यह प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण है क्योंकि यह लिपिड फिल्म से माइक्रोबबल्स और फिर बूंदों के लिपिड समाधान के लिए बूंदों को बनाने के लिए पूरी प्रक्रिया प्रदान करता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ बूंदों में माइक्रोबबल्स को संघनित करने के लिए सादगी है। बस ठंडा और घूमता है, बूंदों दबाव की आवश्यकता के बिना किया जा सकता है।
एक दृश्य प्रदर्शन महत्वपूर्ण है क्योंकि यह देखने के लिए एक सरल परीक्षण कि क्या माइक्रोबबल्स को सफलतापूर्वक गाढ़ा किया गया है, तो दृष्टिहीनता में परिवर्तन की जांच करके है। प्रक्रिया का प्रदर्शन किमोन आ, गिरोह झेंग प्रयोगशाला में एक मास्टर के छात्र होगा । एक डिकैपर का उपयोग करके, सीरम शीशी पर एल्यूमीनियम सील को हटा दें और लिपिड समाधान के एक मिलीलीटर को 1.85 मिलीलीटर बोरोसिलिकेट ग्लास नमूना शीशी में स्थानांतरित करें, जिसमें लिपिड समाधान को बुलबुले बनाने के बिना आंतरिक दीवार के नीचे प्रवाह दे।
1.85 मिलीलीटर नमूना शीशी गैस एक्सचेंजर का उपयोग करके नमूना शीशी हेडस्पेस में डेकाफ्लोरोबुटेन गैस में प्रवाहित करने के लिए तैयार है। सुनिश्चित करें कि गैस एक्सचेंजर पर सभी वाल्व ठीक से बंद हैं और पंप बंद कर दिया गया है। कई गुना वाल्व खोलें और ध्यान से कई गुना से संबंधित सुई को अनशिएट करें।
ओपन प्रेशर वाल्व ए और प्रेशर वाल्व बी और आंशिक रूप से इसे खोलने के लिए गैस सिलेंडर वाल्व को लगभग 1/16 से 1/8 काउंटर-क्लॉकवाइज चालू करें । टी हैंडल वाल्व खोलें और लिपिड समाधान के साथ नमूना शीशी को अनकैप्ड करें। शीशी के तरल एयर इंटरफेस के ऊपर कई गुना सुई रखें, धीरे-धीरे हवा नियामक वाल्व दक्षिणावर्त बारी जब तक हवा नियामक गेज सुई अपने आराम की स्थिति से थोड़ा चलता है और परफ्लोरोकार्बन गैस धीरे 30 सेकंड के लिए शीशी हेडस्पेस में प्रवाह, बुलबुले बनाने के लिए नहीं ध्यान रखते हुए।
यदि आवश्यक हो तो वायु नियामक वाल्व को समायोजित करें। 30 सेकंड के बाद, ध्यान से और जल्दी से शीशी बहुत ज्यादा चलती बिना नमूना शीशी रखा। दोनों गैस सिलेंडर वाल्व, टी संभाल वाल्व, एयर रेगुलेटर वाल्व, दबाव वाल्व ए, दबाव वाल्व बी, और कई गुना वाल्व।
ध्यान से सुई म्यान, तो नमूना शीशी लेबल और मोम फिल्म के साथ गर्दन सील दक्षिणावर्त जा रहा है । नमूने की शीशी को अंधेरे में और चार डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 10 मिनट या 24 घंटे तक स्टोर करें। एक अछूता कंटेनर में लगभग 100 ग्राम सूखी बर्फ रखें एक अन्य अछूता कंटेनर में नियमित बर्फ रखें।
1.5 इंच 20 गेज सुई, एक मिलीलीटर प्लास्टिक सिरिंज, एक 200 मिलीलीटर कंटेनर, धातु चिमटे, और एक थर्मामीटर के लिए एक पहले से तैयार decafluorobutane सीरम शीशी पुनः प्राप्त करें। नमूना शीशी को यांत्रिक आंदोलनकारी में लिपिड समाधान के साथ रखें और 45 सेकंड के लिए आंदोलन करें। रंग और पारंर्धकता में बदलाव होना चाहिए।
यांत्रिक आंदोलन के बाद, नमूना शीशी दाईं ओर खड़े प्रकाश से परिरक्षित और एक 15 मिनट की उलटी गिनती शुरू करने के लिए शीशी और आकार माइक्रोबबल्स का चयन ठंडा । जब उलटी गिनती 10 मिनट तक पहुंच गई है, तो एक कंटेनर को लगभग 200 मिलीलीटर आइसोप्रोपैनॉल से भरें और धातु चिमटे का उपयोग करके सूखी बर्फ के साथ शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें। माइक्रोबबल्स को 15 मिनट के लिए चयनित करने के बाद, नमूना शीशी के अंदर चयनित आकार के विभाजन की तलाश करें।
नमूना शीशी को दाईं ओर रखते हुए, ध्यान से नमूना शीशी अनकैप्ड और एक मिलीलीटर प्लास्टिक सिरिंज से जुड़ी १.५ इंच 20 गेज सुई के साथ नीचे विभाजन के बारे में ०.७ मिलीलीटर वापस ले । सुनिश्चित करें कि शीर्ष विभाजन में से कोई भी वापस ले लिया है और हवा की जेब को हटाने के लिए सिरिंज झटका नहीं है । रबर डाट पर केंद्र सर्कल पर लक्ष्य, एक decafluorobutane सीरम शीशी में एक अलग 20 गेज सुई डालें, जबकि सीरम शीशी के शीर्ष के पास सुई रखने के लिए वेंट और फिर आकार चयनित माइक्रोबबल्स के साथ सुई डालें ।
धीरे-धीरे आकार चयनित माइक्रोबबल्स को स्थानांतरित करें। तरल धीरे से डेकाफ्लोरोबुटेन सीरम शीशी की आंतरिक दीवार नीचे स्लाइड करते हैं। एक बार सभी आकार चयनित माइक्रोबबल समाधान स्थानांतरित कर दिया गया है, सिरिंज के साथ सुई को हटा दें, लेकिन नकारात्मक दबाव को दूर करने के लिए वेंटिंग सुई रखें।
स्नान का तापमान शून्य से 15 से शून्य से 17 डिग्री सेल्सियस के बीच है यह सुनिश्चित करने के लिए आइसोप्रोपैनॉल स्नान में सूखी बर्फ या कमरे के तापमान आइसोप्रोपैनॉल की थोड़ी मात्रा जोड़ें। सीरम शीशी के शीर्ष के पास डाली गई 20 गेज वेंटिंग सुई के साथ, सीरम शीशी और आइसोप्रोपैनॉल स्नान रखें, माइक्रोबबल स्तर को आइसोप्रोपैनॉल के स्तर से नीचे रखें, लेकिन इसके ऊपर शीशी गर्दन और रुक-रुक कर माइक्रोबबल्स को गाढ़ा करने के लिए दो मिनट तक सीरम शीशी को घूमता रहा। आइसोप्रोपेनॉल में सीरम शीशी को लगातार न घूमता है और घोल को फ्रीज न होने दें।
लगभग पांच सेकंड तक घूमता है और सीरम शीशी को आइसोप्रोपैनॉल से बाहर उठाएं। बर्फ नाभिक की जांच करें, फिर आइसोप्रोपेनॉल में घूमता हुआ फिर से शुरू करें। यदि बर्फ का निर्माण होता है, तो सीरम शीशी को हवा में तब तक घूमता है जब तक कि यह नष्ट न हो जाए।
दो मिनट के संघनन के बाद आइसोप्रोपेनॉल बाथ से सीरम शीशी निकालें और वेंटिंग सुई को हटा दें। माइक्रोबबल्स को बूंदों में गाढ़ा होना चाहिए जैसा कि पारलेंसी में बदलाव से संकेत मिलता है । सीरम शीशी को पोंछें, इसे लेबल करें, और उपयोग के लिए तैयार होने तक इसे एक अंधेरे अछूता कंटेनर में नियमित बर्फ पर रखें।
एक बरकरार एल्यूमीनियम सील के साथ खुला बूंदों के रूप में लंबे समय के रूप में पिघल बर्फ की जरूरत के रूप में प्रतिस्थापित हो जाता है छह घंटे तक के लिए स्थिर होना चाहिए । उपयोग करने के लिए तैयार होने पर, डिकैपर के साथ एल्यूमीनियम सील हटा दें। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने के बाद, पूर्व-संघनित, आकार चयनित माइक्रोबबल और पोस्ट-कंडेंस्ड बूंदों को 10 माइक्रोन अपर्चर के साथ एक कूल्टर काउंटर पर आकार दिया गया था।
30% पायरो-लिपिड फॉर्मूलेशन के लिए आकार देने का डेटा दिखाया गया है। आकार देने वाले आंकड़ों के आधार पर आंकड़े यहां दिखाए गए हैं । पूर्व और बाद गाढ़ा मतलब व्यास के अनुपात का उपयोग करना, परिणामों से पता चला है कि के रूप में pyro लिपिड सामग्री में वृद्धि हुई, एकाग्रता में कमी आई है, और मतलब व्यास में वृद्धि हुई ।
प्रतिनिधि शोषक 30% पायरो-लिपिड बूंदों के नमूने के माप दिखाए जाते हैं। इससे पता चला कि अक्षुण्ण विधानसभाओं में अलग-अलग अप्रकाशित लिपिड घटकों की तुलना में विभिन्न चोटी से परिलक्षित होते हैं। पूर्व-संघनित माइक्रोबबल के प्रतिनिधि फ्लोरोसेंस माप, 30% पायरो-लिपिड के साथ बाद गाढ़ा बूंदी नमूना यहां दिखाया गया है, बाधित रूप में अक्षुण्ण नमूनों के लिए विभिन्न फ्लोरेसेंस चोटियों का प्रदर्शन।
विभिन्न दबावों पर इमेज किए गए 30% पायरो-लिपिड बूंदों के नमूने के प्रतिनिधि अल्ट्रासाउंड छवियों को दिखाया गया है। कम दबाव पर, आगर संश्लेषण से अटके हवा के बुलबुले से केवल पृष्ठभूमि संकेत देखा गया था। थोड़ी अधिक शक्ति पर, कुछ माइक्रोबबल उत्पन्न हुए थे, जो उज्ज्वल धब्बे की उपस्थिति से प्रदर्शित होते हैं।
दबाव बढ़ने के साथ ही अधिक माइक्रोबबल उत्पन्न हुए। यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि इस विशिष्ट बूंद खोल निर्माण के लिए यहां संघनन तापमान अनुकूलित है। विभिन्न खोल योगों के लिए एक अलग तापमान की आवश्यकता हो सकती है।