Name: capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange for conformational characterization of proteins with top-down mass spectrometry
Uploaded: 2021-06-08T14:00:00
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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (NSFC 21974069) unterstützt. Die Autoren erhielten auch Unterstützung vom Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, China; Jiangsu Collaborative Innovation Center für biomedizinische Funktionsmaterialien; und Jiangsu Key Laboratory of Biomedical Materials an der Nanjing Normal University, China.

HINWEIS: Verwenden Sie nach Möglichkeit Hochleistungsreagenzien in Flüssigkeitschromatographie (HPLC) oder MS-Qualität, um die Verunreinigungen zu minimieren, die die MS-Analyse beeinträchtigen können. Berühren Sie die CE-MS-Schnittstelle während der Messung nicht mit bloßen Händen, um die Möglichkeit eines elektrischen Schlags zu vermeiden, der entweder durch die elektrophoretische Spannung oder die Elektrosprayspannung verursacht wird.
1. Materialaufbereitung
<ol><li>Modifikation...

<ol>
	<li>Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+methods+in+characterization+of+the+higher+order+structure+of+protein+therapeutics.">Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169 (2020).</li><li>Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry.">Developments in hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 93 (1), 567-582 (2021).</li><li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformer-specific+hydrogen+exchange+analysis+of+Abeta(1-42)+oligomers+by+top-down+electron+capture+dissociation+mass+spectrometry.">Conformer-specific hydrogen exchange analysis of Abeta(1-42) oligomers by top-down electron capture dissociation mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 83 (13), 5386-5393 (2011).</li><li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+small+soluble+Abeta(1-40)+oligomers+studied+by+top-down+hydrogen+exchange+mass+spectrometry.">Structure and dynamics of small soluble Abeta(1-40) oligomers studied by top-down hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Biochemistry. 51 (17), 3694-3703 (2012).</li><li>Pan, J., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+structural+analysis+of+posttranslationally+modified+proteins+by+Fourier+transform+ion+cyclotron+resonance-MS+with+hydrogen/deuterium+exchange+and+electron+capture+dissociation.">Top-down structural analysis of posttranslationally modified proteins by Fourier transform ion cyclotron resonance-MS with hydrogen/deuterium exchange and electron capture dissociation.</a> Proteomics. 13 (6), 974-981 (2013).</li><li>Wang, G., Abzalimov, R. R., Bobst, C. E., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformer-specific+characterization+of+nonnative+protein+states+using+hydrogen+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Conformer-specific characterization of nonnative protein states using hydrogen exchange and top-down mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United. States of America. 110 (50), 20087-20092 (2013).</li><li>Mironov, G. G., Clouthier, C. M., Akbar, A., Keillor, J. W., Berezovski, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+enzyme+structure+and+activity+by+kinetic+capillary+electrophoresis-MS.">Simultaneous analysis of enzyme structure and activity by kinetic capillary electrophoresis-MS.</a> Nature Chemical Biology. 12 (11), 918-922 (2016).</li><li>Shen, Y., Zhao, X., Wang, G., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+hydrogen/deuterium+exchange+during+proteoform+separation+enables+characterization+of+conformational+differences+between+coexisting+protein+states.">Differential hydrogen/deuterium exchange during proteoform separation enables characterization of conformational differences between coexisting protein states.</a> Analytical Chemistry. 91 (6), 3805-3809 (2019).</li><li>Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invited+review:+&#946;-lactoglobulin:+binding+properties,+structure,+and+function.">Invited review: &#946;-lactoglobulin: binding properties, structure, and function.</a> Journal of Dairy Science. 87 (4), 785-796 (2004).</li><li>Qin, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+Tanford+transition+of+bovine+&#946;-lactoglobulin.">Structural basis of the Tanford transition of bovine &#946;-lactoglobulin.</a> Biochemistry. 37 (40), 14014-14023 (1998).</li><li>Qin, B. Y., Bewley, M. C., Creamer, L. K., Baker, E. N., Jameson, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+implications+of+structural+differences+between+variants+A+and+B+of+bovine+beta-lactoglobulin.">Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin.</a> Protein Science. 8 (1), 75-83 (1999).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+capillary+isoelectric+focusing+mass+spectrometry+analysis+of+peptides,+proteins,+and+monoclonal+antibodies+with+a+flow-through+microvial+interface.">High resolution capillary isoelectric focusing mass spectrometry analysis of peptides, proteins, and monoclonal antibodies with a flow-through microvial interface.</a> Analytical Chemistry. 90 (15), 9495-9503 (2018).</li><li>Busch, M. H. A., Kraak, J. C., Poppe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+acetate-coated+fused-silica+capillaries+for+the+separation+of+proteins+by+capillary+zone+electrophoresis.">Cellulose acetate-coated fused-silica capillaries for the separation of proteins by capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography A. 1695 (2), 287-296 (1995).</li><li>Zhao, X., Shen, Y., Tong, W., Wang, G., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deducing+disulfide+patterns+of+cysteine-rich+proteins+using+signature+fragments+produced+by+top-down+mass+spectrometry.">Deducing disulfide patterns of cysteine-rich proteins using signature fragments produced by top-down mass spectrometry.</a> Analyst. 143 (4), 817-823 (2018).</li><li>Sutera, S. P., Skalak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+Poiseuille's+law.">The history of Poiseuille's law.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 25 (1), 1-20 (1993).</li><li>Wang, G., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+characterization+of+the+higher+order+structure+of+disulfide-containing+proteins+using+hydrogen/deuterium+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).</li><li>Wang, G., Johnson, A. J., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+electrospray+ionization+mass+spectrometry+as+a+tool+for+characterization+of+small+soluble+protein+aggregates.">Evaluation of electrospray ionization mass spectrometry as a tool for characterization of small soluble protein aggregates.</a> Analytical Chemistry. 84 (3), 1718-1724 (2012).</li><li>Fellers, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProSight+Lite:+graphical+software+to+analyze+top-down+mass+spectrometry+data.">ProSight Lite: graphical software to analyze top-down mass spectrometry data.</a> Proteomics. 15 (7), 1235-1238 (2015).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MASH+Suite+Pro:+A+comprehensive+software+tool+for+top-down+proteomics.">MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 15 (2), 703-714 (2016).</li><li>Paterson, G. R., Hill, J. P., Otter, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+&#946;-lactoglobulin+A,+B+and+C+variants+of+bovine+whey+using+capillary+zone+electrophoresis.">Separation of &#946;-lactoglobulin A, B and C variants of bovine whey using capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography A. 700 (1), 105-110 (1995).</li><li>Wang, G., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+characterization+of+the+higher+order+structure+of+disulfide-containing+proteins+using+hydrogen/deuterium+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).</li><li>Nicolardi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-line+electrochemical+reduction+of+disulfide+bonds:+improved+FTICR-CID+and+-ETD+coverage+of+oxytocin+and+hepcidin.">On-line electrochemical reduction of disulfide bonds: improved FTICR-CID and -ETD coverage of oxytocin and hepcidin.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (12), 1980-1987 (2013).</li><li>Adhikari, S., Xia, Y., McLuckey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+analysis+of+disulfide-linked+proteins+using+photoinduced+radical+reactions+and+ET-DDC.">Top-down analysis of disulfide-linked proteins using photoinduced radical reactions and ET-DDC.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 444, 116173 (2019).</li><li>Rush, M. J. P., Riley, N. M., Westphall, M. S., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+characterization+of+proteins+with+intact+disulfide+bonds+using+activated-ion+electron+transfer+dissociation.">Top-down characterization of proteins with intact disulfide bonds using activated-ion electron transfer dissociation.</a> Analytical Chemistry. 90 (15), 8946-8953 (2018).</li><li>Zhong, X., Maxwell, E. J., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transport+in+a+micro+flow-through+vial+of+a+junction-at-the-tip+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry+interface.">Mass transport in a micro flow-through vial of a junction-at-the-tip capillary electrophoresis-mass spectrometry interface.</a> Analytical Chemistry. 83 (12), 4916-4923 (2011).</li></ol>

Zu den Zielen der Beschichtung der Innenwand der CE-Kapillare gehören die Minimierung des elektroosmotischen Flusses und die Proteinabsorption während des CE-Prozesses13. Obwohl der elektroosmotische Fluss für die konventionelle CE-Analyse kleiner Moleküle von Vorteil ist, da er neutrale oder entgegengesetzt geladene Spezies zum Detektor treiben kann, beeinträchtigt er die Trenneffizienz von Proteinspezies mit ähnlichen Größen und Nettoladungen in Lösung. Die Beschichtung der Kapillare mi...

Die Unterscheidung von Proteinspezies in verschiedenen Konformations-, Bindungs- oder Modifikationszuständen und die Charakterisierung ihrer strukturellen Unterschiede sind wichtig, um die Wege der Übergänge zwischen diesen Spezies zu überwachen, die an biologischen Ereignissen beteiligt sind, von der molekularen Erkennung bis zur enzymatischen Katalyse, und um die Mechanismen zu verstehen, die diesen Ereignissen zugrunde liegen. Herkömmliche biophysikalische Techniken bieten aufgrund der Einschränkungen wie unzureichende Auflösung und Verlust dynamischer Informationen in der Lösung keine vollständige Lösung. Der Wasserstoff/Deuterium-Austausch in Verbindung mit der Massenspektrometrie (HDX MS) ist eine Technik, die die Struktur- und Konformationsmerkmale von Proteinen mit Deuterium (2 H) über den Austausch zwischen labilen Wasserstoffatomen von Proteinen und 2 H aus der absichtlich eingeführten 2H2O-Lösung markiert. Protonen, die an der Wasserstoffbrückenbindung beteiligt sind oder die aus dem Lösungsmittel im Proteininneren sequestriert werden, tauschen nicht leicht1 aus. Da die Wechselkursrate an einem austauschbaren Ort stark von seiner Beteiligung an Strukturen höherer Ordnung abhängt, können die Proteinstrukturen mit hoher räumlicher Auflösung von MS aufgedeckt werden, die das Ausmaß und die Rate der 2-H-Aufnahme basierend auf den unterschiedlichen Atommassen zwischen 1H und 2H untersucht. HDX MS hat sich in den letzten Jahrzehnten zu einer herausragend erfolgreichen Technik zur Untersuchung von Proteinkonformationen und -dynamikenentwickelt 2.
Beim klassischen Bottom-up-Ansatz von HDX MS wird das Ensemble von Proteinspezies in verschiedenen Konformations-, Bindungs- oder Modifikationszuständen ohne Trennung auf intakter Proteinebene proteolysiert, so dass es nicht möglich ist, einzelne Spezies durch Analyse der resultierenden proteolytischen Fragmente mit konvolutem Deuteriumgehalt zu charakterisieren. Im Gegensatz dazu führen beim Top-Down-Ansatz verschiedene Proteinzustände oder Proteoformen, die unterschiedliche Deuteriumgehalte eingebaut haben, zu einer Mehrfachverteilung intakter Proteinmassen in einem MS-Scan. Dies ermöglicht die Trennung einzelner Spezies durch Massenselektion von Ionen entsprechend jeder Massenverteilung unter Verwendung eines geeigneten Massenfilters (z. B. eines Quadrupols) und die Charakterisierung ihrer Konformationsunterschiede in der anschließenden Tandem-MS-Analyse 3,4,5,6. Die Effizienz der Trennung von Proteinzuständen oder Proteoformen in dieser Strategie ist jedoch durch das Ausmaß der Differenz in ihren entsprechenden Massenverteilungen begrenzt.
Die Kapillarelektrophorese (CE) bietet die Möglichkeit, Proteinspezies basierend auf ihren unterschiedlichen Ladungen und hydrodynamischen Größen in der Lösungsphase mit hohem Wirkungsgradzu trennen 7. Die Kombination von CE mit HDX bietet eine zusätzliche Trennung von Proteinzuständen oder Proteoformen in der Lösungsphase. Darüber hinaus ermöglicht das geringe Volumen der CE-Kapillare die Verwendung einer vollständig deuterierten Lösung als Hintergrundelektrolytlösung (BGE), d. H. Der laufende Puffer, wodurch die Kapillare als HDX-Reaktor für Proteinproben dient. Aufgrund des Unterschieds in der elektrophoretischen Mobilität zwischen Proteinen und protischen Reagenzien im Elektrophoreseprozess führt die Durchführung von HDX während der CE zu einer nahezu vollständigen Deuterationsumgebung für die Proteinanalyten mit minimalen verbleibenden nicht deuterierten Inhalten, wodurch die Empfindlichkeit der Strukturanalyse unter Verwendung von HDX-Daten erhöht wird. Daher entwickelten wir einen CE-basierten differentiellen HDX-Ansatz in Verbindung mit Top-Down-MS, um Proteinstrukturen höherer Ordnung auf zustands- oder proteoformspezifische Weise zu charakterisieren8.
Dieses Papier beschreibt Protokolle für diesen Ansatz, indem die Schritte der Materialvorbereitung, des experimentellen Verfahrens und der Datenanalyse detailliert beschrieben werden. Faktoren, die sich auf die Methodenleistung oder die Datenqualität auswirken können, sind in kurzen Anmerkungen aufgeführt. Zu den repräsentativen Ergebnissen, die hier vorgestellt werden, gehören differentielle HDX-Daten von Mischungen verschiedener Proteine und natürlichen Varianten von Rinder-β-Lactoglobulin (β-lg), dem wichtigsten Molkenprotein in Milch9. Wir demonstrieren die Trenneffizienz, Reproduzierbarkeit und 2-H-Markierungsleistung der beiden reichlich vorhandenen Varianten von β-lg, d.h. A und B10,11 während der CE-basiertenHDX und variantenspezifischen Charakterisierung ihrer Konformationen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ammonium acetate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A/3446/50</td>
			<td>&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI 8000 plus capillary electrophoresis system</td>
			<td>Sciex, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5406000097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal filter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC201024</td>
			<td>10 kDa cutoff</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deuterium oxide</td>
			<td>Energy Chemical</td>
			<td>E090001</td>
			<td>99.9 % D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formic acid</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>&#160;270480250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fused silica glass capillary</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150017</td>
			<td>ID 50&#956;m, OD 360&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gas chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>GC6890N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydroxypropyl cellulose</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>H113415</td>
			<td>MW 100000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stirrers</td>
			<td>DLAB</td>
			<td>8030101212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A456-4</td>
			<td>MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microvolume UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>84677JK7731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myoglobin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td colspan="2">Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive UHMR mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium&#160;hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ubiquitin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U6253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasonicator</td>
			<td>SCIENTZ</td>
			<td>SB-5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-lactoglobulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L0130</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange for conformational characterization of proteins with top-down mass spectrometry

Die Auflösung der Konformationsheterogenität mehrerer Proteinzustände, die in Lösung koexistieren, bleibt eines der Haupthindernisse bei der Charakterisierung von Proteintherapeutika und der Bestimmung der für biologische Funktionen kritischen Konformationsübergangswege, die von der molekularen Erkennung bis zur enzymatischen Katalyse reichen. Die Reaktion auf Wasserstoff/Deuterium-Austausch (HDX) in Verbindung mit der top-down-Massenspektrometrie (MS) bietet ein Mittel, um Proteinstrukturen und -dynamiken höherer Ordnung konformitätsspezifisch zu charakterisieren. Das Konformationsauflösungsvermögen dieser Technik hängt stark von den Wirkungsgraden der Trennung von Proteinzuständen auf intakter Proteinebene und der Minimierung des verbleibenden nicht deuterierten Protikgehalts während der HDX-Reaktionen ab. 
Hier beschreiben wir eine auf Kapillarelektrophorese (CE) basierende Variante des HDX MS-Ansatzes, die darauf abzielt, die Konformationsauflösung zu verbessern. Bei diesem Ansatz durchlaufen Proteine HDX-Reaktionen, während sie während der kapillaren elektrophoretischen Trennung durch eine deuterierte Hintergrundelektrolytlösung (BGE) wandern. Verschiedene Proteinzustände oder Proteoformen, die in Lösung koexistieren, können aufgrund ihrer unterschiedlichen Ladungs-zu-Größe-Verhältnisse effizient getrennt werden. Der Unterschied in der elektrophoretischen Mobilität zwischen Proteinen und protischen Lösungsmittelmolekülen minimiert das verbleibende nicht deuterierte Lösungsmittel, was zu einer nahezu vollständigen Deuterationsumgebung während des HDX-Prozesses führt. Die durchströmende mikroviale CE-MS-Grenzfläche ermöglicht eine effiziente Elektrosprayionisation der eluierten Proteinspezies nach einer schnellen Vermischung mit der Abschreck- und Denaturierungsmodifikatorlösung am Ausgang des Sprühgeräts. Die Online-Top-Down-MS-Analyse misst das globale Deuterationsniveau der eluierten intakten Proteinspezies und anschließend die Deuteration ihrer Gasphasenfragmente. Dieses Papier demonstriert diesen Ansatz in differentiellem HDX für Systeme, einschließlich der natürlichen Proteinvarianten, die in Milch koexistieren.

Die Änderung des Infusionsdrucks von BGE ermöglicht die Einstellung sowohl der Abscheideeffizienz als auch der Migrationszeit, die der HDX-Reaktionszeit der zu trennenden Proteine entspricht (Abbildung 3). Ein niedrigerer Infusionsdruck führt zu einer besseren Trennung der CE-Spitzen auf Kosten der Dauer des Experiments (Abbildung 3A). Eine längere Migrations-/HDX-Reaktionszeit führt zu einer höheren Deuteration der Proteinanalyten (Ab...

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Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Hier wird ein Protokoll für einen Kapillarelektrophorese-basierten Wasserstoff/Deuterium-Austausch (HDX)-Ansatz in Verbindung mit Top-Down-Massenspektrometrie vorgestellt. Dieser Ansatz charakterisiert den Unterschied in Strukturen höherer Ordnung zwischen verschiedenen Proteinspezies, einschließlich Proteinen in verschiedenen Zuständen und verschiedenen Proteoformen, indem er gleichzeitig differentielle HDX- und elektrophoretische Trennung durchführt.

Kapillarelektrophorese-basierter Wasserstoff/Deuterium-Austausch zur Konformationscharakterisierung von Proteinen mit Top-down-Massenspektrometrie

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Diese Methode ermöglicht die Trennung von koexistierenden Proteinspezies, einschließlich verschiedener Konformer oder Varianten, und die Online-Charakterisierung ihrer Strukturunterschiede höherer Ordnung in einer einzigen CEMS-Messung. Es nutzt den elektrophoretischen Effekt, um eine Umgebung von nahezu 100% Dauer für die HDX-Reaktionen und die orthogonale Trennung der koexistierenden Proteinspezies während HDX für die Top-Down-MS-Analyse bereitzustellen. Beginnen Sie mit der Vorkonditionierung der Kapillarelektrophorese, des Wasserstoffdeuteriumaustauschs oder des CE-HDX-Setups.Verwenden Sie Ultraschall in einer Mischung aus 50% Methanol, 49% Wasser und 1% Ameisensäure, reinigen Sie den Fluss durch die mikroflächliche CE-MS-Grenzfläche für mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur. Montieren Sie die HPC-modifizierte Kapillare auf dem Kapillarelektropherese- oder CE-Instrument. Spülen Sie die Kapillare mit Hintergrundelektrolytlösung oder BGE für 10 Minuten mit dem automatischen Probenehmer ab und lassen Sie sie mit dem BGE gefüllt.Verwenden Sie eine angemessene Länge des unmodifizierten Kapillarschlauchs für Quarzglas als Infusionsschlauch für die Modifikatorlösung. Verwenden Sie eine Union und eine geeignete Hülse, um den Modifikatorschlauch mit einer gasdichten Glasspritze mit einer stumpfen Temperatur zu verbinden, und spülen Sie den Schlauch mit der Modifikatorlösung mindestens 10 Minuten lang mit einer Infusionspumpe ab. Setzen Sie die Auslässe der HPC-codierten CE-Kapillar- und Modifikatorschläuche, die mit den entsprechenden Lösungen beladen sind, in die gereinigte CE-MS-Schnittstelle ein.Schieben Sie die Spritze mit den Infusionspumpen so vor, dass die Modifikatorlösung die Spitze der Grenzfläche erreicht. Montieren Sie die montierte CE-MS-Grenzfläche auf einem Nano-Elektronensprüh-Ionisationsquellengehäuse eines Massenspektrometers. Legen Sie eine Sprühspannung von 3-5 Kilovolt an die CE-MS-Schnittstelle an.Gießen Sie die Modifikatorlösung mit der Infuser-Pumpe bei einer Durchflussrate von 0,1-10 Mikrolitern pro Minute und sorgen Sie für ein stabiles Elektrospray an der Spitze der CE-MS-Schnittstelle. Platzieren Sie die Probendurchstechflasche mit der BGE und dem automatischen Probenehmer, die später zur Erfassung von leeren Elektropherogrammen und leeren Massenspektren verwendet werden. Schätzen Sie das Injektionsvolumen anhand der Beziehung zwischen Injektionsvolumen und Injektionsparametern.Und injizieren Sie die Probenlösung mit dem automatischen Probenehmer bei zwei PSI für eine angemessene Dauer. Beginnen Sie die CE-Trennung, indem Sie eine elektrophoretische Spannung von 20 Kilovolt in einem Infusionsdruck von 0-2 PSI anlegen und das Elektropherogramm erfassen. In der Zwischenzeit erfassen Sie die MS-Daten im chromatographischen Modus, in dem der Ionenstromgraph als Funktion der Zeit erfasst wird und die entsprechenden MS-Scans nicht automatisch zu einem einzigen Spektrum kombiniert werden.Speichern Sie das leere Elektropherogramm und die Massenspektren als Referenzen. Legen Sie die Probenfläschchen mit den gewünschten Konzentrationen der Proteinprobenlösungen in den Autosampler und erfassen Sie die Elektropherogramme und MS1-Spektren der elektrophoretisch getrennten und deuteriummarkierten Proteinspezies. Führen Sie Tandem-Ms.-Messungen für die interessierenden Spezies durch, entweder nach der Erfassung der MS1-Spektren innerhalb desselben Laufs oder in einem nachfolgenden separaten Durchlauf.Nach jeder Messung spülen Sie die Kapillare mit BGE bei einem Druck von 20 PSI für mindestens 10 Minuten. Reinigen Sie die CEMS-Schnittstelle und alle Schläuche zur Lagerung nach Abschluss der Experimente. Erfassen Sie einen Datensatz der HDX-Endpunktprobe mit MS im direkten Infusionsmodus.Ein niedriger Infusionsdruck führte zu einer besseren Trennung der CE-Spitzen, führte jedoch zu einer Erhöhung sowohl der Migrationszeit als auch der Dauer des Experiments. Eine längere HDX-Reaktionszeit führte zu einem höheren Grad an Enthärtung der Proteinanalyten. Die A- und B-Varianz von Beta-Immunglobulin oder Beta-IG, die sich in ihrer Sequenz nur durch zwei Aminosäurereste unterscheiden, führte zu zwei ausreichend getrennten Peaks im EIC-abgeleiteten Elektropherogramm.Die differentielle Deuterium-markierte Varianz führte zu einer deutlichen Massenverteilung der Ionen. Eine geringere Anzahl in der relativen Häufigkeit von Z-Ionen als C-Ionen wurde aufgrund der einzigartigen dysofiierten Verknüpfung bei der Bestätigung von Beta-IG beobachtet, die die Fragmentierungseffizienz zwischen CS 82 und CS 176 begrenzt. Die meisten Fragmentionen, die aus Beta-IGA und Beta-IGB hergestellt werden, weisen ein ähnliches Ausmaß an Deuteriumaufnahme auf.Die größeren Segmente, die die Sequenzvariationsstellen von Beta-IGA abdeckten, waren jedoch in einem signifikant größeren Ausmaß als Beta-IGB deduziert. Der pH-Wert von BGE wird entsprechend dem isoelektrischen Punkt der Probe eingestellt, um die Proteinaggregation zu verhindern und die Trennung unter Beibehaltung des Komplexes zu erleichtern.

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