ribozomal protein L27 ifade edildi, saflaştırıldı ve etiketlendi ve ribozom içine geri dahil edildi. Bu protein tRNA'larla yakın mesafede etkileşime girdi ve translokasyon sonrası komplekste P bölgesi tRNA'sının stabilizesine yardımcı oldu. tRNA, A-'dan P bölgesine taşındığında, bu protein ile tRNA arasındaki mesafe kısalır ve bu da smFRET sinyali ile ayırt edilebilir. İstatistiksel yöntemler ve mutajensis kullanılarak birden fazla ribozom alt popülasyonu tanımlanmıştır ve bu popülasyonların translokasyon öncesi ancak sonrası komplekste kendiliğinden değişimi ribozomların mRNA'ya geçmeden önce daha esnek ve16, 17,18'indekodlanması sırasında daha sert olduğunu göstermektedir. Bu varyasyonlar ribozom fonksiyonu için gereklidir. Burada, protokol ribozom / tRNA etiketlemesinin ayrıntılarını, ribozom, smFRET örnek hazırlama ve veri toplama / analiz19'a dahil etmelerini açıklar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aminosilane</td>
			<td>Laysanbio</td>
			<td>MPEG-SIL-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG</td>
			<td>Laysanbio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)pLysS cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>millipore sigma</td>
			<td>C3515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS150FNX Micro Ultracentrifuge</td>
			<td>nuaire</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3/C5-maleimide</td>
			<td>ApexBio</td>
			<td>A8138/A8140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECLIPSE Ti2 inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdgeGARD Laminar Flow Hood</td>
			<td>Baker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>millipore sigma</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histrap HP column (Prepacked sepharose column)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17524701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover slip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470235-792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash4.0 V3 camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG (5,000)</td>
			<td>Laysanbio</td>
			<td>MPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-21b (+) plasmid</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CPX-952-518R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Apexbio</td>
			<td>B6055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trolox</td>
			<td>millipore sigma</td>
			<td>238813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single molecule fluorescence energy transfer study of ribosome protein synthesis

Ribozom, proteinleri mRNA şablonları boyunca işlemsel olarak bir araya getiren büyük bir ribononcleoprotein kompleksidir. Ribozom çapı, A, P ve E-sahalarında büyük tRNA substratlarını barındırmak için yaklaşık 20 nm'dir. Sonuç olarak, ribozom dinamikleri doğal olarak hızlı bir şekilde fazdan arındırılır. Tek molekül yöntemi, her ribozomları ayrı ayrı algılayabilir ve çok bileşenli sistemlerin karmaşık mekanizmalarını ortaya çıkarmak için gerekli olan inhomogeneous popülasyonları ayırt edebilir. Ribozomal protein L27 ve tRNA'lar arasındaki ribozom dinamiklerini araştırmak için Nikon Ti2 ters mikroskobuna dayanan bir smFRET yönteminin ayrıntılarını rapor ediyoruz. L27, benzersiz Cys 53 pozisyonunda etiketlenmiştir ve L27'den yoksun olarak tasarlanmış bir ribozom haline yeniden inşa edilmiştir. tRNA dirsek bölgesinde etiketlenmiştir. tRNA, uzama döngüsü sırasında ribozom içinde translokasyon öncesi ve sonrası gibi farklı yerlere taşınırken, FRET verimlilikleri ve dinamikleri birden fazla alt nüfus öneren farklılıklar sergiler. Bu alt nüfuslar topluluk yöntemleri ile tespit edilemez. TIRF tabanlı smFRET mikroskop, ev yapımı lazer aydınlatmalı manuel veya motorlu ters mikroskop üzerine inşa edilir. Ribozom örnekleri ultrasantrifüjleme ile saflaştırılarak ev yapımı çok kanallı bir örnek hücreye yüklenir ve daha sonra evanescent lazer alanı ile aydınlatılmıştır. Yansıma lazer noktası, mükemmel odağın geri bildirim kontrolünü elde etmek için kullanılabilir. Floresan sinyalleri motorlu bir filtre kulesi ile ayrılır ve iki dijital CMOS kamera tarafından toplanır. Yoğunluklar NIS-Elements yazılımı aracılığıyla alınır.

SmFRET, tRNA translokasyonunu A-'dan P bölgesine ayırt etmek için ribozomları tRNA trafiğinin orta konumuna etiketlemiştir (Şekil 1)15. L27 etiketleme kalıntısından A veya P bölgesi tRNA'sına olan mesafe sırasıyla 52 veya 61 Å'dır ve 0,47 ve 0,65 FRET verimliliğine karşılık gelendir. Görüntü toplamadan sonra donör ve alıcı kanallardan floresan yoğunlukları alınarak zaman aşımı olarak çizilmiştir (Şekil 1...

Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis at JoVE.com

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Tek moleküllü floresan enerji transferi ribozomal protein sentezi sırasında tRNA dinamiklerini izleyen bir yöntemdir. Bireysel ribozomları izleyerek, mekanizmalara ışık tutan inhomogeneöz popülasyonlar tanımlanır. Bu yöntem, diğer birçok karmaşık biyosistemdeki dinamik işlev ilişkilerini ortaya çıkarmak için genel olarak biyolojik konformasyon değişikliklerini izlemek için kullanılabilir. Tek molekül yöntemleri, ortalama etki nedeniyle geleneksel topluluk yöntemleriyle erişilemeyen oransız sınırlayıcı adımları ve düşük nüfuslu anahtar ara maddeleri gözlemleyebilir.

Ribozom Protein Sentezinin Tek Molekül floresan Enerji Transferi Çalışması

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

Tek moleküllü FRET, ribozomal protein biyosentez işlemi için doğru ölçek olan nanometre mesafelerinde gerçekleşen dinamikleri yakalayabilir. Ribozom, özünde inhomogeneous olan allosterik olarak birden fazla faktör ve bileşeni koordine ederek çalışır. Tek moleküllü yöntem, bu inhomogeneous ortalama etki ile sınırlı kalmadan her ribozom izleyebilir.Bu yöntem, antibiyotiklerin ilaca dirençli bakteriyel enfeksiyonlara yönelik yeni ilaçlar geliştirmek için ribozom fonksiyonunu nasıl inhibe edeceğini ortaya koymaktadır. Başlangıç EFTU, NOG ve PAG karışımını iki dakika boyunca 37 santigrat derecede bir ila iki oranında karıştırarak PRE'yi hazırlayarak başlayın. Kuluçkadan sonra, PRE'yi 100.000 kez gece boyunca 1,1 molar sakkaroz yastığı ultrasantrifüjü kullanarak arındırın G.Başlangıç EFTU, WG ve PHE karışımını 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir ila iki oranında karıştırarak POST'u hazırlayın.Kuluçkadan sonra, POST'u 1.1 molar sakkaroz minderi ultrasantrifüjasyonu kullanarak bir gecede 100.000 kez saflaştırın G.Bir milimetre çapında altı çift delik ve 1.5 mikroskop cam kapakları içeren mikroskop cam slaytları temizleyin. Temiz slaytları ve kapakları 300 santigrat derecede üç saat pişirin, ardından kapak kapağını aminosaline ile kaplayın. Temiz bir laminar davlumbazda, yüzeye bir kapak düz döşeyin.Üst kenara 60 mikrolitre PEG çözeltisini dikkatlice bırakın, ardından üzerine başka bir kapak ucu yerleştirin, kılcal damar etkisinin çözeltiyi aralarında yaymasına izin vererek kabarcık oluşmamasını sağlayın. İki çift kapak kılıfı için bu adımları yineleyin. Bu kapakları su dolu boş bir uç kutusunda saklayın ve karanlıkta üç saat boyunca kuluçkaya yatırın.Üç saat sonra, kapakları ayırın, art arda üç potada suyla durulayın ve kuru bir azot akışı ile arındırın. Cam kaydıraklardaki deliklerden sıkıca oturana kadar keskin pipet uçlarını çekin. Keskin uçları cam yüzeyle tamamen düz olana kadar kazıyın, ardından üzerinde kanal deseni olan çift yüzlü bir bant kesin.Düz taraftaki cam slaytlara yapıştırın. Kaplamalı kapak sapını çift yüzlü bant üzerine yapıştırın ve kaplamalı tarafın içe doğru dönük olduğundan emin olarak numune odasının sıkı bir mührünü yapmak için üzerine bastırın. Bilgisayarı ve mikroskop anahtarını açın.Lazer kontrol arayüzünü başlatın ve lazeri açın. Lazeri ısıtmak için lazer kontrol kutusundaki etkinleştir düğmesine basın. Kameraları açın ve mikroskopla ilişkili yazılım programını başlatın.Üst deklanşörü tıklatın ve lambayı tıklayın. Tam10'u bir mililitre TAM10 arabelleğine %5 Tween-20'lik 10 mikrolitre ekleyerek ARA TAMPONla hazırlayın. Küçük bir mikrosantrifüj tüpünde üç miligram glikoz oksidaz tartarak deoksi çözeltisini hazırlayın ve içine 45 mikrolitre katalaz ekleyin.Katıyı çözmek için tüpü nazikçe vorteks edin. Bir mikrosantrifüjde 20.000 G'de bir dakika dön ve üst taraftakiyi al. Metin el yazmasındaki talimatları izleyerek% 30 glikoz çözeltisi, 200 milimoler Trolox çözeltisi ve mililitre streptavidin çözeltisi başına 0,5 miligram hazırlayın.Çim hedefine bir damla görüntüleme yağı ekleyin. Örnek odaları hedefe koyun. Odayı 10 mikrolitre streptavidin çözeltisi ile doldurun ve bir dakika bekleyin.Hazneyi 30 mikrolitre TAM10 ile Ara tamponu ile yıkayın ve katlanmış bir filtre kağıdı ile çalıştırılan çözeltiyi toplayın. Yıkadıktan sonra bir dakika bekleyin. Ribozom komplekslerini PRE veya POST'u TAM10 ile Tween tamponu ile 10-15 nanomolar konsantrasyona seyreltin.Ribozom örneğinin 20 mikrolitresini kanala yükleyin ve iki dakika bekleyin. Deoksiglucose ve Trolox çözeltisinin her biri 50 mikrolitre TAM10 tampon ve 0,5 mikrolitre kullanarak görüntüleme tamponu yapın. İyice karıştırın.Odayı 30 mililitre görüntüleme tamponu ile yıkayın. Kamerayı görüntü almak için ayarlayın. Üst deklanşörü tıklatın ve lambayı kapatın.Kamera alımını başlatın ve görüntüleri iki ayrı kamerayı ve kaplamayı temsil eden üç pencereye yayın. Edinme menüsünün altında yakalama zaman çizipse'yi seçin ve ardından otomatik olarak yakalama'ya tıklayın. Uygun dosya adını, dosya yolunu ve döngü sayısını ayarlayın ve şimdi çalıştır'ı tıklatın.Görüntü alımı tamamlandıktan sonra açılır pencereyi kapatın ve sonra alınan ND dosyasını açın. Yatırım getirisi, basit yatırım getirisi editörüne tıklayın ve seçenek çemberini seçin. Görüntüdeki yatırım getirisini seçin ve tamamlandığında bitiş'e tıklayın.Verileri çizim veya elektronik tablo olarak göstermek için ölçüme, zaman ölçümüne tıklayın. Dışa aktarma parametrelerini ayarlamak için dışa aktarma sekmesini açın, sonra yoğunlukları kaydetmek için dışa aktar'ı tıklatın. Son olarak, uygun bir uygulama kullanılarak dışa aktarılan dosyayı açın.L27 etiketleme kalıntısından A-site veya P-site tRNA'ya olan mesafe sırasıyla 61 veya 52 angstromdur ve 0,47 ve 0,65 FRET verimliliğine karşılık gelendir. Donör ve alıcı kanallardan floresan yoğunlukları alındı ve zaman çizilerek çizildi. Donör ağartma işleminden sonra, her iki iz de taban çizgisine yaklaştı, çünkü doğrudan alıcıda herhangi bir ekscitasyon gerçekleşemedi.Kabul eden ağartmadan sonra, daha az reaksiyon yolu uyarılma enerjisini dağıttığı için donör yoğunluğu arttı. Bireysel ribozomlar, L27'de mesafe dalgalanmalarına neden olan tRNA'ların sallanan hareketi nedeniyle farklı dalgalanmalar sergiledi. Puromycin tahlil, tahlil, ayakbaskı tahlil ve kütle spektrometresi gibi diğer yöntemler tek moleküllü FRET yöntemine ücretsizdir ve protein sentezi hakkında daha fazla ayrıntı ortaya koymaktadır.Tek moleküllü FRET geniş bir uygulamaya sahiptir, çünkü birçok biyolojik süreç nanometre aralığında ve milisaniyelik zaman ölçeklerinde gerçekleşir. Uygun boyalar uygun konumlarda etiketlenerek, diğer birçok dinamik ortaya çıkabilir.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Transmembrane Transport in Endoplasmic Reticulum and Peroxisomes

SCIENTISTS IN ACTION

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-protein etkileşimleri çalışmak için aracı olarak floresan Anizotropi

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

G-quadruplexes manyetik cımbız tarafından manipülasyon tek molekül

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Üç renkli tek molekül FRET Protein etkileşimleri korelasyon çalışma için kullanma

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Proteinler kovalent immobilizasyon için tek molekül kuvvet spektroskopisi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Protein kompleksleri milisaniyelik zaman ölçekte dinamikleri çalışmaya vitro Floresans rezonans enerji transferi içinde kullanma

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

Çift DNA cetvelleri tek Nükledotid çözünürlüğe sahip Ribosome translocation mekanizmasını Incelemek için

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Bir Kombinatoryal Tek Etki Alanı Antikor Kütüphanesi adım wise Faj Seçimi ile Son Derece Spesifik Kimyasal Kaynaklı Protein Dimerization Sistemleri Oluşturma

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

OaAEP1-Tek Moleküllü Kuvvet Spektroskopisi İçin Polimerize Proteinin Aracılı Enzimatik Sentezi ve Immobilizasyonu

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Transkripsiyonel Aktif Alellerin Tek Molekül FISH ile Tek Hücre Analizi

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Yaşayan Bitki Hücrelerinde Förster Rezonans Enerji Transferi Ölçümleri

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...