Name: capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange for conformational characterization of proteins with top-down mass spectrometry
Uploaded: 2021-06-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (NSFC 21974069). Forfatterne modtog også støtte fra Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, Kina; Jiangsu Collaborative Innovation Center for Biomedicinske Funktionelle Materialer; og Jiangsu Key Laboratory of Biomedical Materials ved Nanjing Normal University, Kina.

BEMÆRK: Brug højtydende væskekromatografi (HPLC) kvalitet eller MS-kvalitet reagenser, når det er muligt for at minimere de forurenende stoffer, der kan forstyrre MS-analysen. Rør ikke CE-MS-grænsefladen med bare hænder under målingen for at undgå muligheden for elektrisk stød forårsaget af enten elektroforetisk spænding eller elektrosprayspænding.
1. Forberedelse af materiale
<ol><li>Ændring af smeltet silicakapillær til CE<ol>
<li>En opløsning af 5 % hydroxypropylcellulose ...

<ol>
	<li>Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+methods+in+characterization+of+the+higher+order+structure+of+protein+therapeutics.">Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169 (2020).</li><li>Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry.">Developments in hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 93 (1), 567-582 (2021).</li><li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformer-specific+hydrogen+exchange+analysis+of+Abeta(1-42)+oligomers+by+top-down+electron+capture+dissociation+mass+spectrometry.">Conformer-specific hydrogen exchange analysis of Abeta(1-42) oligomers by top-down electron capture dissociation mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 83 (13), 5386-5393 (2011).</li><li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+small+soluble+Abeta(1-40)+oligomers+studied+by+top-down+hydrogen+exchange+mass+spectrometry.">Structure and dynamics of small soluble Abeta(1-40) oligomers studied by top-down hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Biochemistry. 51 (17), 3694-3703 (2012).</li><li>Pan, J., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+structural+analysis+of+posttranslationally+modified+proteins+by+Fourier+transform+ion+cyclotron+resonance-MS+with+hydrogen/deuterium+exchange+and+electron+capture+dissociation.">Top-down structural analysis of posttranslationally modified proteins by Fourier transform ion cyclotron resonance-MS with hydrogen/deuterium exchange and electron capture dissociation.</a> Proteomics. 13 (6), 974-981 (2013).</li><li>Wang, G., Abzalimov, R. R., Bobst, C. E., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformer-specific+characterization+of+nonnative+protein+states+using+hydrogen+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Conformer-specific characterization of nonnative protein states using hydrogen exchange and top-down mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United. States of America. 110 (50), 20087-20092 (2013).</li><li>Mironov, G. G., Clouthier, C. M., Akbar, A., Keillor, J. W., Berezovski, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+enzyme+structure+and+activity+by+kinetic+capillary+electrophoresis-MS.">Simultaneous analysis of enzyme structure and activity by kinetic capillary electrophoresis-MS.</a> Nature Chemical Biology. 12 (11), 918-922 (2016).</li><li>Shen, Y., Zhao, X., Wang, G., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+hydrogen/deuterium+exchange+during+proteoform+separation+enables+characterization+of+conformational+differences+between+coexisting+protein+states.">Differential hydrogen/deuterium exchange during proteoform separation enables characterization of conformational differences between coexisting protein states.</a> Analytical Chemistry. 91 (6), 3805-3809 (2019).</li><li>Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invited+review:+&#946;-lactoglobulin:+binding+properties,+structure,+and+function.">Invited review: &#946;-lactoglobulin: binding properties, structure, and function.</a> Journal of Dairy Science. 87 (4), 785-796 (2004).</li><li>Qin, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+Tanford+transition+of+bovine+&#946;-lactoglobulin.">Structural basis of the Tanford transition of bovine &#946;-lactoglobulin.</a> Biochemistry. 37 (40), 14014-14023 (1998).</li><li>Qin, B. Y., Bewley, M. C., Creamer, L. K., Baker, E. N., Jameson, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+implications+of+structural+differences+between+variants+A+and+B+of+bovine+beta-lactoglobulin.">Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin.</a> Protein Science. 8 (1), 75-83 (1999).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+capillary+isoelectric+focusing+mass+spectrometry+analysis+of+peptides,+proteins,+and+monoclonal+antibodies+with+a+flow-through+microvial+interface.">High resolution capillary isoelectric focusing mass spectrometry analysis of peptides, proteins, and monoclonal antibodies with a flow-through microvial interface.</a> Analytical Chemistry. 90 (15), 9495-9503 (2018).</li><li>Busch, M. H. A., Kraak, J. C., Poppe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+acetate-coated+fused-silica+capillaries+for+the+separation+of+proteins+by+capillary+zone+electrophoresis.">Cellulose acetate-coated fused-silica capillaries for the separation of proteins by capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography A. 1695 (2), 287-296 (1995).</li><li>Zhao, X., Shen, Y., Tong, W., Wang, G., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deducing+disulfide+patterns+of+cysteine-rich+proteins+using+signature+fragments+produced+by+top-down+mass+spectrometry.">Deducing disulfide patterns of cysteine-rich proteins using signature fragments produced by top-down mass spectrometry.</a> Analyst. 143 (4), 817-823 (2018).</li><li>Sutera, S. P., Skalak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+Poiseuille's+law.">The history of Poiseuille's law.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 25 (1), 1-20 (1993).</li><li>Wang, G., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+characterization+of+the+higher+order+structure+of+disulfide-containing+proteins+using+hydrogen/deuterium+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).</li><li>Wang, G., Johnson, A. J., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+electrospray+ionization+mass+spectrometry+as+a+tool+for+characterization+of+small+soluble+protein+aggregates.">Evaluation of electrospray ionization mass spectrometry as a tool for characterization of small soluble protein aggregates.</a> Analytical Chemistry. 84 (3), 1718-1724 (2012).</li><li>Fellers, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProSight+Lite:+graphical+software+to+analyze+top-down+mass+spectrometry+data.">ProSight Lite: graphical software to analyze top-down mass spectrometry data.</a> Proteomics. 15 (7), 1235-1238 (2015).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MASH+Suite+Pro:+A+comprehensive+software+tool+for+top-down+proteomics.">MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 15 (2), 703-714 (2016).</li><li>Paterson, G. R., Hill, J. P., Otter, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+&#946;-lactoglobulin+A,+B+and+C+variants+of+bovine+whey+using+capillary+zone+electrophoresis.">Separation of &#946;-lactoglobulin A, B and C variants of bovine whey using capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography A. 700 (1), 105-110 (1995).</li><li>Wang, G., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+characterization+of+the+higher+order+structure+of+disulfide-containing+proteins+using+hydrogen/deuterium+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).</li><li>Nicolardi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-line+electrochemical+reduction+of+disulfide+bonds:+improved+FTICR-CID+and+-ETD+coverage+of+oxytocin+and+hepcidin.">On-line electrochemical reduction of disulfide bonds: improved FTICR-CID and -ETD coverage of oxytocin and hepcidin.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (12), 1980-1987 (2013).</li><li>Adhikari, S., Xia, Y., McLuckey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+analysis+of+disulfide-linked+proteins+using+photoinduced+radical+reactions+and+ET-DDC.">Top-down analysis of disulfide-linked proteins using photoinduced radical reactions and ET-DDC.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 444, 116173 (2019).</li><li>Rush, M. J. P., Riley, N. M., Westphall, M. S., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+characterization+of+proteins+with+intact+disulfide+bonds+using+activated-ion+electron+transfer+dissociation.">Top-down characterization of proteins with intact disulfide bonds using activated-ion electron transfer dissociation.</a> Analytical Chemistry. 90 (15), 8946-8953 (2018).</li><li>Zhong, X., Maxwell, E. J., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transport+in+a+micro+flow-through+vial+of+a+junction-at-the-tip+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry+interface.">Mass transport in a micro flow-through vial of a junction-at-the-tip capillary electrophoresis-mass spectrometry interface.</a> Analytical Chemistry. 83 (12), 4916-4923 (2011).</li></ol>

Formålet med at belægge CE-kapillærens indre væg omfatter minimering af den elektroosmotiske strøm og proteinabsorption under CE-processen13. Selvom elektroosmotisk strømning er gavnlig for konventionel CE-analyse af små molekyler på grund af dens evne til at køre neutrale eller modsat ladede arter til detektoren, kompromitterer det separationseffektiviteten af proteinarter med lignende størrelser og nettoladninger i opløsning. Belægning af kapillæren med HPC minimerer den elektroosmo...

At skelne proteinarter i forskellige konformations-, bindings- eller modifikationstilstande og karakterisere deres strukturelle forskelle er vigtige for at overvåge overgangsvejene mellem disse arter, der er involveret i biologiske begivenheder, lige fra molekylær genkendelse til enzymatisk katalyse og forstå de mekanismer, der ligger til grund for disse begivenheder. Konventionelle biofysiske teknikker giver ikke en komplet løsning på grund af begrænsningerne såsom utilstrækkelig opløsning og tab af dynamisk information i løsningen. Hydrogen/deuteriumudveksling kombineret med massespektrometri (HDX MS) er en teknik, der mærker de strukturelle og konformationelle træk ved proteiner med deuterium (2H) via udvekslingen mellem labile hydrogenatomer af proteiner og 2H fra den bevidst indførte2H20-opløsning. Protoner, der er involveret i hydrogenbinding, eller som er sekvestreret fra opløsningsmidlet i proteininteriøret, udveksler ikke let1. Da valutakursen på et udskifteligt sted således er stærkt afhængig af dens involvering i højere ordens strukturer, kan proteinstrukturerne afsløres ved høj rumlig opløsning af MS, der undersøger omfanget og hastigheden af 2H-optagelse baseret på de forskellige atommasser mellem 1H og 2H. I løbet af de seneste årtier er HDX MS blevet en enestående succesfuld teknik til at studere proteinkonformationer og dynamik2.
I den klassiske bottom-up-tilgang til HDX MS proteolyseres ensemblet af proteinarter i forskellige konformations-, bindings- eller modifikationstilstande uden adskillelse på det intakte proteinniveau, hvilket gør det umuligt at karakterisere individuelle arter ved at analysere de resulterende proteolytiske fragmenter med indviklet deuteriumindhold. I modsætning hertil giver forskellige proteintilstande eller proteoformer, der har inkorporeret forskellige deuteriumindhold, i top-down-tilgangen anledning til flere fordelinger af intakte proteinmasser i en MS-scanning. Dette gør det muligt at adskille individuelle arter ved masseudvælgelse af ioner svarende til hver massefordeling ved hjælp af et korrekt massefilter (såsom en quadrupol) og karakteriseringen af deres konformationsforskelle i den efterfølgende tandem MS-analyse 3,4,5,6. Effektiviteten af at adskille proteintilstande eller proteoformer i denne strategi er imidlertid begrænset af omfanget af forskellen i deres tilsvarende massefordelinger.
Kapillærelektroforese (CE) giver et middel til at adskille proteinarter baseret på deres forskellige ladninger og hydrodynamiske størrelser i opløsningsfasen med høj effektivitet7. Kombination af CE med HDX giver yderligere adskillelse af proteintilstande eller proteoformer i opløsningsfasen. Derudover tillader det lille volumen af CE-kapillæren udnyttelse af en fuldt deuteret opløsning som baggrundselektrolytopløsningen (BGE), dvs. den løbende buffer, hvilket gør kapillæren til en HDX-reaktor til proteinprøver. På grund af forskellen i elektroforetisk mobilitet mellem proteiner og protiske reagenser i elektroforeseprocessen resulterer udførelse af HDX under CE i et næsten fuldstændigt deuteringsmiljø for proteinanalytterne med minimalt resterende ikke-deuteret indhold, hvilket øger følsomheden af strukturanalysen ved hjælp af HDX-data. Som sådan udviklede vi en CE-baseret differentiel HDX-tilgang kombineret med top-down MS til at karakterisere protein højere ordens strukturer på en tilstands- eller proteoform-specifik måde8.
Dette papir beskriver protokoller for denne tilgang ved at beskrive trinene i materialeforberedelse, eksperimentel procedure og dataanalyse. Faktorer, der kan påvirke metodens ydeevne eller datakvalitet, er angivet i korte noter. De repræsentative resultater, der præsenteres her, omfatter differentielle HDX-data for blandinger af forskellige proteiner og naturlige varianter af kvæg β-lactoglobulin (β-lg), det vigtigste valleprotein, der findes i mælk9. Vi demonstrerer separationseffektivitet, reproducerbarhed og 2H-mærkningsydelse for de to rigelige varianter af β-lg, dvs. A og B10,11 under den CE-baserede HDX og variantspecifik karakterisering af deres konformationer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ammonium acetate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A/3446/50</td>
			<td>&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI 8000 plus capillary electrophoresis system</td>
			<td>Sciex, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5406000097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal filter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC201024</td>
			<td>10 kDa cutoff</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deuterium oxide</td>
			<td>Energy Chemical</td>
			<td>E090001</td>
			<td>99.9 % D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formic acid</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>&#160;270480250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fused silica glass capillary</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150017</td>
			<td>ID 50&#956;m, OD 360&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gas chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>GC6890N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydroxypropyl cellulose</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>H113415</td>
			<td>MW 100000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stirrers</td>
			<td>DLAB</td>
			<td>8030101212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A456-4</td>
			<td>MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microvolume UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>84677JK7731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myoglobin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td colspan="2">Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive UHMR mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium&#160;hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ubiquitin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U6253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasonicator</td>
			<td>SCIENTZ</td>
			<td>SB-5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-lactoglobulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L0130</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange for conformational characterization of proteins with top-down mass spectrometry

Løsning af konformationel heterogenitet af flere proteintilstande, der sameksisterer i opløsning, forbliver en af de største hindringer i karakteriseringen af proteinterapi og bestemmelsen af de konformationelle overgangsveje, der er kritiske for biologiske funktioner, lige fra molekylær anerkendelse til enzymatisk katalyse. Hydrogen/deuterium udveksling (HDX) reaktion kombineret med top-down massespektrometrisk (MS) analyse giver et middel til at karakterisere protein højere ordens strukturer og dynamik på en konformator-specifik måde. Den konformationelle opløsningskraft af denne teknik er stærkt afhængig af effektiviteten af at adskille proteintilstande på det intakte proteinniveau og minimere det resterende ikke-deutererede protiske indhold under HDX-reaktionerne. 
Her beskriver vi en kapillær elektroforese (CE)-baseret variant af HDX MS-tilgangen, der sigter mod at forbedre konformationsopløsningen. I denne tilgang gennemgår proteiner HDX-reaktioner, mens de migrerer gennem en deuteret baggrundselektrolytopløsning (BGE) under kapillær elektroforetisk adskillelse. Forskellige proteintilstande eller proteoformer, der sameksisterer i opløsning, kan adskilles effektivt baseret på deres forskellige ladnings-til-størrelsesforhold. Forskellen i elektroforetisk mobilitet mellem proteiner og protiske opløsningsmiddelmolekyler minimerer det resterende ikke-deutererede opløsningsmiddel, hvilket resulterer i et næsten fuldstændigt deuteringsmiljø under HDX-processen. Den gennemstrømningsmikroviale CE-MS-grænseflade muliggør effektiv elektrosprayionisering af de eluerede proteinarter efter en hurtig blanding med sluknings- og denatureringsmodifikatoropløsningen ved sprøjtens udløb. Online top-down MS-analysen måler det globale deuterationsniveau for de eluerede intakte proteinarter og efterfølgende deuterationen af deres gasfasefragmenter. Dette papir demonstrerer denne tilgang i differentiel HDX for systemer, herunder de naturlige proteinvarianter, der eksisterer sammen i mælk.

Ændring af infusionstrykket for BGE muliggør justering af både separationseffektivitet og migrationstid, hvilket svarer til HDX-reaktionstiden for de proteiner, der skal adskilles (figur 3). Et lavere infusionstryk resulterer i bedre adskillelse af CE-toppe på bekostning af eksperimentets varighed (figur 3A). En længere migrations-/HDX-reaktionstid resulterer i et højere niveau af deuteration af proteinanalytterne (figur 3B-D<...

Watch this Scientific Journal Video about Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry at JoVE.com

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Præsenteret her er en protokol for en kapillær elektroforesebaseret hydrogen / deuterium udveksling (HDX) tilgang kombineret med top-down massespektrometri. Denne tilgang karakteriserer forskellen i højere ordens strukturer mellem forskellige proteinarter, herunder proteiner i forskellige tilstande og forskellige proteoformer, ved at udføre samtidig differentiel HDX og elektroforetisk adskillelse.

Kapillær elektroforesebaseret hydrogen/deuteriumudveksling til konformationskarakterisering af proteiner med top-down massespektrometri

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Denne metode gør det muligt at adskille sameksisterende proteinarter, herunder forskellige konformatorer eller varianter, og online karakterisering af deres højere ordens strukturforskelle i en enkelt CEMS-måling. Det udnytter den elektroforetiske effekt til at tilvejebringe et næsten 100% varighedsmiljø for HDX-reaktionerne og ortogonal adskillelse af de sameksisterende proteinarter under HDX til top down MS-analyse. Begynd med forkonditionering af kapillærelektroforese, hydrogendeuteriumudveksling eller CE HDX-opsætning.Ved hjælp af ultralydbehandling i en blanding af 50% methanol, 49% vand og 1% myresyre, rengør strømmen gennem mikrovial CE-MS-grænseflade i mindst 30 minutter ved stuetemperatur. Monter den HPC-modificerede kapillær på kapillærelektroferesen eller CE-instrumentet. Skyl kapillæren med baggrundselektrolytopløsning eller BGE i 10 minutter ved hjælp af den automatiske sampler, og lad den være fyldt med BGE.Brug en passende længde af umodificeret smeltet silicakapillærslange som infusionsrør til modifikatoropløsningen. Brug en union og korrekt muffe til at forbinde modifikatorslangen til en gastæt glassprøjte med en stump temperatur, og skyl slangen med modifikatoropløsningen i mindst 10 minutter ved hjælp af en infusionspumpe. Indsæt udløbene på den HPC-kodede CE-kapillær- og modifikatorslange, der er fyldt med de tilsvarende opløsninger, i den rensede CE-MS-grænseflade.Fremryk sprøjten med infusionspumperne, således at modifikatoropløsningen når spidsen af grænsefladen. Monter den samlede CE-MS-grænseflade på et nanoelektronsprayioniseringskildehus på et massespektrometer. Påfør en sprøjtespænding på 3-5 kilovolt på CE-MS-grænsefladen.Tilsæt modifikatoropløsningen med infusionspumpen med en strømningshastighed på mellem 0,1-10 mikroliter i minuttet, og sørg for en stabil elektrospray i spidsen af CE-MS-grænsefladen. Anbring prøvehætteglasset, der indeholder BGE og autoprøveudtageren, som senere vil blive brugt til at erhverve tomme elektroferogrammer og blanke massespektre. Estimer injektionsvolumenet ved hjælp af forholdet mellem injektionsvolumen og injektionsparametre.Og injicer prøveopløsningen ved hjælp af auto sampleren ved to PSI i en passende varighed. Start CE-separationen ved at anvende en elektroforetisk spænding på 20 kilovolt i et infusionstryk fra 0-2 PSI og anskaffe elektroferogrammet. I mellemtiden erhverves MS-dataene i kromatografisk tilstand, hvor ionstrømsgrafen erhverves som en funktion af tiden, og de tilsvarende MS-scanninger ikke automatisk kombineres til et enkelt spektrum.Gem det tomme elektroferogram og massespektre som referencer. Prøvehætteglassene, der indeholder de ønskede koncentrationer af proteinprøveopløsningerne, anbringes i autoprøveudtageren, og elektroferogrammerne og MS1-spektrene for de elektroforetisk adskilte og deuteriummærkede proteinarter anparter. Udføre tandem Ms.-målinger for de arter, der er af interesse, enten efter at have erhvervet MS1-spektrene inden for samme kørsel eller i en efterfølgende separat kørsel.Efter hver måling skylles kapillæren med BGE ved et tryk på 20 PSI i mindst 10 minutter. Rengør CEMS-grænsefladen og alle slanger til opbevaring, når forsøgene er afsluttet. Anskaf et datasæt af HDX-slutpunktsprøven med MS i direkte infusionstilstand.Et lavt infusionstryk resulterede i bedre adskillelse af CE-toppe, men førte til en stigning i både migrationstiden og varigheden af eksperimentet. En længere HDX-reaktionstid resulterede i et højere niveau af deduration af proteinanalytterne. A- og B-variansen af betaimmunglobulin eller beta-IG, som kun adskiller sig med to aminosyrerester i deres sekvens, gav anledning til to tilstrækkeligt adskilte toppe i det EIC-afledte elektroferogram.Den differentielle deuteriummærkede varians resulterede i en tydelig massefordeling af ioner. Et lavere antal i relativ overflod af Z-ioner end C-ioner blev observeret på grund af den unikke dysofierede kobling i bekræftelsen af beta IG, som begrænser fragmenteringseffektiviteten mellem CS 82 og CS 176. De fleste af fragmentionerne produceret af beta IGA og beta IGB udviser en lignende grad af deuteriumoptagelse.Imidlertid blev de større segmenter, der dækker sekvensvariationsstederne fra beta IGA, dedurated i betydeligt større grad end beta IGB. BGE's pH justeres i henhold til prøvens isoelektriske punkt for at forhindre proteinaggregering og lette adskillelsen, samtidig med at komplekset opretholdes.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Chemistry

Unit 1

Principles of Mass Spectrometry

SCIENTISTS IN ACTION

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Analyserer Protein Dynamics hjælp af brint Exchange massespektrometri

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Submillisecond konformationsændringer i Proteiner løst ved Photothermal Beam Nedbøjning

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

Visualisering af Ambient massespektrometri med brug af Schlieren Photography

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

En HS-MRM analyse til kvantificering af værts-celle proteiner i Protein Biopharmaceuticals af væskekromatografi Ion mobilitet QTOF massespektrometri

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

Microprobe kapillær elektroforese massespektrometri for encellede Metabolomics i Live Frog (Xenopus laevis) embryoner

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometry

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometry

Karakterisering af syntetiske polymerer via Matrix Assisted Laser Desorption ionisering tid for flyvning (MALDI-TOF) massespektrometri

There are many techniques that can be employed in the characterization of synthetic homopolymers, but few provide as useful of information for end group ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Storstilet Top-down Proteomics brug af kapillar Zone elektroforese Tandem massespektrometri

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Høj overførselshastighed og omfattende stof overvågning ved hjælp af Multisegment injektion-kapillær elektroforese massespektrometri

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III))

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry CE-ICP-MS for Quantification of Iron Redox Species FeII, FeIII

Opsætning af kapillær elektroforese-induktivt koblet plasmamassespektrometri (CE-ICP-MS) til kvantificering af jernrødoxarter (Fe(II), Fe(III))

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Kapillær elektroforese massespektrometri tilgange til karakterisering af protein og metabolit Corona erhvervet af nanomaterialer

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...