Isolering af livmoder medfødte lymfoidceller til analyse af flowcytometri

Vores metode gør det muligt at vurdere sammensætningen og funktionelle egenskaber ved forskellige lymfocytter subpopulationer til stede i livmodervævet hos gravide og ikke-gravide dyr. Denne protokol giver mulighed for isolering af livmoder lymfocytter samtidig bevare overflade udtryk for protein, celle levedygtighed, og funktionalitet. Derfor er det velegnet til en række efterfølgende applikationer.

Foster fjernelse i begyndelsen af eksperimentet og leukocyt indsamling er teknisk udfordrende skridt. Da det er et langvarigt eksperiment, er der behov for særlig opmærksomhed og fokus, når du har nået antistoffarvningstrinnene. Til at begynde med overføre livmoderen væv høstet fra en gravid C57 sort seks kvindelige mus i en steril petriskål, derefter ved hjælp af sterile instrumenter forsigtigt fjerne fedtet omkring vævet, passe på ikke at lade vævet tørre.

Fjern fostrene ved at dissekere hvert implantationssted med sterile instrumenter, og returner derefter livmoderen til det oprindelige fem milliliter samlingsrør, der indeholder en milliliter samlingsmedier. Brug en saks, hakkevævet i opsamlingsrøret, og placer derefter røret i et 37 grader Celsius vandbad. Derefter tilføje tre milliliter af forvarmet enzymatisk fordøjelse mix til røret.

Inkuber røret i 30 minutter ved 37 grader Celsius med agitation for at forbedre den enzymatiske fordøjelsesaktivitet. Når inkubationen er færdig, hvirvle røret, og holde det på is for at hæmme den enzymatiske aktivitet, derefter overføre fordøjelsesvævet i en korrekt mærket 15 milliliter centrifuge rør. Skyl de fem milliliter opsamlingsrør med i alt 10 milliliter iskold fem millimolar EDTA PBS opløsning til at indsamle alle de resterende væv og overføre det til 15 milliliter centrifuge rør.

Centrifuge den fordøjede vævsprøve i 10 minutter ved 400 gange G.Kassér supernatanten, svirp forsigtigt pelleten, og ophængt derefter i 10 milliliter forvarmet fem millimolar EDTA PBS-opløsning. For at reducere celleklumpning inkuberes prøven ved 37 grader Celsius med agitation, efterfulgt af hvirvlen på høj i 10 sekunder. For at fjerne celleklumper i undeassociated væv, placere en 70 mikrometer si oven på en steril 50 milliliter centrifuge rør, derefter ved hjælp af stemplet af en steril en milliliter sprøjte, tvinge fordøjet væv gennem si ind i røret.

Vask si flere gange med i alt 10 milliliter kold PBS at indsamle alle cellerne, derefter tilbringe 50 milliliter centrifuge rør i 10 minutter ved 400 gange G.Efter kassere supernatant, de medfødte lymfoide celler kan isoleres ved hjælp af enten mulighed A eller mulighed B.For mulighed A, resuspend pellet i fem milliliter af 80% isoton per opkald ved hjælp af en pipette voy. Derefter bruger pipetten voy på langsom hastighed, forsigtigt overlejre otte milliliter, 40% pr opkald løsning, på re suspenderet pellet i en 15 milliliter centrifuge rør. Pipette langsomt og kontinuerligt, holde 15 milliliter til omkring en 45 graders vinkel.

Uden at forstyrre overlejringen centrifugere røret i 20 minutter ved 850 gange G med medium acceleration og minimal pauser ved stuetemperatur. Når centrifugeringen er færdig, skal du forsigtigt fjerne røret fra centrifugen uden at forstyrre per call lag. Næste uden at forstyrre ringen af leukocytter på grænsefladen af de to per opkald løsninger, skal du bruge en steril pasteur pipette til at kassere alle undtagen 0,5 til en milliliter af toppen pr opkald lag.

Mens du forsøger at holde mængden af per opkald løsning suget ind i pipetten til et minimum, omhyggeligt indsamle ringen af leukocytter, og overføre cellerne til en ny mærket 15 milliliter centrifuge rør. Tilsæt 10 milliliter sterilt RPMI medium suppleret med 10% varme og aktiveret FBS til cellerne, derefter centrifuge cellerne i fem minutter ved 500 gange G og fire grader Celsius. Kassér supernatanten og fortsæt til røde blodlegemer lysis.

For at isolere cellerne ved hjælp af mulighed B, efter at have passeret det fordøjede væv gennem cellesien og centrifugering af resultatet i celleopse suspension som tidligere påvist, skal du genbruge pelleten med otte milliliter på 35% isotonisk pr. opkald og RPMI-medium og overføre cellerne til et 15 milliliterrør. Centrifuge røret ved 940 gange G i 10 minutter ved stuetemperatur med medium acceleration og minimal pauser. Brug derefter en aspirator eller pipette voy, aspirer supernatanten forsigtigt, før du genopliver pelleten i 14 milliliter RPMI medium suppleret med 10% varme og aktiveret FBS.

Centrifuge prøven igen i fem minutter ved 500 gange G og fire grader Celsius, derefter kassere supernatant ved aspiration og gå videre til røde blodlegemer lysis. For at lyse de røde blodlegemer skal prøven anvendes igen i tre milliliter af en X rød blodlegemers lysopløsning og inkuberes i tre minutter ved stuetemperatur og derefter tilføje 10 milliliter PBS i prøven for at stoppe reaktionen. Centrifugere røret ved 400 gange G i fem minutter efter udsmid supernatanten, tilsæt yderligere 10 milliliter PBS og gentag centrofugering.

Resuspend pellet i en milliliter af RPMI medium suppleret med 10% varme inaktiveret FBS, derefter passere i celle suspension gennem en steril 70 mikrometer celle si. Efter optælling af cellerne justere koncentrationen af celle suspension til en til 2 millioner celler i 100 mikroliter af PBS og gå videre til farvning og facs analyse. Uterine gruppe et ICS omfatter konventionelle NK celler, væv hjemmehørende NK celler, og gruppe et ICS med deres procenter varierende i løbet af livet og graviditeten.

Disse delsæt kan diskrimineres ved hjælp af flowcytometri ved først at gating celler på deres evne til at sprede lys, derefter isolere enkelt buyable CD 45 positive CD 45 positive CD tre negative CD 19 negative celler, og derefter identificere gruppe et ICS, der er NK 1,1 og NKP 46 positive. I gruppe et ICS, CD49A negative EMs positive er konventionelle NK-celler. CD49A positive Ems positive celler er væv hjemmehørende NK celler.

Og CD49 positive Ems negative celler er gruppe et livmoder ILCs. Farvning af milt- og livmoderlymfocytter med anti NK P46 og anti NK 1.1 antistoffer viser, at milten lymfocytter udtrykker større mængder af NKP 46 på deres overflade end deres livmoder modstykke. Ved enzymatisk vævsdesociation kan overflade epitoper ændres afhængigt af de enzymer, der anvendes i fordøjelsesmediet.

For eksempel er farvning til MHC CD49 NKG2A-receptoren dårlig, når liberase TM anvendes. Men fordøjelsen med liberase DH bevarer NKG2A anerkendelse af 1611 antistof klon. Omkring 6,5% af gruppe et ILCs til stede i livmodervæv prøver på svangerskabet dag 8,5 er blod stammer.

Blodforurenende stoffer kan udelukkes gennem intravital farvning med anti CD45 antistoffer konjugeret med et fluorokrom. Når du opretter tid møder, skal du tage i betragtning, at mus er natlige. Derfor bør de sættes op så sent som muligt om eftermiddagen, da parring vil forekomme i løbet af natten.

Også når du vælger kvinder, skal du sikre, at de ikke har en vaginal septum. Vi typisk flow cytometri analyse for at se på mange proteiner på ydersiden af cellerne og i cellerne. Vi gør også nukleinsyre udvinding for at studere genekspression, herunder RNA sekventering.

Og vi også formår at omkring funktionelle assays til at studere svarene fra livmoder medfødte lymfoide celler.