Isolamento delle cellule linfoidi innate uterine per l'analisi mediante citometria a flusso

Il nostro metodo consente di valutare la composizione e le caratteristiche funzionali di diverse sottopopolazioni di linfociti presenti nel tessuto uterino di animali gravidi e non gravidi. Questo protocollo consente l'isolamento dei linfociti uterini preservando l'espressione superficiale delle proteine, la vitalità cellulare e la funzionalità. Pertanto è adatto per una serie di applicazioni successive.

La rimozione del feto all'inizio dell'esperimento e la raccolta dei leucociti sono passaggi tecnicamente impegnativi. Poiché si tratta di un esperimento lungo, è necessaria particolare attenzione e attenzione una volta raggiunti i passaggi di colorazione degli anticorpi. Per iniziare, trasferire il tessuto uterino raccolto da un topo femmina C57 nero sei femmina in una capsula di Petri sterile, quindi utilizzando strumenti sterili rimuovere delicatamente il grasso che circonda il tessuto, facendo attenzione a non lasciare asciugare il tessuto.

Rimuovere i feti sezionando ogni sito di impianto con strumenti sterili, quindi riportare l'utero al suo tubo di raccolta originale di cinque millilitri contenente un millilitro di mezzi di raccolta. Usando le forbici, tritare il tessuto nel tubo di raccolta, quindi posizionare il tubo in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Quindi aggiungere tre millilitri di miscela di digestione enzimatica preriscaldata al tubo.

Incubare il tubo per 30 minuti a 37 gradi Celsius con agitazione per migliorare l'attività di digestione enzimatica. Al termine dell'incubazione, ruotare il tubo e tenerlo sul ghiaccio per inibire l'attività enzimatica, quindi trasferire il tessuto digestivo in un tubo centrifugo da 15 millilitri opportunamente etichettato. Risciacquare il tubo di raccolta da cinque millilitri con un totale di 10 millilitri di soluzione EDTA PBS a cinque millimolari ghiacciati per raccogliere tutto il tessuto rimanente e trasferirlo nel tubo centrifuga da 15 millilitri.

Centrifugare il campione di tessuto digerito per 10 minuti a 400 volte G.Scartare il surnatante, far scorrere delicatamente il pellet e quindi risospeso in 10 millilitri di soluzione EDTA PBS preriscaldata a cinque millimolari. Per ridurre l'aggregazione cellulare, incubare il campione a 37 gradi Celsius con agitazione, seguito da vortice in alto per 10 secondi. Per rimuovere i grumi cellulari nel tessuto non disassociato, posizionare un filtro da 70 micrometri sopra un tubo sterile da 50 millilitri per centrifuga, quindi utilizzare lo stantuffo di una siringa sterile da un millilitro, forzare il tessuto digerito attraverso il filtro nel tubo.

Lavare il colino più volte con un totale di 10 millilitri di PBS freddo per raccogliere tutte le cellule, quindi spendere il tubo della centrifuga da 50 millilitri per 10 minuti a 400 volte G.Dopo aver scartato il surnatante, le cellule linfoidi innate possono essere isolate utilizzando l'opzione A o l'opzione B.Per l'opzione A, risospesere il pellet in cinque millilitri dell'80% isotonico per chiamata usando un voy pipetta. Quindi, utilizzando la pipetta a bassa velocità, sovrapporre con cura otto millilitri, il 40% per soluzione di chiamata, sul pellet risospeso in un tubo di centrifuga da 15 millilitri. Pipettare lentamente e continuamente, tenendo i 15 millilitri a circa un angolo di 45 gradi.

Senza disturbare la sovrapposizione, centrifugare il tubo per 20 minuti a 850 volte G con accelerazione media e pause minime a temperatura ambiente. Una volta completata la centrifugazione, rimuovere con cura il tubo dalla centrifuga senza disturbare gli strati per chiamata. Quindi, senza disturbare l'anello dei leucociti all'interfaccia delle due soluzioni per chiamata, utilizzare una pipetta pasteur sterile per scartare tutti tranne 0,5 a un millilitro dello strato superiore per chiamata.

Mentre si cerca di mantenere al minimo la quantità di soluzione per chiamata aspirata nella pipetta, raccogliere con cura l'anello dei leucociti e trasferire le cellule in un nuovo tubo centrifugo da 15 millilitri etichettato. Aggiungere 10 millilitri di mezzo RPMI sterile integrato con il 10% di calore e FBS attivato alle celle, quindi centrifugare le celle per cinque minuti a 500 volte G e quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e procedere alla lisi dei globuli rossi.

Per isolare le cellule utilizzando l'opzione B, dopo aver fatto passare il tessuto digerito attraverso il filtro cellulare e aver centrifugato il risultato in sospensione cellulare come dimostrato in precedenza, risospesere il pellet con otto millilitri del 35% isotonico per richiamo e mezzo RPMI e trasferire le cellule in un tubo da 15 millilitri. Centrifugare il tubo a 940 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente con accelerazione media e pause minime. Quindi, utilizzando un aspiratore o una pipetta voy, aspirare attentamente il surnatante prima di risospendere il pellet in 14 millilitri di mezzo RPMI integrato con il 10% di calore e FBS attivato.

Centrifugare nuovamente il campione per cinque minuti a 500 volte G e quattro gradi Celsius, quindi scartare il surnatante per aspirazione e procedere alla lisi dei globuli rossi. Per lisare i globuli rossi, risospesciare il campione in tre millilitri di una soluzione lisante dei globuli rossi X e incubare per tre minuti a temperatura ambiente, quindi aggiungere 10 millilitri di PBS nel campione per fermare la reazione. Centrifugare il tubo a 400 volte G per cinque minuti dopo aver scartato il surnatante, aggiungere altri 10 millilitri di PBS e ripetere la centrofugazione.

Risospendare il pellet in un millilitro di mezzo RPMI integrato con FBS inattivato al 10% di calore, quindi passare la sospensione in cella attraverso un filtro cellulare sterile da 70 micrometri. Dopo aver contato le cellule regolano la concentrazione della sospensione cellulare da uno a 2 milioni di cellule in 100 microlitri di PBS e procedono alla colorazione e all'analisi facs. Le ILC del primo gruppo uterino includono cellule NK convenzionali, cellule NK residenti nei tessuti e ILC del gruppo uno con le loro percentuali che variano durante la vita e la gravidanza.

Questi sottoinsiemi possono essere discriminati utilizzando la citometria a flusso prima gating le cellule sulla loro capacità di disperdere la luce, quindi isolando singole cellule CD 45 cd positive CD 19 negative e quindi identificando il gruppo uno ILC che sono NK 1.1 e NKP 46 positivi. All'interno del gruppo uno ILC, cd49A negativo EM positivo sono cellule NK convenzionali. Le cellule CD49A positive Ems positive sono cellule NK residenti nei tessuti.

E le cellule CD49 positive Ems negative sono ILC uterine di gruppo uno. La colorazione dei linfociti splenici e uterini con anticorpi anti NK P46 e anti NK 1.1 mostra che i linfociti splenici esprimono quantità più elevate di NKP 46 sulla loro superficie rispetto alla loro controparte uterina. Nella dissociazione enzimatica dei tessuti, gli epitopi superficiali possono essere alterati a seconda degli enzimi utilizzati nel mezzo di digestione.

Ad esempio, la colorazione per il recettore MHC CD49 NKG2A è scarsa quando si utilizza liberase TM. Tuttavia la digestione con liberase DH preserva il riconoscimento NKG2A da parte del clone di anticorpi 1611. Circa il 6,5% delle ILC del primo gruppo presenti nei campioni di tessuto uterino al giorno di gestazione 8,5 sono derivate dal sangue.

I contaminanti del sangue possono essere esclusi attraverso la colorazione intravitale con anticorpi anti CD45 coniugati con un fluorocromo. Quando si impostano riunioni a tempo, è necessario prendere in considerazione che i topi sono notturni. Pertanto dovrebbero essere impostati il più tardi possibile nel pomeriggio poiché l'accoppiamento avverrà durante la notte.

Anche quando si selezionano le femmine, è necessario assicurarsi che non abbiano un setto vaginale. In genere eseguiamo analisi citometriche a flusso per esaminare molte proteine all'esterno delle cellule e all'interno delle cellule. Facciamo anche l'estrazione di acidi nucleici per studiare l'espressione genica, incluso il sequenziamento dell'RNA.

E riusciamo anche a circa saggi funzionali per studiare le risposte delle cellule linfoidi innate uterine.