Name: capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange for conformational characterization of proteins with top-down mass spectrometry
Uploaded: 2021-06-08T14:00:00
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Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Natural Science Foundation of China (NSFC 21974069). Les auteurs ont également reçu le soutien de l’Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, Chine; Centre d’innovation collaborative du Jiangsu pour les matériaux fonctionnels biomédicaux; et Jiangsu Key Laboratory of Biomedical Materials à l’Université normale de Nanjing, en Chine.

REMARQUE : Utilisez des réactifs de qualité chromatographique liquide à haute performance (CLHP) ou de qualité MS dans la mesure du possible afin de minimiser les contaminants susceptibles d’interférer avec l’analyse de la SEP. Ne touchez pas l’interface CE-MS à mains nues pendant la mesure pour éviter la possibilité d’un choc électrique causé par la tension électrophorétique ou la tension d’électropulvérisation.
1. Préparation du matériel
<ol><li>Modification du ca...

<ol>
	<li>Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+methods+in+characterization+of+the+higher+order+structure+of+protein+therapeutics.">Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169 (2020).</li><li>Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry.">Developments in hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 93 (1), 567-582 (2021).</li><li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformer-specific+hydrogen+exchange+analysis+of+Abeta(1-42)+oligomers+by+top-down+electron+capture+dissociation+mass+spectrometry.">Conformer-specific hydrogen exchange analysis of Abeta(1-42) oligomers by top-down electron capture dissociation mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 83 (13), 5386-5393 (2011).</li><li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+small+soluble+Abeta(1-40)+oligomers+studied+by+top-down+hydrogen+exchange+mass+spectrometry.">Structure and dynamics of small soluble Abeta(1-40) oligomers studied by top-down hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Biochemistry. 51 (17), 3694-3703 (2012).</li><li>Pan, J., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+structural+analysis+of+posttranslationally+modified+proteins+by+Fourier+transform+ion+cyclotron+resonance-MS+with+hydrogen/deuterium+exchange+and+electron+capture+dissociation.">Top-down structural analysis of posttranslationally modified proteins by Fourier transform ion cyclotron resonance-MS with hydrogen/deuterium exchange and electron capture dissociation.</a> Proteomics. 13 (6), 974-981 (2013).</li><li>Wang, G., Abzalimov, R. R., Bobst, C. E., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformer-specific+characterization+of+nonnative+protein+states+using+hydrogen+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Conformer-specific characterization of nonnative protein states using hydrogen exchange and top-down mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United. States of America. 110 (50), 20087-20092 (2013).</li><li>Mironov, G. G., Clouthier, C. M., Akbar, A., Keillor, J. W., Berezovski, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+enzyme+structure+and+activity+by+kinetic+capillary+electrophoresis-MS.">Simultaneous analysis of enzyme structure and activity by kinetic capillary electrophoresis-MS.</a> Nature Chemical Biology. 12 (11), 918-922 (2016).</li><li>Shen, Y., Zhao, X., Wang, G., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+hydrogen/deuterium+exchange+during+proteoform+separation+enables+characterization+of+conformational+differences+between+coexisting+protein+states.">Differential hydrogen/deuterium exchange during proteoform separation enables characterization of conformational differences between coexisting protein states.</a> Analytical Chemistry. 91 (6), 3805-3809 (2019).</li><li>Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invited+review:+&#946;-lactoglobulin:+binding+properties,+structure,+and+function.">Invited review: &#946;-lactoglobulin: binding properties, structure, and function.</a> Journal of Dairy Science. 87 (4), 785-796 (2004).</li><li>Qin, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+Tanford+transition+of+bovine+&#946;-lactoglobulin.">Structural basis of the Tanford transition of bovine &#946;-lactoglobulin.</a> Biochemistry. 37 (40), 14014-14023 (1998).</li><li>Qin, B. Y., Bewley, M. C., Creamer, L. K., Baker, E. N., Jameson, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+implications+of+structural+differences+between+variants+A+and+B+of+bovine+beta-lactoglobulin.">Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin.</a> Protein Science. 8 (1), 75-83 (1999).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+capillary+isoelectric+focusing+mass+spectrometry+analysis+of+peptides,+proteins,+and+monoclonal+antibodies+with+a+flow-through+microvial+interface.">High resolution capillary isoelectric focusing mass spectrometry analysis of peptides, proteins, and monoclonal antibodies with a flow-through microvial interface.</a> Analytical Chemistry. 90 (15), 9495-9503 (2018).</li><li>Busch, M. H. A., Kraak, J. C., Poppe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+acetate-coated+fused-silica+capillaries+for+the+separation+of+proteins+by+capillary+zone+electrophoresis.">Cellulose acetate-coated fused-silica capillaries for the separation of proteins by capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography A. 1695 (2), 287-296 (1995).</li><li>Zhao, X., Shen, Y., Tong, W., Wang, G., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deducing+disulfide+patterns+of+cysteine-rich+proteins+using+signature+fragments+produced+by+top-down+mass+spectrometry.">Deducing disulfide patterns of cysteine-rich proteins using signature fragments produced by top-down mass spectrometry.</a> Analyst. 143 (4), 817-823 (2018).</li><li>Sutera, S. P., Skalak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+Poiseuille's+law.">The history of Poiseuille's law.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 25 (1), 1-20 (1993).</li><li>Wang, G., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+characterization+of+the+higher+order+structure+of+disulfide-containing+proteins+using+hydrogen/deuterium+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).</li><li>Wang, G., Johnson, A. J., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+electrospray+ionization+mass+spectrometry+as+a+tool+for+characterization+of+small+soluble+protein+aggregates.">Evaluation of electrospray ionization mass spectrometry as a tool for characterization of small soluble protein aggregates.</a> Analytical Chemistry. 84 (3), 1718-1724 (2012).</li><li>Fellers, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProSight+Lite:+graphical+software+to+analyze+top-down+mass+spectrometry+data.">ProSight Lite: graphical software to analyze top-down mass spectrometry data.</a> Proteomics. 15 (7), 1235-1238 (2015).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MASH+Suite+Pro:+A+comprehensive+software+tool+for+top-down+proteomics.">MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 15 (2), 703-714 (2016).</li><li>Paterson, G. R., Hill, J. P., Otter, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+&#946;-lactoglobulin+A,+B+and+C+variants+of+bovine+whey+using+capillary+zone+electrophoresis.">Separation of &#946;-lactoglobulin A, B and C variants of bovine whey using capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography A. 700 (1), 105-110 (1995).</li><li>Wang, G., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+characterization+of+the+higher+order+structure+of+disulfide-containing+proteins+using+hydrogen/deuterium+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).</li><li>Nicolardi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-line+electrochemical+reduction+of+disulfide+bonds:+improved+FTICR-CID+and+-ETD+coverage+of+oxytocin+and+hepcidin.">On-line electrochemical reduction of disulfide bonds: improved FTICR-CID and -ETD coverage of oxytocin and hepcidin.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (12), 1980-1987 (2013).</li><li>Adhikari, S., Xia, Y., McLuckey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+analysis+of+disulfide-linked+proteins+using+photoinduced+radical+reactions+and+ET-DDC.">Top-down analysis of disulfide-linked proteins using photoinduced radical reactions and ET-DDC.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 444, 116173 (2019).</li><li>Rush, M. J. P., Riley, N. M., Westphall, M. S., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+characterization+of+proteins+with+intact+disulfide+bonds+using+activated-ion+electron+transfer+dissociation.">Top-down characterization of proteins with intact disulfide bonds using activated-ion electron transfer dissociation.</a> Analytical Chemistry. 90 (15), 8946-8953 (2018).</li><li>Zhong, X., Maxwell, E. J., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transport+in+a+micro+flow-through+vial+of+a+junction-at-the-tip+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry+interface.">Mass transport in a micro flow-through vial of a junction-at-the-tip capillary electrophoresis-mass spectrometry interface.</a> Analytical Chemistry. 83 (12), 4916-4923 (2011).</li></ol>

Les objectifs du revêtement de la paroi interne du capillaire CE comprennent la minimisation du flux électroosmotique et l’absorption des protéines au cours du processus CE13. Bien que l’écoulement électroosmotique soit bénéfique pour l’analyse CE conventionnelle de petites molécules en raison de sa capacité à conduire des espèces neutres ou chargées de manière opposée au détecteur, il compromet l’efficacité de séparation des espèces de protéines de tailles et de charges...

Il est important de distinguer les espèces protéiques dans différents états conformationnels, de liaison ou de modification et de caractériser leurs différences structurelles pour surveiller les voies de transition entre ces espèces impliquées dans des événements biologiques, allant de la reconnaissance moléculaire à la catalyse enzymatique, et comprendre les mécanismes sous-jacents à ces événements. Les techniques biophysiques conventionnelles ne fournissent pas une solution complète en raison des limites telles que la résolution insuffisante et la perte d’informations dynamiques dans la solution. L’échange hydrogène/deutérium couplé à la spectrométrie de masse (HDX MS) est une technique qui marque les caractéristiques structurelles et conformationnelles des protéines avec le deutérium (2H) via l’échange entre les atomes d’hydrogène labile des protéines et 2H de la solution 2H2Odélibérément introduite. Les protons impliqués dans la liaison hydrogène ou qui sont séquestrés du solvant à l’intérieur de la protéine ne s’échangent pas facilement1. Ainsi, comme le taux de change sur un site échangeable dépend fortement de son implication dans des structures d’ordre supérieur, les structures protéiques peuvent être révélées à haute résolution spatiale par MS qui sonde l’étendue et le taux d’absorption de 2H en fonction des différentes masses atomiques entre 1H et 2H. Au cours des dernières décennies, HDX MS est devenu une technique remarquablement réussie pour étudier les conformations et la dynamique des protéines2.
Dans l’approche ascendante classique de HDX MS, l’ensemble des espèces protéiques dans différents états de conformation, de liaison ou de modification est protéolysé sans séparation au niveau des protéines intactes, ce qui rend impossible de caractériser des espèces individuelles en analysant les fragments protéolytiques résultants avec des teneurs en deutérium alambiquées. En revanche, dans l’approche descendante, différents états protéiques ou protéoformes qui ont incorporé différentes teneurs en deutérium donnent lieu à de multiples distributions de masses protéiques intactes dans un scan MS. Cela permet de séparer les espèces individuelles par la sélection de masse d’ions correspondant à chaque distribution de masse à l’aide d’un filtre de masse approprié (tel qu’un quadripolaire) et la caractérisation de leurs différences conformationnelles dans l’analyse ultérieure en tandem MS 3,4,5,6. Cependant, l’efficacité de la séparation des états protéiques ou des protéoformes dans cette stratégie est limitée par l’ampleur de la différence dans leurs distributions de masse correspondantes.
L’électrophorèse capillaire (EC) fournit un moyen de séparer les espèces de protéines en fonction de leurs différentes charges et tailles hydrodynamiques dans la phase de solution avec une efficacité élevée7. La combinaison de CE avec HDX offre une séparation supplémentaire des états protéiques ou protéoformes dans la phase de solution. De plus, le petit volume du capillaire CE permet l’utilisation d’une solution entièrement deutérée comme solution d’électrolyte de fond (BGE), c’est-à-dire le tampon de fonctionnement, rendant le capillaire comme un réacteur HDX pour les échantillons de protéines. En raison de la différence de mobilité électrophorétique entre les protéines et les réactifs protiques dans le processus d’électrophorèse, la conduite de HDX pendant l’EC entraîne un environnement de deutération presque complet pour les analytes protéiques avec un contenu résiduel non deutéré minimal, améliorant ainsi la sensibilité de l’analyse structurelle à l’aide de données HDX. En tant que tel, nous avons développé une approche HDX différentielle basée sur CE couplée à une SEP descendante pour caractériser les structures d’ordre supérieur des protéines d’une manière spécifique à l’état ou à la protéoforme8.
Cet article décrit les protocoles de cette approche en détaillant les étapes de la préparation du matériel, de la procédure expérimentale et de l’analyse des données. Les facteurs susceptibles d’affecter les performances de la méthode ou la qualité des données sont énumérés dans de brèves notes. Les résultats représentatifs présentés ici comprennent des données HDX différentielles sur les mélanges de différentes protéines et variantes naturelles de la β-lactoglobuline bovine (β-lg), la principale protéine de lactosérum présente dans le lait9. Nous démontrons l’efficacité de séparation, la reproductibilité et les performances d’étiquetage 2H des deux variantes abondantes de β-lg, c’est-à-dire A et B10,11 lors du HDX basé sur CE et de la caractérisation spécifique à la variante de leurs conformations.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ammonium acetate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A/3446/50</td>
			<td>&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI 8000 plus capillary electrophoresis system</td>
			<td>Sciex, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5406000097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal filter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC201024</td>
			<td>10 kDa cutoff</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deuterium oxide</td>
			<td>Energy Chemical</td>
			<td>E090001</td>
			<td>99.9 % D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formic acid</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>&#160;270480250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fused silica glass capillary</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150017</td>
			<td>ID 50&#956;m, OD 360&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gas chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>GC6890N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydroxypropyl cellulose</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>H113415</td>
			<td>MW 100000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stirrers</td>
			<td>DLAB</td>
			<td>8030101212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A456-4</td>
			<td>MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microvolume UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>84677JK7731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myoglobin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td colspan="2">Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive UHMR mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium&#160;hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ubiquitin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U6253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasonicator</td>
			<td>SCIENTZ</td>
			<td>SB-5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-lactoglobulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L0130</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange for conformational characterization of proteins with top-down mass spectrometry

La résolution de l’hétérogénéité conformationnelle de plusieurs états protéiques qui coexistent en solution reste l’un des principaux obstacles à la caractérisation des thérapies protéiques et à la détermination des voies de transition conformationnelle essentielles aux fonctions biologiques, allant de la reconnaissance moléculaire à la catalyse enzymatique. La réaction d’échange hydrogène/deutérium (HDX) couplée à une analyse par spectrométrie de masse (MS) descendante fournit un moyen de caractériser les structures et la dynamique d’ordre supérieur des protéines d’une manière spécifique au conformateur. Le pouvoir de résolution conformationnelle de cette technique dépend fortement de l’efficacité de la séparation des états protéiques au niveau des protéines intactes et de la minimisation de la teneur protique résiduelle non deutérée pendant les réactions HDX. 
Nous décrivons ici une variante basée sur l’électrophorèse capillaire (CE) de l’approche HDX MS qui vise à améliorer la résolution conformationnelle. Dans cette approche, les protéines subissent des réactions HDX tout en migrant à travers une solution d’électrolyte de fond deutérée (BGE) pendant la séparation électrophorétique capillaire. Différents états protéiques ou protéoformes qui coexistent en solution peuvent être séparés efficacement en fonction de leurs différents rapports charge/taille. La différence de mobilité électrophorétique entre les protéines et les molécules de solvant protique minimise le solvant résiduel non deutéré, ce qui entraîne un environnement de deutération presque complet pendant le processus HDX. L’interface microviale CE-MS à écoulement permet une ionisation par électropulvérisation efficace des espèces protéiques éluées après un mélange rapide avec la solution modificateur de trempe et de dénaturation à la sortie du pulvérisateur. L’analyse descendante en ligne de la SEP mesure le niveau global de deutération des espèces protéiques intactes éluées et, par la suite, la deutération de leurs fragments en phase gazeuse. Cet article démontre cette approche dans le HDX différentiel pour les systèmes, y compris les variantes protéiques naturelles coexistant dans le lait.

La modification de la pression de perfusion de BGE permet d’ajuster à la fois l’efficacité de séparation et le temps de migration, ce qui équivaut au temps de réaction HDX des protéines à séparer (Figure 3). Une pression de perfusion plus faible se traduit par une meilleure séparation des pics CE au détriment de la durée de l’expérience (Figure 3A). Un temps de migration/réaction HDX plus long entraîne un niveau plus élevé de deutération d...

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Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Présenté ici est un protocole pour une approche d’échange hydrogène/deutérium (HDX) basée sur l’électrophorèse capillaire couplée à une spectrométrie de masse descendante. Cette approche caractérise la différence dans les structures d’ordre supérieur entre différentes espèces de protéines, y compris les protéines dans différents états et différentes protéoformes, en effectuant une séparation différentielle simultanée HDX et électrophorétique.

Échange hydrogène/deutérium basé sur l’électrophorèse capillaire pour la caractérisation conformationnelle des protéines avec spectrométrie de masse descendante

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Cette méthode permet de séparer les espèces protéiques coexistantes, y compris différents conformateurs ou variantes, et de caractériser en ligne leurs différences de structure d’ordre supérieur en une seule mesure CEMS. Il utilise l’effet électrophorétique pour fournir un environnement de près de 100% de durée pour les réactions HDX et la séparation orthogonale des espèces protéiques coexistantes pendant HDX pour l’analyse descendante de la SEP. Commencez par le préconditionnement de l’électrophorèse capillaire, de l’échange d’hydrogène deutérium ou de la configuration CE HDX.En utilisant les ultrasons dans un mélange de 50% de méthanol, 49% d’eau et 1% d’acide formique, nettoyez le flux à travers l’interface microviale CE-MS pendant au moins 30 minutes à température ambiante. Montez le capillaire modifié HPC sur l’électrophérèse capillaire ou l’instrument CE. Rincez le capillaire avec une solution d’électrolyte de fond ou BGE pendant 10 minutes à l’aide de l’échantillonneur automatique et laissez-le rempli avec le BGE.Utilisez une longueur appropriée de tube capillaire en silice fondue non modifiée comme tuyau de perfusion pour la solution modificateur. Utilisez un manchon d’union et approprié pour connecter le tuyau modificateur à une seringue en verre étanche aux gaz avec une température émoussée et rincez le tuyau avec la solution modificateur pendant au moins 10 minutes à l’aide d’une pompe à perfusion. Insérez les sorties du capillaire ceux codés HPC et des tubes modificateurs chargés des solutions correspondantes dans l’interface CE-MS nettoyée.Avancez la seringue avec les pompes à perfusion de manière à ce que la solution modificateur atteigne l’extrémité de l’interface. Montez l’interface CE-MS assemblée sur un boîtier de source d’ionisation par pulvérisation de nano-électrons d’un spectromètre de masse. Appliquez une tension de pulvérisation de 3 à 5 kilovolts sur l’interface CE-MS.Infuser la solution modificateur avec la pompe de l’infuseur à un débit allant de 0,1 à 10 microlitres par minute et assurer une électropulvérisation stable à l’extrémité de l’interface CE-MS. Placez le flacon d’échantillon contenant le BGE et l’échantillonneur automatique, qui sera utilisé plus tard pour acquérir des électrophérogrammes vierges et des spectres de masse vierges. Estimer le volume d’injection en utilisant la relation entre le volume d’injection et les paramètres d’injection.Et injectez la solution d’échantillon à l’aide de l’échantillonneur automatique à deux PSI pendant une durée appropriée. Commencez la séparation CE en appliquant une tension électrophorétique de 20 kilovolts dans une pression de perfusion allant de 0 à 2 PSI et acquérez l’électrophérogramme. Pendant ce temps, acquérir les données MS en mode chromatographique où le graphique de courant ionique est acquis en fonction du temps et les scans MS correspondants ne sont pas automatiquement combinés en un seul spectre.Enregistrez l’électrophérogramme vierge et les spectres de masse comme références. Placez les flacons d’échantillon contenant les concentrations souhaitées des solutions d’échantillons de protéines dans l’auto-échantillonneur et acquérez les électrophérogrammes et les spectres MS1 des espèces de protéines séparées électrophorétiquement et marquées au deutérium. Effectuer des mesures Ms.en tandem pour les espèces d’intérêt, soit après avoir acquis les spectres MS1 au cours de la même série, soit lors d’une exécution séparée ultérieure.Après chaque mesure, rincer le capillaire avec du BGE à une pression de 20 PSI pendant au moins 10 minutes. Nettoyez l’interface CEMS et tous les tubes pour le stockage à la fin des expériences. Acquérir un ensemble de données de l’échantillon de point final HDX avec SEP en mode perfusion directe.Une faible pression d’infusion a entraîné une meilleure séparation des pics CE, mais a entraîné une augmentation du temps de migration et de la durée de l’expérience. Un temps de réaction HDX plus long a entraîné un niveau plus élevé de durabilité des analytes protéiques. La variance A et B de l’immunoglobuline bêta ou bêta IG, qui ne diffèrent que par deux résidus d’acides aminés dans leur séquence, a donné lieu à deux pics correctement séparés dans l’électrophérogramme dérivé de l’EIC.La variance différentielle marquée au deutérium a entraîné une distribution de masse distincte des ions. Un nombre plus faible d’ions Z que d’ions C a été observé en raison de la liaison dysofiée unique dans la confirmation de l’IG bêta qui limite l’efficacité de fragmentation entre CS 82 et CS 176. La plupart des ions fragments produits à partir de l’IGA bêta et de l’IGB bêta présentent une absorption similaire du deutérium.Cependant, les segments plus importants couvrant les sites de variation de séquence de l’IGA bêta ont été d’autant plus déduis que l’IGB bêta. Le pH de BGE est ajusté en fonction du point isoélectrique de l’échantillon pour empêcher l’agrégation des protéines et faciliter la séparation tout en maintenant le complexe.

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