3.9K Views
•
09:02 min
•
October 14th, 2021
DOI :
October 14th, 2021
•0:04
Introduction
0:55
Mechanical and Enzymatic Digestion of the Uterus
2:35
Processing of the Uterus into a Single Cell Suspension
5:22
Red Blood Cell Lysis
6:13
Results: FACS Analysis of Innate Lymphoid Cells (ILCs)
8:06
Conclusion
Transcript
Vår metode muliggjør vurdering av sammensetningen og funksjonelle egenskapene til forskjellige lymfocytter subpopulasjoner som er tilstede i livmorvevet til gravide og ikke-gravide dyr. Denne protokollen tillater isolering av livmor lymfocytter samtidig som overflateuttrykk av protein, celle levedyktighet og funksjonalitet bevares. Derfor er den egnet for en rekke påfølgende applikasjoner.
Fetusfjerning i begynnelsen av eksperimentet og leukocyttsamlingen er teknisk utfordrende trinn. Siden det er et langvarig eksperiment, er det nødvendig med spesiell oppmerksomhet og fokus når du har nådd antistofffargingstrinnene. Til å begynne med, overfør livmorvevet høstet fra en gravid C57 svart seks kvinnelig mus til en steril petriskål, og bruk deretter sterile instrumenter forsiktig fjerne fettet rundt vevet, pass på at du ikke lar vevet tørke.
Fjern fostrene ved å dissekere hvert implantasjonssted med sterile instrumenter, og returner deretter livmoren til det opprinnelige fem milliliter oppsamlingsrøret som inneholder en milliliter samlingsmedier. Bruk saks, hakk vevet i oppsamlingsrøret, og legg deretter røret i et 37 grader Celsius vannbad. Deretter legger du til tre milliliter forvarmet enzymatisk fordøyelsesblanding til røret.
Inkuber røret i 30 minutter ved 37 grader Celsius med agitasjon for å forbedre den enzymatiske fordøyelsesaktiviteten. Etter at inkubasjonen er fullført, virvel røret, og hold det på is for å hemme den enzymatiske aktiviteten, og overfør deretter fordøyelsesvevet til et riktig merket 15 milliliter sentrifugerør. Skyll fem milliliter oppsamlingsrør med totalt 10 milliliter iskald fem millimolar EDTA PBS-løsning for å samle alt gjenværende vev og overføre det til 15 milliliter sentrifugerøret.
Sentrifuger den fordøyde vevsprøven i 10 minutter ved 400 ganger G.Kast supernatanten, flikk pellet forsiktig, og deretter resuspendert i 10 milliliter forvarmet fem millimolar EDTA PBS-løsning. For å redusere cellekumping, inkuber prøven ved 37 grader Celsius med agitasjon, etterfulgt av virvel på høyt i 10 sekunder. For å fjerne celleklumper i ikke-tilknyttet vev, plasser en 70 mikrometer sil på toppen av et sterilt 50 milliliter sentrifugerør, og bruk deretter stempelet på en steril en milliliter sprøyte, tving det fordøyde vevet gjennom silen inn i røret.
Vask silen flere ganger med totalt 10 milliliter kald PBS for å samle alle cellene, Deretter bruker du 50 milliliter sentrifugerøret i 10 minutter ved 400 ganger G.Etter å ha kastet supernatanten, kan de medfødte lymfoidcellene isoleres ved hjelp av enten alternativ A eller alternativ B.For alternativ A, resuspender pellet i fem milliliter av 80% isotonisk per samtale ved hjelp av en pipette voy. Deretter bruker pipette voy på langsom hastighet, forsiktig overlegg åtte milliliter, 40% per samtale løsning, på resuspended pellet i en 15 milliliter sentrifuge rør. Pipette sakte og kontinuerlig, holder 15 milliliter til omtrent en 45 graders vinkel.
Uten å forstyrre overlegget, sentrifuger røret i 20 minutter ved 850 ganger G med middels akselerasjon og minimale pauser ved romtemperatur. Når sentrifugeringen er fullført, fjern forsiktig røret fra sentrifugen uten å forstyrre lagene per samtale. Deretter uten å forstyrre ringen av leukocytter ved grensesnittet til de to per samtale-løsningene, bruk en steril pasteurpipette for å kaste alle unntatt 0,5 til en milliliter av toppen per samtalelag.
Mens du prøver å holde mengden per samtale løsning sugd inn i pipetten til et minimum, samle forsiktig ringen av leukocytter, og overfør cellene til et nytt merket 15 milliliter sentrifugerør. Tilsett 10 milliliter sterilt RPMI-medium supplert med 10% varme og aktivert FBS til cellene, og sentrifuger deretter cellene i fem minutter ved 500 ganger G og fire grader Celsius. Kast supernatanten og fortsett til rød blodcellelys.
For å isolere cellene ved hjelp av alternativ B, etter å ha passert det fordøyde vevet gjennom cellesilen og sentrifugerer resultatet i celleoppheng som vist tidligere, resuspenderer pellet med åtte milliliter 35% isotonisk per samtale og RPMI-medium, og overfør cellene til et 15 milliliter rør. Sentrifuger røret ved 940 ganger G i 10 minutter ved romtemperatur med middels akselerasjon og minimale pauser. Deretter bruker du en aspirator eller pipette voy, aspirerer supernatanten forsiktig før du bruker pelletsen i 14 milliliter RPMI-medium supplert med 10% varme og aktivert FBS.
Sentrifuger prøven igjen i fem minutter ved 500 ganger G og fire grader Celsius, kast deretter supernatanten ved aspirasjon og fortsett til røde blodlegemer lysis. For å lyse de røde blodcellene, resuspender prøven i tre milliliter av en X rød blodcelle lysing løsning og inkubere i tre minutter ved romtemperatur, deretter legge til 10 milliliter PBS i prøven for å stoppe reaksjonen. Sentrifuger røret ved 400 ganger G i fem minutter etter at du har kastet supernatanten, tilsett ytterligere 10 milliliter PBS og gjenta sentrofugasjon.
Resuspend pellet i en milliliter RPMI medium supplert med 10% varme inaktivert FBS, deretter passere i celle suspensjon gjennom en steril 70 mikrometer celle sil. Etter å ha talt cellene justerer konsentrasjonen av celleopphenget til en til 2 millioner celler i 100 mikroliter PBS og fortsetter til farging og avføringsanalyse. Livmor gruppe en ILC inkluderer konvensjonelle NK celler, vev bosatt NK celler, og gruppe en ILCs med sine prosenter varierende i løpet av livet og graviditet.
Disse delsettene kan diskrimineres ved hjelp av strømningscytometri ved først å gating celler på deres evne til å spre lys, deretter isolere enkelt kjøpbar CD 45 positiv CD tre negative CD 19 negative celler, og deretter identifisere gruppe en ILCer som er NK 1.1 og NKP 46 positive. Innenfor gruppe én ILCer er CD49A negative EMs positive konvensjonelle NK-celler. CD49A positive Ems positive celler er vev bosatt NK celler.
Og CD49 positive Ems negative celler er gruppe en livmor ILCs. Farging av miltika og livmor lymfocytter med anti NK P46 og anti NK 1,1 antistoffer viser at de miltniske lymfocytter uttrykker høyere mengder NKP 46 på overflaten enn deres livmor motpart. Ved enzymatisk vevsdissosiasjon kan overflateepiller endres avhengig av enzymene som brukes i fordøyelsesmediet.
For eksempel er farging for MHC CD49 NKG2A-reseptoren dårlig når liberase TM brukes. Men fordøyelsen med liberase DH bevarer NKG2A anerkjennelse av 1611 antistoff klone. Rundt 6,5% av gruppe en ILC tilstede i livmor vev prøver på svangerskapet dag 8.5 er blod avledet.
Blodforurensninger kan utelukkes gjennom intravital farging med anti CD45 antistoffer konjugert med fluorokrom. Når du setter opp til tidsmøter, må du ta hensyn til at mus er nattlige. Derfor bør de settes opp så sent som mulig om ettermiddagen, da parring vil skje om natten.
Også når du velger kvinner, må du sørge for at de ikke har vaginal septum. Vi gjør vanligvis strømningscytometrianalyse for å se på mange proteiner på utsiden av cellene og i cellene. Vi gjør også nukleinsyreutvinning for å studere genuttrykk, inkludert RNA-sekvensering.
Og vi klarer også å rundt funksjonelle analyser for å studere svarene til livmor medfødte lymfoide celler.
Dette er en metode for å isolere livmor lymfoide celler fra både gravide og ikke-gravide mus. Denne metoden kan brukes til flere nedstrømsprogrammer som FACS-fenotyping, cellesortering, funksjonelle analyser, RNA-seq og proteomikk. Protokollen her demonstrerer hvordan fenotype gruppe 1 livmor medfødte lymfoide celler ved strømning cytometri.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved