3.9K Views
•
09:02 min
•
October 14th, 2021
DOI :
October 14th, 2021
•0:04
Introduction
0:55
Mechanical and Enzymatic Digestion of the Uterus
2:35
Processing of the Uterus into a Single Cell Suspension
5:22
Red Blood Cell Lysis
6:13
Results: FACS Analysis of Innate Lymphoid Cells (ILCs)
8:06
Conclusion
Transcript
Vår metod möjliggör bedömning av sammansättning och funktionella egenskaper hos olika lymfocyter subpopulationer som finns i livmodern vävnad av gravida och icke-gravida djur. Detta protokoll möjliggör isolering av livmoderns lymfocyter samtidigt bevara ytan uttryck av protein, cellen livskraft och funktionalitet. Därför är den lämplig för en rad efterföljande applikationer.
Fosterborttagning i början av experimentet och leukocytsamlingen är tekniskt utmanande steg. Eftersom det är ett långt experiment behövs särskild uppmärksamhet och fokus när du har nått antikroppsfärgningsstegen. Till att börja med överför livmodervävnaden som skördats från en gravid C57 svart sex kvinnlig mus till en steril petriskål och använd sedan sterila instrument försiktigt ta bort fettet som omger vävnaden och var försiktig så att du inte låter vävnaden torka.
Ta bort fostret genom att dissekera varje implantationsställe med sterila instrument och returnera sedan livmodern till dess ursprungliga fem milliliter insamlingsrör som innehåller en milliliter samlingsmedia. Med hjälp av sax, hacka vävnaden i uppsamlingsröret och placera sedan röret i ett 37 grader Celsius vattenbad. Tillsätt sedan tre milliliter förvärmd enzymatisk matsmältningsblandning till röret.
Inkubera röret i 30 minuter vid 37 grader Celsius med agitation för att förbättra den enzymatiska matsmältningsaktiviteten. När inkubationen är klar, virvla röret och håll det på is för att hämma den enzymatiska aktiviteten och överför sedan matsmältningsvävnaden till ett korrekt märkt 15 milliliter centrifugrör. Skölj uppsamlingsröret på fem milliliter med totalt 10 milliliter iskall EDTA PBS-lösning för att samla upp all återstående vävnad och överföra den till 15 ml centrifugröret.
Centrifugera det smälta vävnadsprovet i 10 minuter vid 400 gånger G.Kassera supernatanten, snärta försiktigt pelleten och sedan återanvändas i 10 ml förvärmd fem millimolär EDTA PBS-lösning. För att minska cellklumpning, inkubera provet vid 37 grader Celsius med agitation, följt av virvel på hög i 10 sekunder. För att avlägsna cellklumpar i oassocierad vävnad, placera en 70 mikrometer sil ovanpå ett sterilt 50 milliliter centrifugrör och använd sedan kolven på en steril en milliliter spruta, tvinga den smälta vävnaden genom silen in i röret.
Tvätta silen flera gånger med totalt 10 milliliter kall PBS för att samla alla celler och spendera sedan 50 ml centrifugrör i 10 minuter vid 400 gånger G.Efter att ha kasserat supernatanten kan de medfödda lymfoida cellerna isoleras med antingen alternativ A eller alternativ B.För alternativ A, återanvänd pelleten i fem milliliter på 80% isotonic per samtal med hjälp av en pipett voy. Använd sedan pipett voy på långsam hastighet, försiktigt överlagra åtta milliliter, 40% per samtalslösning, på den återsuspenderade pelleten i ett 15 milliliter centrifugrör. Pipetten sakta och kontinuerligt och håll 15 ml i ca 45 graders vinkel.
Utan att störa överlägget, centrifugera röret i 20 minuter vid 850 gånger G med medelacceleration och minsta brott vid rumstemperatur. När centrifugeringen är klar, ta försiktigt bort röret från centrifugen utan att störa lagren per anrop. Använd sedan en steril pastörpipett för att kassera alla utom 0,5 till en milliliter av det övre lagret per anropslager utan att störa ringen av leukocyter vid gränssnittet mellan de två lösningarna per samtal.
Medan du försöker hålla mängden per samtalslösning som sugs in i pipetten till ett minimum, samla försiktigt in ringen av leukocyter och överför cellerna till ett nytt märkt 15 milliliter centrifugrör. Tillsätt 10 milliliter sterilt RPMI-medium kompletterat med 10% värme och aktiverad FBS till cellerna, centrifugera sedan cellerna i fem minuter vid 500 gånger G och fyra grader Celsius. Kassera supernatanten och fortsätt till röd blodcelllys.
För att isolera cellerna med hjälp av alternativ B, efter att ha passerat den smälta vävnaden genom cellsilen och centrifugerat resultatet i cellfjädring som visats tidigare, återanvänd pelleten med åtta milliliter på 35% isotonic per samtal och RPMI-medium och överför cellerna till ett 15 milliliter rör. Centrifugera röret vid 940 gånger G i 10 minuter vid rumstemperatur med medelacceleration och minsta pauser. Använd sedan en aspirator eller pipett voy, aspirera supernatanten försiktigt innan du återanvänder pelleten i 14 milliliter RPMI-medium kompletterat med 10% värme och aktiverad FBS.
Centrifugera provet igen i fem minuter vid 500 gånger G och fyra grader Celsius, kassera sedan supernatanten genom aspiration och fortsätt till röd blodcelllys. För att lysera de röda blodkropparna, återanvänd provet i tre milliliter av en X röd blodcellslyssationslösning och inkubera i tre minuter vid rumstemperatur och tillsätt sedan 10 milliliter PBS i provet för att stoppa reaktionen. Centrifugera röret vid 400 gånger G i fem minuter efter att supernatanten kasserats, tillsätt ytterligare 10 ml PBS och upprepa centrofugation.
Återanvänd pelleten i en milliliter RPMI-medium kompletterat med 10% värme inaktiverad FBS och passera sedan incellsupphängningen genom en steril 70 mikrometer cellsil. Efter att ha räknat cellerna justera koncentrationen av cell suspensionen till en till 2 miljoner celler i 100 mikroliter PBS och fortsätt till färgning och facs analys. Livmodergrupp 1 IBC inkluderar konventionella NK-celler, vävnadsboende NK-celler och grupp ett-ICS med deras procentandelar som varierar under liv och graviditet.
Dessa delmängder kan diskrimineras med hjälp av flödescytometri genom att först gating celler på deras förmåga att sprida ljus, sedan isolera en enda köpbar CD 45 positiva CD tre negativa CD 19 negativa celler, och sedan identifiera grupp ett IKU: er som är NK 1.1 och NKP 46 positiva. Inom grupp ett IBC är CD49A negativa EMs positiva konventionella NK-celler. CD49A positiva Ems positiva celler är vävnad bosatta NK celler.
Och CD49 positiva Ems negativa celler är grupp ett livmoderns ICS. Färgning av mjälte- och livmoderlymfocyter med anti NK P46 och anti NK 1.1 antikroppar visar att de mjälteiska lymfocyterna uttrycker högre mängder NKP 46 på ytan än deras livmodermotsvarighet. Vid enzymatisk vävnadsavsociation kan ytepileptoper ändras beroende på de enzymer som används i matsmältningsmediet.
Till exempel är färgning för MHC CD49 NKG2A-receptorn dålig när liberas TM används. Matsmältning med liberase DH bevarar dock NKG2A erkännande av 1611 antikropp klon. Omkring 6,5% av grupp ett INC som finns i livmoderns vävnadsprover på graviditetsdag 8,5 är blod härledda.
Blodföroreningar kan uteslutas genom intravital färgning med anti CD45 antikroppar konjugerade med en fluorokrom. När du ställer in för tidsmöten måste du ta hänsyn till att möss är nattliga. Därför bör de ställas in så sent som möjligt på eftermiddagen eftersom parning kommer att ske under natten.
Även när du väljer kvinnor måste du se till att de inte har en vaginal septum. Vi gör vanligtvis flödescytometrianalys för att titta på många proteiner på utsidan av cellerna och i cellerna. Vi gör också nukleinsyra extraktion för att studera genuttryck, inklusive RNA sekvensering.
Och vi lyckas också kringgå funktionella analyser för att studera svaren från livmoderns medfödda lymfoida celler.
Detta är en metod för att isolera livmoder lymfoida celler från både gravida och icke-gravida möss. Denna metod kan användas för flera nedströms applikationer såsom FACS-fenotypning, cellsortering, funktionella analyser, RNA-seq och proteomik. Protokollet här visar hur man fenotyp grupp 1 livmoderns medfödda lymfoida celler efter flöde cytometri.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved