Name: capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange for conformational characterization of proteins with top-down mass spectrometry
Uploaded: 2021-06-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من خلال منح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NSFC 21974069). وتلقى المؤلفون أيضا دعما من معهد تحليل الخلايا، مختبر خليج شنتشن، الصين؛ مركز جيانغسو للابتكار التعاوني للمواد الوظيفية الطبية الحيوية ؛ ومختبر جيانغسو الرئيسي للمواد الطبية الحيوية في جامعة نانجينغ نورمال ، الصين.

ملاحظة: استخدم كواشف الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) أو الكواشف ذات درجة MS كلما أمكن ذلك لتقليل الملوثات التي قد تتداخل مع تحليل التصلب المتعدد. لا تلمس واجهة CE-MS بأيدي عارية أثناء القياس لتجنب احتمال حدوث صدمة كهربائية ناجمة إما عن الجهد الكهربائي أو جهد الرش الكهربائي.
<p class="j...

<ol>
	<li>Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+methods+in+characterization+of+the+higher+order+structure+of+protein+therapeutics.">Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169 (2020).</li><li>Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry.">Developments in hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 93 (1), 567-582 (2021).</li><li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformer-specific+hydrogen+exchange+analysis+of+Abeta(1-42)+oligomers+by+top-down+electron+capture+dissociation+mass+spectrometry.">Conformer-specific hydrogen exchange analysis of Abeta(1-42) oligomers by top-down electron capture dissociation mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 83 (13), 5386-5393 (2011).</li><li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+small+soluble+Abeta(1-40)+oligomers+studied+by+top-down+hydrogen+exchange+mass+spectrometry.">Structure and dynamics of small soluble Abeta(1-40) oligomers studied by top-down hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Biochemistry. 51 (17), 3694-3703 (2012).</li><li>Pan, J., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+structural+analysis+of+posttranslationally+modified+proteins+by+Fourier+transform+ion+cyclotron+resonance-MS+with+hydrogen/deuterium+exchange+and+electron+capture+dissociation.">Top-down structural analysis of posttranslationally modified proteins by Fourier transform ion cyclotron resonance-MS with hydrogen/deuterium exchange and electron capture dissociation.</a> Proteomics. 13 (6), 974-981 (2013).</li><li>Wang, G., Abzalimov, R. R., Bobst, C. E., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformer-specific+characterization+of+nonnative+protein+states+using+hydrogen+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Conformer-specific characterization of nonnative protein states using hydrogen exchange and top-down mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United. States of America. 110 (50), 20087-20092 (2013).</li><li>Mironov, G. G., Clouthier, C. M., Akbar, A., Keillor, J. W., Berezovski, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+enzyme+structure+and+activity+by+kinetic+capillary+electrophoresis-MS.">Simultaneous analysis of enzyme structure and activity by kinetic capillary electrophoresis-MS.</a> Nature Chemical Biology. 12 (11), 918-922 (2016).</li><li>Shen, Y., Zhao, X., Wang, G., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+hydrogen/deuterium+exchange+during+proteoform+separation+enables+characterization+of+conformational+differences+between+coexisting+protein+states.">Differential hydrogen/deuterium exchange during proteoform separation enables characterization of conformational differences between coexisting protein states.</a> Analytical Chemistry. 91 (6), 3805-3809 (2019).</li><li>Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invited+review:+&#946;-lactoglobulin:+binding+properties,+structure,+and+function.">Invited review: &#946;-lactoglobulin: binding properties, structure, and function.</a> Journal of Dairy Science. 87 (4), 785-796 (2004).</li><li>Qin, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+Tanford+transition+of+bovine+&#946;-lactoglobulin.">Structural basis of the Tanford transition of bovine &#946;-lactoglobulin.</a> Biochemistry. 37 (40), 14014-14023 (1998).</li><li>Qin, B. Y., Bewley, M. C., Creamer, L. K., Baker, E. N., Jameson, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+implications+of+structural+differences+between+variants+A+and+B+of+bovine+beta-lactoglobulin.">Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin.</a> Protein Science. 8 (1), 75-83 (1999).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+capillary+isoelectric+focusing+mass+spectrometry+analysis+of+peptides,+proteins,+and+monoclonal+antibodies+with+a+flow-through+microvial+interface.">High resolution capillary isoelectric focusing mass spectrometry analysis of peptides, proteins, and monoclonal antibodies with a flow-through microvial interface.</a> Analytical Chemistry. 90 (15), 9495-9503 (2018).</li><li>Busch, M. H. A., Kraak, J. C., Poppe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+acetate-coated+fused-silica+capillaries+for+the+separation+of+proteins+by+capillary+zone+electrophoresis.">Cellulose acetate-coated fused-silica capillaries for the separation of proteins by capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography A. 1695 (2), 287-296 (1995).</li><li>Zhao, X., Shen, Y., Tong, W., Wang, G., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deducing+disulfide+patterns+of+cysteine-rich+proteins+using+signature+fragments+produced+by+top-down+mass+spectrometry.">Deducing disulfide patterns of cysteine-rich proteins using signature fragments produced by top-down mass spectrometry.</a> Analyst. 143 (4), 817-823 (2018).</li><li>Sutera, S. P., Skalak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+Poiseuille's+law.">The history of Poiseuille's law.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 25 (1), 1-20 (1993).</li><li>Wang, G., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+characterization+of+the+higher+order+structure+of+disulfide-containing+proteins+using+hydrogen/deuterium+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).</li><li>Wang, G., Johnson, A. J., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+electrospray+ionization+mass+spectrometry+as+a+tool+for+characterization+of+small+soluble+protein+aggregates.">Evaluation of electrospray ionization mass spectrometry as a tool for characterization of small soluble protein aggregates.</a> Analytical Chemistry. 84 (3), 1718-1724 (2012).</li><li>Fellers, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProSight+Lite:+graphical+software+to+analyze+top-down+mass+spectrometry+data.">ProSight Lite: graphical software to analyze top-down mass spectrometry data.</a> Proteomics. 15 (7), 1235-1238 (2015).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MASH+Suite+Pro:+A+comprehensive+software+tool+for+top-down+proteomics.">MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 15 (2), 703-714 (2016).</li><li>Paterson, G. R., Hill, J. P., Otter, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+&#946;-lactoglobulin+A,+B+and+C+variants+of+bovine+whey+using+capillary+zone+electrophoresis.">Separation of &#946;-lactoglobulin A, B and C variants of bovine whey using capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography A. 700 (1), 105-110 (1995).</li><li>Wang, G., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+characterization+of+the+higher+order+structure+of+disulfide-containing+proteins+using+hydrogen/deuterium+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).</li><li>Nicolardi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-line+electrochemical+reduction+of+disulfide+bonds:+improved+FTICR-CID+and+-ETD+coverage+of+oxytocin+and+hepcidin.">On-line electrochemical reduction of disulfide bonds: improved FTICR-CID and -ETD coverage of oxytocin and hepcidin.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (12), 1980-1987 (2013).</li><li>Adhikari, S., Xia, Y., McLuckey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+analysis+of+disulfide-linked+proteins+using+photoinduced+radical+reactions+and+ET-DDC.">Top-down analysis of disulfide-linked proteins using photoinduced radical reactions and ET-DDC.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 444, 116173 (2019).</li><li>Rush, M. J. P., Riley, N. M., Westphall, M. S., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+characterization+of+proteins+with+intact+disulfide+bonds+using+activated-ion+electron+transfer+dissociation.">Top-down characterization of proteins with intact disulfide bonds using activated-ion electron transfer dissociation.</a> Analytical Chemistry. 90 (15), 8946-8953 (2018).</li><li>Zhong, X., Maxwell, E. J., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transport+in+a+micro+flow-through+vial+of+a+junction-at-the-tip+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry+interface.">Mass transport in a micro flow-through vial of a junction-at-the-tip capillary electrophoresis-mass spectrometry interface.</a> Analytical Chemistry. 83 (12), 4916-4923 (2011).</li></ol>

تشمل أهداف طلاء الجدار الداخلي للشعيرات الدموية CE تقليل التدفق الكهرواسمي وامتصاص البروتين أثناء عملية CE13. على الرغم من أن التدفق الكهرواسموزي مفيد لتحليل CE التقليدي للجزيئات الصغيرة بسبب قدرته على دفع الأنواع المحايدة أو المشحونة بشكل معاكس إلى الكاشف ، إلا أنه يعرض للخطر ...

إن التمييز بين أنواع البروتين في حالات مختلفة من التشكيل أو الارتباط أو التعديل وتوصيف اختلافاتها الهيكلية أمر مهم لرصد مسارات التحولات بين هذه الأنواع المشاركة في الأحداث البيولوجية ، بدءا من التعرف الجزيئي إلى التحفيز الأنزيمي ، وفهم الآليات الكامنة وراء هذه الأحداث. لا توفر التقنيات الفيزيائية الحيوية التقليدية حلا كاملا بسبب القيود مثل عدم كفاية الدقة وفقدان المعلومات الديناميكية في الحل. تبادل الهيدروجين / الديوتيريوم إلى جانب قياس الطيف الكتلي (HDX MS) هو تقنية تصف السمات الهيكلية والتوافقية للبروتينات مع الديوتيريوم (2 H) عن طريق التبادل بين ذرات الهيدروجين الشفوية للبروتينات و 2 H من محلول 2 H 2O الذي تمإدخاله عمدا. البروتونات المشاركة في الترابط الهيدروجيني أو التي يتم عزلها عن المذيب في داخل البروتين لا تتبادل بسهولة1. وبالتالي ، نظرا لأن سعر الصرف في موقع قابل للتبادل يعتمد بشكل كبير على مشاركته في هياكل أعلى ترتيبا ، يمكن الكشف عن هياكل البروتين بدقة مكانية عالية بواسطة MS الذي يسبر مدى ومعدل امتصاص 2 H بناء على الكتل الذرية المختلفة بين 1H و 2H. على مدى العقود الأخيرة ، أصبح HDX MS تقنية ناجحة بشكل رائع لدراسة تشكيلات البروتين وديناميكياته2.
في النهج الكلاسيكي من أسفل إلى أعلى ل HDX MS ، يتم بروتينية مجموعة أنواع البروتين في حالات مختلفة من التشكيل أو الارتباط أو التعديل دون فصل على مستوى البروتين السليم ، مما يجعل من غير الممكن توصيف الأنواع الفردية من خلال تحليل شظايا التحلل البروتيني الناتجة مع محتويات الديوتيريوم المعقدة. في المقابل، في النهج من أعلى إلى أسفل، تؤدي حالات البروتين المختلفة أو الأشكال البروتينية التي تضمنت محتويات مختلفة من الديوتيريوم إلى توزيعات متعددة لكتل البروتين السليمة في فحص التصلب المتعدد. وهذا يسمح بفصل الأنواع الفردية عن طريق اختيار كتلة الأيونات المقابلة لكل توزيع كتلي باستخدام مرشح كتلة مناسب (مثل رباعي) وتوصيف اختلافاتها التوافقية في تحليل MS الترادفي اللاحق 3,4,5,6. ومع ذلك ، فإن كفاءة فصل حالات البروتين أو البروتيوفورمات في هذه الاستراتيجية محدودة بمدى الاختلاف في توزيعات الكتلة المقابلة لها.
يوفر الرحلان الكهربائي الشعري (CE) وسيلة لفصل أنواع البروتين بناء على شحناتها المختلفة وأحجامها الهيدروديناميكية في مرحلة الحل بكفاءة عالية7. الجمع بين CE و HDX يوفر فصلا إضافيا لحالات البروتين أو البروتيوفورمات في مرحلة الحل. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح الحجم الصغير للشعيرات الدموية CE باستخدام محلول متحلل بالكامل كمحلول إلكتروليت في الخلفية (BGE) ، أي المخزن المؤقت الجاري ، مما يجعل الشعيرات الدموية كمفاعل HDX لعينات البروتين. نظرا للاختلاف في التنقل الكهربائي بين البروتينات والكواشف البروتيكية في عملية الرحلان الكهربائي ، فإن إجراء HDX خلال CE يؤدي إلى بيئة تثنية كاملة تقريبا لتحليلات البروتين مع الحد الأدنى من المحتويات المتبقية غير المثنية ، وبالتالي تعزيز حساسية التحليل الهيكلي باستخدام بيانات HDX. على هذا النحو ، قمنا بتطوير نهج HDX التفاضلي القائم على CE إلى جانب MS من أعلى إلى أسفل لتوصيف هياكل البروتين ذات الترتيب الأعلى بطريقة خاصة بالحالة أو البروتيوفورم8.
تصف هذه الورقة بروتوكولات هذا النهج من خلال تفصيل خطوات إعداد المواد والإجراءات التجريبية وتحليل البيانات. يتم سرد العوامل التي قد تؤثر على أداء الطريقة أو جودة البيانات في ملاحظات قصيرة. تشمل النتائج التمثيلية المعروضة هنا بيانات HDX التفاضلية لمخاليط البروتينات المختلفة والمتغيرات الطبيعية للبلورة البقرية β-lactoglobulin (β-lg) ، وهو بروتين مصل اللبن الرئيسي الموجود في الحليب9. نحن نظهر كفاءة الفصل ، وقابلية التكرار ، وأداء وضع العلامات H 2للمتغيرين الوفيرين من β-lg ، أي A و B10,11 خلال HDX القائم على CE والتوصيف الخاص بالمتغيرات لتشكيلاتهما.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ammonium acetate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A/3446/50</td>
			<td>&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI 8000 plus capillary electrophoresis system</td>
			<td>Sciex, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5406000097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal filter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC201024</td>
			<td>10 kDa cutoff</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deuterium oxide</td>
			<td>Energy Chemical</td>
			<td>E090001</td>
			<td>99.9 % D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formic acid</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>&#160;270480250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fused silica glass capillary</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150017</td>
			<td>ID 50&#956;m, OD 360&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gas chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>GC6890N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydroxypropyl cellulose</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>H113415</td>
			<td>MW 100000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stirrers</td>
			<td>DLAB</td>
			<td>8030101212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A456-4</td>
			<td>MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microvolume UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>84677JK7731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myoglobin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td colspan="2">Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive UHMR mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium&#160;hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ubiquitin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U6253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasonicator</td>
			<td>SCIENTZ</td>
			<td>SB-5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-lactoglobulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L0130</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange for conformational characterization of proteins with top-down mass spectrometry

لا يزال حل عدم التجانس التوافقي لحالات البروتين المتعددة التي تتعايش في المحلول أحد العقبات الرئيسية في توصيف علاجات البروتين وتحديد مسارات الانتقال التوافقية الحاسمة للوظائف البيولوجية ، بدءا من التعرف الجزيئي إلى التحفيز الإنزيمي. يوفر تفاعل تبادل الهيدروجين / الديوتيريوم (HDX) إلى جانب التحليل الطيفي الكتلي من أعلى إلى أسفل (MS) وسيلة لتوصيف هياكل وديناميكيات البروتين ذات الترتيب الأعلى بطريقة مطابقة محددة. تعتمد قوة الحل التوافقية لهذه التقنية بشكل كبير على كفاءة فصل حالات البروتين على مستوى البروتين السليم وتقليل المحتوى البروتيكي المتبقي غير المثني أثناء تفاعلات HDX. 
هنا نصف متغيرا قائما على الرحلان الكهربائي الشعري (CE) لنهج HDX MS الذي يهدف إلى تحسين الدقة المطابقة. في هذا النهج ، تخضع البروتينات لتفاعلات HDX أثناء الهجرة عبر محلول إلكتروليت الخلفية المحايد (BGE) أثناء الفصل الكهربائي الشعري. يمكن فصل حالات البروتين المختلفة أو الأشكال البروتينية التي تتعايش في المحلول بكفاءة بناء على نسب الشحن إلى الحجم المختلفة. الفرق في الحركة الكهربية بين البروتينات وجزيئات المذيبات البروتيكية يقلل من المذيب المتبقي غير المخصي ، مما يؤدي إلى بيئة تثنية كاملة تقريبا أثناء عملية HDX. تسمح واجهة CE-MS المتدفقة عبر الميكروفيال بالتأين الكهربائي الفعال لأنواع البروتين المنتفخة بعد الخلط السريع مع محلول معدل التبريد وتغيير الطبيعة عند مخرج البخاخ. يقيس تحليل التصلب المتعدد عبر الإنترنت من أعلى إلى أسفل مستوى التثدي العالمي لأنواع البروتين السليمة التي تم التخلص منها ، وبالتالي إزالة خصاء شظاياها في الطور الغازي. توضح هذه الورقة هذا النهج في HDX التفاضلي للأنظمة ، بما في ذلك متغيرات البروتين الطبيعي التي تتعايش في الحليب.

يسمح تغيير ضغط التسريب ل BGE بتعديل كل من كفاءة الفصل ووقت الهجرة ، وهو ما يعادل وقت تفاعل HDX للبروتينات المراد فصلها (الشكل 3). يؤدي انخفاض ضغط التسريب إلى فصل أفضل لقمم CE على حساب مدة التجربة (الشكل 3A). يؤدي وقت تفاعل الهجرة / HDX الأطول إلى مستوى أعلى من إزالة ال?...

Watch this Scientific Journal Video about Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry at JoVE.com

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

يظهر هنا بروتوكول لنهج تبادل الهيدروجين / الديوتيريوم (HDX) القائم على الرحلان الكهربائي الشعري إلى جانب قياس الطيف الكتلي من أعلى إلى أسفل. يميز هذا النهج الفرق في الهياكل ذات الترتيب الأعلى بين أنواع البروتين المختلفة ، بما في ذلك البروتينات في حالات مختلفة وأشكال بروتينية مختلفة ، من خلال إجراء فصل HDX التفاضلي المتزامن والفصل الكهربائي.

تبادل الهيدروجين / الديوتيريوم القائم على الرحلان الكهربائي الشعري للتوصيف التوافقي للبروتينات باستخدام مطياف الكتلة من أعلى إلى أسفل

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

تسمح هذه الطريقة بفصل أنواع البروتين المتعايشة ، بما في ذلك المطابقات أو المتغيرات المختلفة والتوصيف عبر الإنترنت لاختلافات هيكلها الأعلى ترتيبا ليتم إكمالها في قياس CEMS واحد. وهو يستخدم التأثير الكهربائي لتوفير بيئة مدتها 100٪ تقريبا لتفاعلات HDX والفصل المتعامد لأنواع البروتين المتعايشة أثناء HDX لتحليل MS من أعلى إلى أسفل. ابدأ بالتكييف المسبق للرحلان الكهربائي الشعري أو تبادل الديوتيريوم الهيدروجيني أو إعداد CE HDX.باستخدام الموجات فوق الصوتية في خليط من 50٪ ميثانول و 49٪ ماء و 1٪ حمض الفورميك ، قم بتنظيف التدفق من خلال واجهة CE-MS الدقيقة لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. قم بتركيب الشعيرات الدموية المعدلة HPC على أداة الكهربية الشعرية أو أداة CE. شطف الشعيرات الدموية بمحلول إلكتروليت الخلفية أو BGE لمدة 10 دقائق باستخدام جهاز أخذ العينات التلقائي واتركه ممتلئا ب BGE.استخدم طولا مناسبا من أنابيب الشعيرات الدموية غير المنصهرة غير المعدلة كأنابيب ضخ لمحلول المعدل. استخدم اتحادا وأكماما مناسبة لتوصيل أنبوب المعدل بحقنة زجاجية محكمة الإغلاق تعمل بالغاز مع درجة حرارة حادة وشطف الأنابيب بمحلول المعدل لمدة 10 دقائق على الأقل باستخدام مضخة تسريب. أدخل منافذ أنابيب CE الشعرية والمعدلة المشفرة من HPC المحملة بالحلول المقابلة في واجهة CE-MS التي تم تنظيفها.تقدم المحقنة باستخدام مضخات التسريب بحيث يصل محلول المعدل إلى طرف الواجهة. قم بتركيب واجهة CE-MS المجمعة على مصدر تأين رذاذ الإلكترون النانوي لمقياس الطيف الكتلي. قم بتطبيق جهد رذاذ من 3-5 كيلوفولت على واجهة CE-MS.قم ببث محلول المعدل مع مضخة المنقوع بمعدل تدفق يتراوح بين 0.1-10 ميكرولتر في الدقيقة وتأكد من وجود رذاذ كهربائي مستقر عند طرف واجهة CE-MS. ضع قارورة العينة التي تحتوي على BGE وجهاز أخذ العينات التلقائي ، والتي سيتم استخدامها لاحقا للحصول على الكهروفيروجات الكهربائية الفارغة وأطياف الكتلة الفارغة. تقدير حجم الحقن باستخدام العلاقة بين حجم الحقن ومعلمات الحقن.وحقن محلول العينة باستخدام جهاز أخذ العينات التلقائي في اثنين من PSI لمدة مناسبة. ابدأ فصل CE عن طريق تطبيق جهد كهربائي يبلغ 20 كيلوفولت في ضغط تسريب يتراوح من 0-2 رطل لكل بوصة مربعة والحصول على مخطط كهربائي. وفي الوقت نفسه ، احصل على بيانات MS في الوضع الكروماتوغرافي حيث يتم الحصول على الرسم البياني للتيار الأيوني كدالة للوقت ولا يتم دمج عمليات مسح MS المقابلة تلقائيا في طيف واحد.احفظ مخطط الفيروغرام الكهربائي الفارغ وأطياف الكتلة كمراجع. ضع قوارير العينة التي تحتوي على التركيزات المطلوبة من محاليل عينات البروتين في جهاز أخذ العينات التلقائي واحصل على أطياف الكهربية و MS1 لأنواع البروتين المنفصلة كهربائيا والديوتيريوم. قم بإجراء قياسات Ms.Measurements جنبا إلى جنب للأنواع ذات الأهمية ، إما بعد الحصول على أطياف MS1 داخل نفس التشغيل أو في تشغيل منفصل لاحق.بعد كل قياس، اغسل الشعيرات الدموية باستخدام BGE عند ضغط 20 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 10 دقائق على الأقل. تنظيف واجهة CEMS وجميع الأنابيب للتخزين عند الانتهاء من التجارب. احصل على مجموعة بيانات من عينة نقطة نهاية HDX باستخدام MS في وضع التسريب المباشر.أدى انخفاض ضغط التسريب إلى فصل أفضل لقمم CE ، ولكنه أدى إلى زيادة في كل من وقت الهجرة ومدة التجربة. أدى وقت تفاعل HDX الأطول إلى مستوى أعلى من انخفاض مدة تحليلات البروتين. أدى التباين A و B في الغلوبولين المناعي بيتا أو بيتا IG ، اللذان يختلفان باثنين فقط من بقايا الأحماض الأمينية في تسلسلهما ، إلى ظهور قمتين منفصلتين بشكل كاف في مخطط الكهربية المشتق من EIC.أدى التباين التفاضلي المسمى بالديوتيريوم إلى توزيع كتلة متميزة للأيونات. وقد لوحظ وجود عدد أقل في الوفرة النسبية لأيونات Z من أيونات C بسبب الارتباط الفريد غير المستقر في تأكيد بيتا IG الذي يحد من كفاءة التجزئة بين CS 82 و CS 176. تظهر معظم أيونات الشظايا المنتجة من بيتا IGA ، وبيتا IGB مدى مماثل من امتصاص الديوتيريوم.ومع ذلك ، تم تخفيض الأجزاء الأكبر التي تغطي مواقع تباين التسلسل من بيتا IGA إلى حد أكبر بكثير من بيتا IGB. يتم ضبط الرقم الهيدروجيني ل BGE وفقا للنقطة المتساوية الكهربية للعينة لمنع تراكم البروتين وتسهيل الفصل مع الحفاظ على المجمع.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Chemistry

Unit 1

Principles of Mass Spectrometry

SCIENTISTS IN ACTION

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

تحليل ديناميات البروتين عن طريق صرف الهيدروجين الطيف الكتلي

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Submillisecond بتكوين جزئي التغييرات في البروتينات حلها بواسطة شعاع ضوحراري الإمالة

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

تصور المحيطة الطيف الكتلي مع استخدام انعراجي التصوير الفوتوغرافي

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

مقايسة HS-الآلية للتحديد الكمي لبروتينات الخلية المضيفة في صيدلية البروتين اللوني السائل أيون التنقل قطوف الطيف الكتلي

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

ميكروبروبي الشعرية التفريد قياس الطيف الكتلي لجميع الخلايا المفردة في أجنة "الضفادع يعيش" (ليفيس النمو)

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometry

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometry

توصيف البوليمرات الاصطناعية عن طريق مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز التأين وقت الرحلة (استخدام-TOF) الطيف الكتلي

There are many techniques that can be employed in the characterization of synthetic homopolymers, but few provide as useful of information for end group ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

البروتيوميات من أعلى إلى أسفل على نطاق واسع باستخدام المنطقة الشعرية التفريد جنبا إلى جنب الكتلي

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

مراقبة المخدرات الفائق وشاملة باستخدام مولتيسيجمينت الشعرية حقن التفريد الكتلي

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III))

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry CE-ICP-MS for Quantification of Iron Redox Species FeII, FeIII

إعداد الترافيسيرات الشعرية -البلازما المقترنة الاستقرائي الطيف الطيفي (CE-ICP-MS) لقياس كمية من أنواع الأكسدة الحمراء الحديد (Fe(II), Fe(III))

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

نهج قياس الطيف الكتلي للكهربائية الشعرية لتوصيف البروتين والايض كورونا المكتسبة من المواد النانوية

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...