Name: capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange for conformational characterization of proteins with top-down mass spectrometry
Uploaded: 2021-06-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (NSFC 21974069). De auteurs kregen ook steun van het Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, China; Jiangsu Collaborative Innovation Center van Biomedische Functionele Materialen; en Jiangsu Key Laboratory of Biomedical Materials aan de Nanjing Normal University, China.

OPMERKING: Gebruik waar mogelijk hoogwaardige vloeistofchromatografie (HPLC) of MS-klasse reagentia om de verontreinigingen die de MS-analyse kunnen verstoren, te minimaliseren. Raak de CE-MS-interface tijdens de meting niet met blote handen aan om de mogelijkheid van een elektrische schok veroorzaakt door de elektroforetische spanning of elektrosprayspanning te voorkomen.
1. Materiaalvoorbereiding
<ol><li>Modificatie van gesmolten silica capillair voor CE<ol>
<li>Bereid een 5% (m/w) hydroxy...

<ol>
	<li>Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+methods+in+characterization+of+the+higher+order+structure+of+protein+therapeutics.">Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169 (2020).</li><li>Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry.">Developments in hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 93 (1), 567-582 (2021).</li><li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformer-specific+hydrogen+exchange+analysis+of+Abeta(1-42)+oligomers+by+top-down+electron+capture+dissociation+mass+spectrometry.">Conformer-specific hydrogen exchange analysis of Abeta(1-42) oligomers by top-down electron capture dissociation mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 83 (13), 5386-5393 (2011).</li><li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+small+soluble+Abeta(1-40)+oligomers+studied+by+top-down+hydrogen+exchange+mass+spectrometry.">Structure and dynamics of small soluble Abeta(1-40) oligomers studied by top-down hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Biochemistry. 51 (17), 3694-3703 (2012).</li><li>Pan, J., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+structural+analysis+of+posttranslationally+modified+proteins+by+Fourier+transform+ion+cyclotron+resonance-MS+with+hydrogen/deuterium+exchange+and+electron+capture+dissociation.">Top-down structural analysis of posttranslationally modified proteins by Fourier transform ion cyclotron resonance-MS with hydrogen/deuterium exchange and electron capture dissociation.</a> Proteomics. 13 (6), 974-981 (2013).</li><li>Wang, G., Abzalimov, R. R., Bobst, C. E., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformer-specific+characterization+of+nonnative+protein+states+using+hydrogen+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Conformer-specific characterization of nonnative protein states using hydrogen exchange and top-down mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United. States of America. 110 (50), 20087-20092 (2013).</li><li>Mironov, G. G., Clouthier, C. M., Akbar, A., Keillor, J. W., Berezovski, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+enzyme+structure+and+activity+by+kinetic+capillary+electrophoresis-MS.">Simultaneous analysis of enzyme structure and activity by kinetic capillary electrophoresis-MS.</a> Nature Chemical Biology. 12 (11), 918-922 (2016).</li><li>Shen, Y., Zhao, X., Wang, G., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+hydrogen/deuterium+exchange+during+proteoform+separation+enables+characterization+of+conformational+differences+between+coexisting+protein+states.">Differential hydrogen/deuterium exchange during proteoform separation enables characterization of conformational differences between coexisting protein states.</a> Analytical Chemistry. 91 (6), 3805-3809 (2019).</li><li>Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invited+review:+&#946;-lactoglobulin:+binding+properties,+structure,+and+function.">Invited review: &#946;-lactoglobulin: binding properties, structure, and function.</a> Journal of Dairy Science. 87 (4), 785-796 (2004).</li><li>Qin, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+Tanford+transition+of+bovine+&#946;-lactoglobulin.">Structural basis of the Tanford transition of bovine &#946;-lactoglobulin.</a> Biochemistry. 37 (40), 14014-14023 (1998).</li><li>Qin, B. Y., Bewley, M. C., Creamer, L. K., Baker, E. N., Jameson, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+implications+of+structural+differences+between+variants+A+and+B+of+bovine+beta-lactoglobulin.">Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin.</a> Protein Science. 8 (1), 75-83 (1999).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+capillary+isoelectric+focusing+mass+spectrometry+analysis+of+peptides,+proteins,+and+monoclonal+antibodies+with+a+flow-through+microvial+interface.">High resolution capillary isoelectric focusing mass spectrometry analysis of peptides, proteins, and monoclonal antibodies with a flow-through microvial interface.</a> Analytical Chemistry. 90 (15), 9495-9503 (2018).</li><li>Busch, M. H. A., Kraak, J. C., Poppe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+acetate-coated+fused-silica+capillaries+for+the+separation+of+proteins+by+capillary+zone+electrophoresis.">Cellulose acetate-coated fused-silica capillaries for the separation of proteins by capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography A. 1695 (2), 287-296 (1995).</li><li>Zhao, X., Shen, Y., Tong, W., Wang, G., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deducing+disulfide+patterns+of+cysteine-rich+proteins+using+signature+fragments+produced+by+top-down+mass+spectrometry.">Deducing disulfide patterns of cysteine-rich proteins using signature fragments produced by top-down mass spectrometry.</a> Analyst. 143 (4), 817-823 (2018).</li><li>Sutera, S. P., Skalak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+Poiseuille's+law.">The history of Poiseuille's law.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 25 (1), 1-20 (1993).</li><li>Wang, G., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+characterization+of+the+higher+order+structure+of+disulfide-containing+proteins+using+hydrogen/deuterium+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).</li><li>Wang, G., Johnson, A. J., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+electrospray+ionization+mass+spectrometry+as+a+tool+for+characterization+of+small+soluble+protein+aggregates.">Evaluation of electrospray ionization mass spectrometry as a tool for characterization of small soluble protein aggregates.</a> Analytical Chemistry. 84 (3), 1718-1724 (2012).</li><li>Fellers, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProSight+Lite:+graphical+software+to+analyze+top-down+mass+spectrometry+data.">ProSight Lite: graphical software to analyze top-down mass spectrometry data.</a> Proteomics. 15 (7), 1235-1238 (2015).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MASH+Suite+Pro:+A+comprehensive+software+tool+for+top-down+proteomics.">MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 15 (2), 703-714 (2016).</li><li>Paterson, G. R., Hill, J. P., Otter, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+&#946;-lactoglobulin+A,+B+and+C+variants+of+bovine+whey+using+capillary+zone+electrophoresis.">Separation of &#946;-lactoglobulin A, B and C variants of bovine whey using capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography A. 700 (1), 105-110 (1995).</li><li>Wang, G., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+characterization+of+the+higher+order+structure+of+disulfide-containing+proteins+using+hydrogen/deuterium+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).</li><li>Nicolardi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-line+electrochemical+reduction+of+disulfide+bonds:+improved+FTICR-CID+and+-ETD+coverage+of+oxytocin+and+hepcidin.">On-line electrochemical reduction of disulfide bonds: improved FTICR-CID and -ETD coverage of oxytocin and hepcidin.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (12), 1980-1987 (2013).</li><li>Adhikari, S., Xia, Y., McLuckey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+analysis+of+disulfide-linked+proteins+using+photoinduced+radical+reactions+and+ET-DDC.">Top-down analysis of disulfide-linked proteins using photoinduced radical reactions and ET-DDC.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 444, 116173 (2019).</li><li>Rush, M. J. P., Riley, N. M., Westphall, M. S., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+characterization+of+proteins+with+intact+disulfide+bonds+using+activated-ion+electron+transfer+dissociation.">Top-down characterization of proteins with intact disulfide bonds using activated-ion electron transfer dissociation.</a> Analytical Chemistry. 90 (15), 8946-8953 (2018).</li><li>Zhong, X., Maxwell, E. J., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transport+in+a+micro+flow-through+vial+of+a+junction-at-the-tip+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry+interface.">Mass transport in a micro flow-through vial of a junction-at-the-tip capillary electrophoresis-mass spectrometry interface.</a> Analytical Chemistry. 83 (12), 4916-4923 (2011).</li></ol>

De doelstellingen van het coaten van de binnenwand van het CE-capillair omvatten het minimaliseren van de elektroosmotische stroom en eiwitabsorptie tijdens het CE-proces13. Hoewel elektroosmotische stroming gunstig is voor conventionele CE-analyse van kleine moleculen vanwege het vermogen om neutrale of tegengesteld geladen soorten naar de detector te rijden, brengt het de scheidingsefficiëntie van eiwitsoorten met vergelijkbare groottes en nettoladingen in oplossing in gevaar. Het coaten van he...

Het onderscheiden van eiwitsoorten in verschillende conformatie-, bindings- of modificatietoestanden en het karakteriseren van hun structurele verschillen zijn belangrijk voor het monitoren van de routes van overgangen tussen deze soorten die betrokken zijn bij biologische gebeurtenissen, variërend van moleculaire herkenning tot enzymatische katalyse, en het begrijpen van de mechanismen die aan deze gebeurtenissen ten grondslag liggen. Conventionele biofysische technieken bieden geen volledige oplossing vanwege de beperkingen zoals onvoldoende resolutie en verlies van dynamische informatie in oplossing. Waterstof/deuteriumuitwisseling in combinatie met massaspectrometrie (HDX MS) is een techniek die de structurele en conformationele kenmerken van eiwitten labelt met deuterium (2H) via de uitwisseling tussen labiele waterstofatomen van eiwitten en 2H uit de opzettelijk geïntroduceerde 2H2O-oplossing. Protonen die betrokken zijn bij waterstofbinding of die worden gesekwestreerd uit het oplosmiddel in het eiwitinterieur wisselen niet gemakkelijk1 uit. Omdat de wisselkoers op een verwisselbare locatie dus sterk afhankelijk is van zijn betrokkenheid bij structuren van hogere orde, kunnen de eiwitstructuren met hoge ruimtelijke resolutie worden onthuld door MS die de mate en snelheid van 2H-opname onderzoekt op basis van de verschillende atoommassa's tussen 1H en 2H. In de afgelopen decennia is HDX MS een buitengewoon succesvolle techniek geworden voor het bestuderen van eiwitconformaties en -dynamica2.
In de klassieke bottom-up benadering van HDX MS wordt het ensemble van eiwitsoorten in verschillende conformatie-, bindings- of modificatietoestanden proteolyseerd zonder scheiding op het intacte eiwitniveau, waardoor het onhaalbaar is om individuele soorten te karakteriseren door de resulterende proteolytische fragmenten met ingewikkelde deuteriuminhoud te analyseren. In de top-down benadering daarentegen geven verschillende eiwittoestanden of proteoformen die verschillende deuteriumgehalten hebben opgenomen aanleiding tot meerdere verdelingen van intacte eiwitmassa's in een MS-scan. Hierdoor kunnen individuele soorten worden gescheiden door massaselectie van ionen die overeenkomen met elke massaverdeling met behulp van een goed massafilter (zoals een quadrupool) en de karakterisering van hun conformatieverschillen in de daaropvolgende tandem MS-analyse 3,4,5,6. De efficiëntie van het scheiden van eiwittoestanden of proteoformen in deze strategie wordt echter beperkt door de mate van verschil in hun overeenkomstige massaverdelingen.
Capillaire elektroforese (CE) biedt een middel om eiwitsoorten te scheiden op basis van hun verschillende ladingen en hydrodynamische afmetingen in de oplossingsfase met een hoog rendement7. De combinatie van CE met HDX biedt extra scheiding van eiwittoestanden of proteoformen in de oplossingsfase. Bovendien maakt het kleine volume van het CE-capillair het gebruik van een volledig gedeutereerde oplossing als achtergrondelektrolytoplossing (BGE), d.w.z. de lopende buffer, waardoor het capillair wordt weergegeven als een HDX-reactor voor eiwitmonsters. Vanwege het verschil in elektroforetische mobiliteit tussen eiwitten en protische reagentia in het elektroforeseproces, resulteert het uitvoeren van HDX tijdens CE in een bijna volledige deutererende omgeving voor de eiwitanalyten met minimale resterende niet-gedeutereerde inhoud, waardoor de gevoeligheid van de structurele analyse met behulp van HDX-gegevens wordt verbeterd. Als zodanig ontwikkelden we een CE-gebaseerde differentiële HDX-benadering in combinatie met top-down MS om eiwitstructuren van hogere orde te karakteriseren op een toestands- of proteoform-specifieke manier8.
Dit artikel beschrijft protocollen voor deze aanpak door de stappen van materiaalvoorbereiding, experimentele procedure en gegevensanalyse te beschrijven. Factoren die van invloed kunnen zijn op de prestaties van de methode of de gegevenskwaliteit worden vermeld in korte notities. De hier gepresenteerde representatieve resultaten omvatten differentiële HDX-gegevens van mengsels van verschillende eiwitten en natuurlijke varianten van runder- β-lactoglobuline (β-lg), het belangrijkste wei-eiwit dat aanwezig is in melk9. We demonstreren scheidingsefficiëntie, reproduceerbaarheid en 2H-labelingprestaties van de twee overvloedige varianten van β-lg, d.w.z. A en B10,11 tijdens de CE-gebaseerde HDX en variantspecifieke karakterisering van hun conformaties.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ammonium acetate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A/3446/50</td>
			<td>&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI 8000 plus capillary electrophoresis system</td>
			<td>Sciex, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5406000097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal filter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC201024</td>
			<td>10 kDa cutoff</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deuterium oxide</td>
			<td>Energy Chemical</td>
			<td>E090001</td>
			<td>99.9 % D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formic acid</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>&#160;270480250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fused silica glass capillary</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150017</td>
			<td>ID 50&#956;m, OD 360&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gas chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>GC6890N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydroxypropyl cellulose</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>H113415</td>
			<td>MW 100000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stirrers</td>
			<td>DLAB</td>
			<td>8030101212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A456-4</td>
			<td>MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microvolume UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>84677JK7731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myoglobin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td colspan="2">Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive UHMR mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium&#160;hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ubiquitin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U6253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasonicator</td>
			<td>SCIENTZ</td>
			<td>SB-5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-lactoglobulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L0130</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange for conformational characterization of proteins with top-down mass spectrometry

Het oplossen van conformatie-heterogeniteit van meerdere eiwittoestanden die naast elkaar bestaan in oplossing blijft een van de belangrijkste obstakels bij de karakterisering van eiwittherapieën en de bepaling van de conformatietransitieroutes die cruciaal zijn voor biologische functies, variërend van moleculaire herkenning tot enzymatische katalyse. Waterstof/deuterium uitwisseling (HDX) reactie in combinatie met top-down massaspectrometrische (MS) analyse biedt een middel om eiwit hogere orde structuren en dynamica te karakteriseren op een conformer-specifieke manier. Het conformatie-oplossend vermogen van deze techniek is sterk afhankelijk van de efficiëntie van het scheiden van eiwittoestanden op het intacte eiwitniveau en het minimaliseren van het resterende niet-gedeutereerde protische gehalte tijdens de HDX-reacties. 
Hier beschrijven we een op capillaire elektroforese (CE) gebaseerde variant van de HDX MS-benadering die tot doel heeft de conformatieresolutie te verbeteren. In deze benadering ondergaan eiwitten HDX-reacties terwijl ze migreren door een gedeutereerde achtergrondelektrolytoplossing (BGE) tijdens de capillaire elektroforetische scheiding. Verschillende eiwittoestanden of proteoformen die naast elkaar bestaan in oplossing kunnen efficiënt worden gescheiden op basis van hun verschillende lading-tot-grootteverhoudingen. Het verschil in elektroforetische mobiliteit tussen eiwitten en protische oplosmiddelmoleculen minimaliseert het resterende niet-gedeutereerde oplosmiddel, wat resulteert in een bijna volledige deutererende omgeving tijdens het HDX-proces. De doorstroom microviale CE-MS-interface maakt efficiënte elektrospray-ionisatie van de geëlueerde eiwitsoorten mogelijk na een snelle menging met de blus- en denaturerende modifieroplossing aan de uitlaat van de sproeier. De online top-down MS-analyse meet het wereldwijde deuteratieniveau van de geëlueerde intacte eiwitsoorten en vervolgens de deuteratie van hun gasfasefragmenten. Dit artikel demonstreert deze benadering in differentiële HDX voor systemen, inclusief de natuurlijke eiwitvarianten die naast elkaar bestaan in melk.

Het veranderen van de infusiedruk van BGE maakt het mogelijk om zowel de scheidingsefficiëntie als de migratietijd aan te passen, wat overeenkomt met de HDX-reactietijd van de te scheiden eiwitten (figuur 3). Een lagere infusiedruk resulteert in een betere scheiding van CE-pieken ten koste van de duur van het experiment (figuur 3A). Een langere migratie/HDX-reactietijd resulteert in een hogere mate van deuteratie van de eiwitanalyten (figuu...

Watch this Scientific Journal Video about Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry at JoVE.com

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor een op capillaire elektroforese gebaseerde waterstof / deuteriumuitwisseling (HDX) -benadering in combinatie met top-down massaspectrometrie. Deze benadering karakteriseert het verschil in hogere-orde structuren tussen verschillende eiwitsoorten, inclusief eiwitten in verschillende toestanden en verschillende proteoformen, door gelijktijdige differentiële HDX en elektroforetische scheiding uit te voeren.

Op capillaire elektroforese gebaseerde waterstof/deuteriumuitwisseling voor conformatiekarakterisering van eiwitten met top-down massaspectrometrie

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Deze methode maakt het mogelijk om de scheiding van naast elkaar bestaande eiwitsoorten, inclusief verschillende conformers of varianten en online karakterisering van hun hogere orde structuurverschillen, in een enkele CEMS-meting te voltooien. Het maakt gebruik van het elektroforetische effect om een bijna 100% langdurige omgeving te bieden voor de HDX-reacties en orthogonale scheiding van de naast elkaar bestaande eiwitsoorten tijdens HDX voor top-down MS-analyse. Begin met het conditioneren van de capillaire elektroforese, waterstofdeuteriumuitwisseling of CE HDX-opstelling.Gebruik ultrasone trillingen in een mengsel van 50% methanol, 49% water en 1% mierenzuur, reinig de stroom door de microviale CE-MS-interface gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur. Monteer het HPC gemodificeerde capillair op de capillaire elektroferese of CE-instrument. Spoel het capillair met achtergrondelektrolytoplossing of BGE gedurende 10 minuten met behulp van de automatische sampler en laat het gevuld met de BGE.Gebruik een geschikte lengte van ongewijzigde gesmolten silica capillaire buizen als de infusiebuis voor de modifier-oplossing. Gebruik een unie en de juiste hoes om de modifier-slang aan te sluiten op een gasdichte glazen spuit met een stompe temperatuur en spoel de slang met de modifier-oplossing gedurende ten minste 10 minuten met behulp van een infusiepomp. Plaats de uitgangen van de HPC-gecodeerde CE-capillaire en modifierbuizen geladen met de bijbehorende oplossingen in de gereinigde CE-MS-interface.Plaats de spuit met de infusiepompen zodanig dat de modifieroplossing de punt van de interface bereikt. Monteer de geassembleerde CE-MS-interface op een nano-elektronensproei-ionisatiebronbehuizing van een massaspectrometer. Breng een spuitspanning van 3-5 kilovolt aan op de CE-MS interface.Injecteer de modifier-oplossing met de infuserpomp met een debiet van 0,1-10 microliter per minuut en zorg voor een stabiele elektrospray aan de punt van de CE-MS-interface. Plaats de injectieflacon met het monster met de BGE en de automatische sampler, die later zullen worden gebruikt om blanco-elektroferogrammen en blanco massaspectra te verkrijgen. Schat het injectievolume met behulp van de relatie tussen het injectievolume en de injectieparameters.En injecteer de monsteroplossing met behulp van de automatische sampler bij twee PSI voor een geschikte duur. Start de CE-scheiding door een elektroforetische spanning van 20 kilovolt toe te passen in een infusiedruk variërend van 0-2 PSI en verkrijg het elektroferogram. Verwerf ondertussen de MS-gegevens in de chromatografische modus waarbij de ionenstroomgrafiek wordt verkregen als functie van de tijd en de bijbehorende MS-scans niet automatisch worden gecombineerd in een enkel spectrum.Sla het lege elektroferogram en massaspectra op als referenties. Plaats de injectieflacons met de gewenste concentraties van de eiwitmonsteroplossingen in de auto sampler en verkrijg de elektroferogrammen en MS1-spectra van de elektroforetisch gescheiden en deuteriumgelabelde eiwitsoort. Voer tandem Ms.-metingen uit voor de soort van belang, hetzij na het verkrijgen van de MS1-spectra binnen dezelfde run of in een volgende afzonderlijke run.Spoel na elke meting het capillair met BGE bij een druk van 20 PSI gedurende ten minste 10 minuten. Reinig de CEMS-interface en alle slangen voor opslag na voltooiing van de experimenten. Verkrijg een dataset van het HDX-eindpuntmonster met MS in directe infusiemodus.Een lage infusiedruk resulteerde in een betere scheiding van CE-pieken, maar leidde tot een toename van zowel de migratietijd als de duur van het experiment. Een langere HDX-reactietijd resulteerde in een hogere mate van ontdunning van de eiwitanalyten. De A- en B-variantie van bèta-immunoglobuline of bèta-IG, die verschillen door slechts twee aminozuurresiduen in hun volgorde, gaf aanleiding tot twee adequaat gescheiden pieken in het van de EIC afgeleide elektroferogram.De differentiële deuterium gelabelde variantie resulteerde in een duidelijke massaverdeling van ionen. Een lager aantal in relatieve abundantie van Z-ionen dan C-ionen werd waargenomen als gevolg van de unieke dysofied koppeling ter bevestiging van bèta-IG die de fragmentatie-efficiëntie tussen CS 82 en CS 176 beperkt. De meeste fragmentionen geproduceerd uit bèta-IGA en bèta-IGB vertonen een vergelijkbare mate van deuteriumopname.De grotere segmenten die de sequentievariatieplaatsen van bèta-IGA bestreken, werden echter in aanzienlijk grotere mate ontdubbeld dan bèta-IGB. De pH van BGE wordt aangepast aan het iso-elektrische punt van het monster om eiwitaggregatie te voorkomen en scheiding te vergemakkelijken met behoud van het complex.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Chemistry

Unit 1

Principles of Mass Spectrometry

SCIENTISTS IN ACTION

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Het analyseren van Protein Dynamics gebruik van waterstof Exchange Massaspectrometrie

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Submillisecond Conformational Veranderingen in Eiwitten opgelost door Fotothermische straalafbuiging

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

Visualisatie van Ambient Massaspectrometrie met het gebruik van Schlieren fotografie

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

Een HS-MRM Assay voor de kwantificering van de gastheercel eiwitten in Protein biofarmaceutica door vloeistofchromatografie Ion mobiliteit QTOF massaspectrometrie

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

Microprobe capillaire elektroforese massaspectrometrie voor eencellige metabolomica in Live kikker (Xenopus laevis) embryo 's

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometry

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometry

Karakterisering van synthetische polymeren via Matrix bijgestaan Laser desorptie ionisatie tijd van de Spectrometrie van de massa van de vlucht (MALDI-TOF)

There are many techniques that can be employed in the characterization of synthetic homopolymers, but few provide as useful of information for end group ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Grootschalige topdown Proteomics met behulp van capillaire Zone elektroforese Tandem massaspectrometrie

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

High-throughput en uitgebreide Drug Surveillance met behulp van spectrometrie van de massa van het Multisegment injectie-capillaire elektroforese

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III))

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry CE-ICP-MS for Quantification of Iron Redox Species FeII, FeIII

Opstelling van capillaire elektroforese-inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie (CE-ICP-MS) voor kwantificering van ijzerrederoxsoorten (Fe(II), Fe(III))

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Capillaire elektroforese massaspectrometrie benaderingen voor karakterisering van het eiwit en metaboliet corona verworven door nanomaterialen

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...