Name: capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange for conformational characterization of proteins with top-down mass spectrometry
Uploaded: 2021-06-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NSFC 21974069). המחברים קיבלו גם תמיכה מהמכון לניתוח תאים, מעבדת מפרץ שנזן, סין; מרכז החדשנות השיתופית של ג'יאנגסו לחומרים פונקציונליים ביו-רפואיים; והמעבדה העיקרית של ג'יאנגסו לחומרים ביו-רפואיים באוניברסיטת נאנג'ינג נורמל, סין.

הערה: השתמש ברמת כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) בעלת ביצועים גבוהים או ריאגנטים בדרגת MS במידת האפשר כדי למזער את המזהמים שעלולים להפריע לניתוח טרשת נפוצה. אין לגעת בממשק CE-MS בידיים חשופות במהלך המדידה כדי למנוע את האפשרות של הלם חשמלי הנגרם על ידי מתח אלקטרופורטי או מתח electrospray.
1. הכנ...

<ol>
	<li>Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+methods+in+characterization+of+the+higher+order+structure+of+protein+therapeutics.">Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169 (2020).</li><li>Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry.">Developments in hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 93 (1), 567-582 (2021).</li><li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformer-specific+hydrogen+exchange+analysis+of+Abeta(1-42)+oligomers+by+top-down+electron+capture+dissociation+mass+spectrometry.">Conformer-specific hydrogen exchange analysis of Abeta(1-42) oligomers by top-down electron capture dissociation mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 83 (13), 5386-5393 (2011).</li><li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+small+soluble+Abeta(1-40)+oligomers+studied+by+top-down+hydrogen+exchange+mass+spectrometry.">Structure and dynamics of small soluble Abeta(1-40) oligomers studied by top-down hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Biochemistry. 51 (17), 3694-3703 (2012).</li><li>Pan, J., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+structural+analysis+of+posttranslationally+modified+proteins+by+Fourier+transform+ion+cyclotron+resonance-MS+with+hydrogen/deuterium+exchange+and+electron+capture+dissociation.">Top-down structural analysis of posttranslationally modified proteins by Fourier transform ion cyclotron resonance-MS with hydrogen/deuterium exchange and electron capture dissociation.</a> Proteomics. 13 (6), 974-981 (2013).</li><li>Wang, G., Abzalimov, R. R., Bobst, C. E., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformer-specific+characterization+of+nonnative+protein+states+using+hydrogen+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Conformer-specific characterization of nonnative protein states using hydrogen exchange and top-down mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United. States of America. 110 (50), 20087-20092 (2013).</li><li>Mironov, G. G., Clouthier, C. M., Akbar, A., Keillor, J. W., Berezovski, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+enzyme+structure+and+activity+by+kinetic+capillary+electrophoresis-MS.">Simultaneous analysis of enzyme structure and activity by kinetic capillary electrophoresis-MS.</a> Nature Chemical Biology. 12 (11), 918-922 (2016).</li><li>Shen, Y., Zhao, X., Wang, G., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+hydrogen/deuterium+exchange+during+proteoform+separation+enables+characterization+of+conformational+differences+between+coexisting+protein+states.">Differential hydrogen/deuterium exchange during proteoform separation enables characterization of conformational differences between coexisting protein states.</a> Analytical Chemistry. 91 (6), 3805-3809 (2019).</li><li>Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invited+review:+&#946;-lactoglobulin:+binding+properties,+structure,+and+function.">Invited review: &#946;-lactoglobulin: binding properties, structure, and function.</a> Journal of Dairy Science. 87 (4), 785-796 (2004).</li><li>Qin, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+Tanford+transition+of+bovine+&#946;-lactoglobulin.">Structural basis of the Tanford transition of bovine &#946;-lactoglobulin.</a> Biochemistry. 37 (40), 14014-14023 (1998).</li><li>Qin, B. Y., Bewley, M. C., Creamer, L. K., Baker, E. N., Jameson, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+implications+of+structural+differences+between+variants+A+and+B+of+bovine+beta-lactoglobulin.">Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin.</a> Protein Science. 8 (1), 75-83 (1999).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+capillary+isoelectric+focusing+mass+spectrometry+analysis+of+peptides,+proteins,+and+monoclonal+antibodies+with+a+flow-through+microvial+interface.">High resolution capillary isoelectric focusing mass spectrometry analysis of peptides, proteins, and monoclonal antibodies with a flow-through microvial interface.</a> Analytical Chemistry. 90 (15), 9495-9503 (2018).</li><li>Busch, M. H. A., Kraak, J. C., Poppe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+acetate-coated+fused-silica+capillaries+for+the+separation+of+proteins+by+capillary+zone+electrophoresis.">Cellulose acetate-coated fused-silica capillaries for the separation of proteins by capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography A. 1695 (2), 287-296 (1995).</li><li>Zhao, X., Shen, Y., Tong, W., Wang, G., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deducing+disulfide+patterns+of+cysteine-rich+proteins+using+signature+fragments+produced+by+top-down+mass+spectrometry.">Deducing disulfide patterns of cysteine-rich proteins using signature fragments produced by top-down mass spectrometry.</a> Analyst. 143 (4), 817-823 (2018).</li><li>Sutera, S. P., Skalak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+Poiseuille's+law.">The history of Poiseuille's law.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 25 (1), 1-20 (1993).</li><li>Wang, G., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+characterization+of+the+higher+order+structure+of+disulfide-containing+proteins+using+hydrogen/deuterium+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).</li><li>Wang, G., Johnson, A. J., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+electrospray+ionization+mass+spectrometry+as+a+tool+for+characterization+of+small+soluble+protein+aggregates.">Evaluation of electrospray ionization mass spectrometry as a tool for characterization of small soluble protein aggregates.</a> Analytical Chemistry. 84 (3), 1718-1724 (2012).</li><li>Fellers, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProSight+Lite:+graphical+software+to+analyze+top-down+mass+spectrometry+data.">ProSight Lite: graphical software to analyze top-down mass spectrometry data.</a> Proteomics. 15 (7), 1235-1238 (2015).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MASH+Suite+Pro:+A+comprehensive+software+tool+for+top-down+proteomics.">MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 15 (2), 703-714 (2016).</li><li>Paterson, G. R., Hill, J. P., Otter, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+&#946;-lactoglobulin+A,+B+and+C+variants+of+bovine+whey+using+capillary+zone+electrophoresis.">Separation of &#946;-lactoglobulin A, B and C variants of bovine whey using capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography A. 700 (1), 105-110 (1995).</li><li>Wang, G., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+characterization+of+the+higher+order+structure+of+disulfide-containing+proteins+using+hydrogen/deuterium+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).</li><li>Nicolardi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-line+electrochemical+reduction+of+disulfide+bonds:+improved+FTICR-CID+and+-ETD+coverage+of+oxytocin+and+hepcidin.">On-line electrochemical reduction of disulfide bonds: improved FTICR-CID and -ETD coverage of oxytocin and hepcidin.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (12), 1980-1987 (2013).</li><li>Adhikari, S., Xia, Y., McLuckey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+analysis+of+disulfide-linked+proteins+using+photoinduced+radical+reactions+and+ET-DDC.">Top-down analysis of disulfide-linked proteins using photoinduced radical reactions and ET-DDC.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 444, 116173 (2019).</li><li>Rush, M. J. P., Riley, N. M., Westphall, M. S., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+characterization+of+proteins+with+intact+disulfide+bonds+using+activated-ion+electron+transfer+dissociation.">Top-down characterization of proteins with intact disulfide bonds using activated-ion electron transfer dissociation.</a> Analytical Chemistry. 90 (15), 8946-8953 (2018).</li><li>Zhong, X., Maxwell, E. J., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transport+in+a+micro+flow-through+vial+of+a+junction-at-the-tip+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry+interface.">Mass transport in a micro flow-through vial of a junction-at-the-tip capillary electrophoresis-mass spectrometry interface.</a> Analytical Chemistry. 83 (12), 4916-4923 (2011).</li></ol>

המטרות של ציפוי הקיר הפנימי של נימי CE כוללות את מזעור הזרימה האלקטרו-קוסמוטית וספיגת החלבון במהלך תהליך CE13. למרות שזרימה אלקטרוסמוטית מועילה לניתוח CE קונבנציונלי של מולקולות קטנות בשל יכולתה להניע מינים ניטרליים או טעונים הפוך לגלאי, היא פוגעת ביעילות ההפרדה של מינים חלבוני...

הבחנה בין מיני חלבונים במצבים קונפורמצונליים, מחייבים או משתנים שונים ואפיון ההבדלים המבניים שלהם חשובים לניטור מסלולי המעברים בין מינים אלה המעורבים באירועים ביולוגיים, החל מהכרה מולקולרית ועד קטליזה אנזימטית, והבנת המנגנונים העומדים בבסיס אירועים אלה. טכניקות ביופיסיות קונבנציונליות אינן מספקות פתרון מלא בשל מגבלות כגון רזולוציה לא מספקת ואובדן מידע דינמי בפתרון. חילופי מימן/דיאוטריום בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (HDX MS) היא טכניקה המתייגת את התכונות המבניות והקונפורמציה של חלבונים עם דיטריום (2H) באמצעות חילופים בין אטומי מימן שפתיים של חלבונים ו -2H מפתרון 2H2O שהוצג במכוון. פרוטונים המעורבים מליטה מימן או כי הם מבודדים מן הממס בפנים החלבון אינם מחליפים בקלות1. לפיכך, מכיוון ששער החליפין באתר הניתן להחלפה תלוי מאוד במעורבותו במבנים מסדר גבוה יותר, ניתן לחשוף את מבני החלבון ברזולוציה מרחבית גבוהה על ידי טרשת נפוצה הבוחנת את היקף וקצב ספיגת H של 2H בהתבסס על המסות האטומיות השונות בין 1H ל - 2H. במהלך העשורים האחרונים, HDX MS הפך לטכניקה מוצלחת להפליא לחקר קונפורמציות חלבון ודינמיקה2.
בגישה הקלאסית מלמטה למעלה של HDX MS, ההרכב של מינים חלבון במצבים קונפורמציה, מחייבים או שינוי שונים הוא proteolyzed ללא הפרדה ברמת החלבון שלם, מה שהופך אותו בלתי אפשרי לאפיין מינים בודדים על ידי ניתוח שברים פרוטאוליטיים וכתוצאה מכך עם תוכן deuterium מפותל. לעומת זאת, בגישה מלמעלה למטה, מצבי חלבון שונים או פרוטאופורמים ששילבו תוכן דיטריום שונה מעוררים הפצות מרובות של גושי חלבון שלמים בסריקת MS. זה מאפשר מינים בודדים להיות מופרדים על ידי בחירה המונית של יונים המתאימים לכל התפלגות מסה באמצעות מסנן מסה מתאים (כגון quadrupole) ואת האפיון של ההבדלים הקונפורמציה שלהם בניתוח MS הדו-מושבי הבא 3,4,5,6. עם זאת, היעילות של הפרדת מצבי חלבון או פרוטאופורמים באסטרטגיה זו מוגבלת על ידי מידת ההבדל בהפצות המסה המתאימות שלהם.
אלקטרופורזה נימית (CE) מספקת אמצעי להפרדת מיני חלבונים בהתבסס על המטענים השונים שלהם וגדלים הידרודינמיים בשלב הפתרון ביעילות גבוהה7. שילוב CE עם HDX מציע הפרדה נוספת של מצבי חלבון או פרוטאופורמים בשלב הפתרון. בנוסף, הנפח הקטן של נימי CE מאפשר ניצול של פתרון deuterated לחלוטין כמו פתרון אלקטרוליטים רקע (BGE), כלומר, חיץ פועל, עיבוד הנימים ככור HDX עבור דגימות חלבון. בשל ההבדל בניידות אלקטרופורטית בין חלבונים לבין ריאגנטים פרוטיים בתהליך האלקטרופורזה, ביצוע HDX במהלך CE גורם לסביבת deuterating כמעט מלאה עבור מנתחי חלבון עם תוכן שיורית מינימלית ללא deuteated, ובכך לשפר את הרגישות של הניתוח המבני באמצעות נתוני HDX. ככזה, פיתחנו גישת HDX דיפרנציאלית מבוססת CE בשילוב עם טרשת נפוצה מלמעלה למטה כדי לאפיין מבנים מסוג חלבון בסדר גבוה יותר באופן ספציפי למצב או פרוטאופורם8.
מאמר זה מתאר פרוטוקולים לגישה זו על-ידי פירוט שלבי הכנת החומרים, ההליך הניסיוני וניתוח הנתונים. גורמים שעשויים להשפיע על ביצועי השיטה או על איכות הנתונים מפורטים בהערות קצרות. התוצאות הייצוגיות המוצגות כאן כוללות נתוני HDX דיפרנציאליים של תערובות של חלבונים שונים ווריאנטים טבעיים של β-לקטוגלובולין בקר (β-lg), חלבון מי הגבינה העיקרי הנמצא בחלב9. אנו מדגימים יעילות הפרדה, רבייה וביצועי תיוג H של 2גרסאות שופעות של β-lg, כלומר, A ו- B10,11 במהלך HDX מבוסס CE ואפיון ספציפי לגרסה של הקונפורמציות שלהם.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ammonium acetate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A/3446/50</td>
			<td>&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI 8000 plus capillary electrophoresis system</td>
			<td>Sciex, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5406000097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal filter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC201024</td>
			<td>10 kDa cutoff</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deuterium oxide</td>
			<td>Energy Chemical</td>
			<td>E090001</td>
			<td>99.9 % D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formic acid</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>&#160;270480250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fused silica glass capillary</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150017</td>
			<td>ID 50&#956;m, OD 360&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gas chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>GC6890N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydroxypropyl cellulose</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>H113415</td>
			<td>MW 100000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stirrers</td>
			<td>DLAB</td>
			<td>8030101212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A456-4</td>
			<td>MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microvolume UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>84677JK7731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myoglobin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td colspan="2">Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive UHMR mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium&#160;hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ubiquitin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U6253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasonicator</td>
			<td>SCIENTZ</td>
			<td>SB-5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-lactoglobulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L0130</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange for conformational characterization of proteins with top-down mass spectrometry

פתרון הטרוגניות קונפורמציה של מצבי חלבון מרובים המתקיימים יחד בתמיסה נותר אחד המכשולים העיקריים באפיון של טיפולי חלבון וקביעת מסלולי המעבר הקונפורמציה הקריטיים לפונקציות ביולוגיות, החל מזיהוי מולקולרי ועד קטליזה אנזימטית. תגובת חילופי מימן/דיטריום (HDX) בשילוב עם ניתוח ספקטרומטרי מסה מלמעלה למטה (MS) מספקים אמצעי לאפיון מבנים ודינמיקה של חלבונים בסדר גבוה יותר באופן ספציפי לקונפורמיסט. כוח פתרון הקונפורמציה של טכניקה זו תלוי מאוד ביעילות של הפרדת מצבי חלבון ברמת החלבון בשלמותה ולמזעור שאריות התוכן הפרוטי שאינו מתויג במהלך תגובות ה-HDX. 
כאן אנו מתארים גרסה מבוססת אלקטרופורזה נימית (CE) של גישת HDX MS שמטרתה לשפר את הרזולוציה הקונפורמציה. בגישה זו, חלבונים עוברים תגובות HDX תוך כדי נדידה דרך פתרון אלקטרוליטי רקע deuteated (BGE) במהלך ההפרדה האלקטרופורטית הנימית. מצבי חלבון או פרוטאופורמים שונים הקיימים בתמיסה ניתנים להפרדה יעילה בהתבסס על יחסי הטעינה-לגודל השונים שלהם. ההבדל בניידות אלקטרופורטית בין חלבונים ומולקולות ממס פרוטיות ממזער את הממס השיורי שאינו מוערך, וכתוצאה מכך סביבת deuterating כמעט מלאה במהלך תהליך HDX. ממשק CE-MS המיקרוביאלי המיקרוביאלי מאפשר יינון אלקטרו-ספריי יעיל של מיני החלבון המנופחים לאחר ערבוב מהיר עם תמיסת המכפיל המרווה והדנטורינג בשקע המרסס. ניתוח הטרשת הנפוצה המקוון מלמעלה למטה מודד את רמת ההפחתה העולמית של מיני החלבון השלמים, ולאחר מכן, את ההפחתה של שברי שלב הגז שלהם. מאמר זה מדגים גישה זו ב-HDX דיפרנציאלי למערכות, כולל גרסאות החלבון הטבעיות הקיימות בחלב.

שינוי לחץ העירוי של BGE מאפשר התאמה של יעילות ההפרדה וזמן ההגירה, השווה לזמן התגובה של HDX של החלבונים (איור 3). לחץ עירוי נמוך יותר גורם להפרדה טובה יותר של פסגות CE במחיר של משך הניסוי (איור 3A). זמן תגובה ארוך יותר של הגירה/HDX מביא לרמה גבוהה יותר של הפחתת מנתחי הח?...

Watch this Scientific Journal Video about Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry at JoVE.com

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור אלקטרופורזה מבוססת אלקטרופורזה נימית מימן / דיוטריום חילופי (HDX) גישה בשילוב עם ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה. גישה זו מאפיינת את ההבדל במבנים מסדר גבוה יותר בין מיני חלבונים שונים, כולל חלבונים במצבים שונים ופרוטאופורמים שונים, על ידי ביצוע HDX דיפרנציאלי בו זמנית והפרדה אלקטרופורטית.

חילופי מימן/דיטריום מבוססי נימי אלקטרופורזה לאפיון קונפורמציה של חלבונים עם ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

שיטה זו מאפשרת הפרדה של מיני חלבונים דו-קיום, כולל קונפורמיסטים או וריאנטים שונים ואפיון מקוון של הבדלי מבנה הסדר הגבוה שלהם כדי להשלים במדידת CEMS אחת. הוא משתמש באפקט האלקטרופורטי כדי לספק סביבה של כמעט 100% עבור תגובות HDX והפרדה אורתוגונלית של מיני החלבון הדו-קיום במהלך HDX לניתוח טרשת נפוצה מלמעלה למטה. התחל עם תנאים מוקדמים של אלקטרופורזה נימית, חילופי דיטריום מימן או הגדרת CE HDX.באמצעות ultrasonication בתערובת של 50% מתנול, 49% מים ו 1% חומצה פורמית, לנקות את הזרימה באמצעות ממשק CE-MS מיקרוביאלי לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר. הר את הנימים המותאמים של HPC על אלקטרופרזיס נימי או מכשיר CE. לשטוף את הנימים עם פתרון אלקטרוליטים ברקע או BGE במשך 10 דקות באמצעות סמפלר אוטומטי ולהשאיר אותו מלא עם BGE.השתמש באורך מתאים של צינורות נימי סיליקה מותכים ללא שינוי כמו צינורות עירוי לפתרון צירוף. השתמש איחוד ושרוול מתאים כדי לחבר את צינורות מכפיל למזרק זכוכית הדוק גז עם טמפרטורת קהה ולשטוף את הצינורות עם פתרון מכפיל במשך 10 דקות לפחות באמצעות משאבת עירוי. הכנס את השקעים של צינורות CE-MS מקודדים של HPC שנטענו עם הפתרונות המתאימים לממשק CE-MS המנוקה.לקדם את המזרק עם משאבות עירוי כך פתרון צירוף מגיע לקצה הממשק. הר את ממשק CE-MS המורכב על מקור יינון תרסיס ננו אלקטרונים דיור של ספקטרומטר מסה. החל מתח ריסוס של 3-5 קילו-וולט על ממשק CE-MS.החדירו את פתרון הצירוף למשאבת האינפוזיה בקצב זרימה הנע בין 0.1-10 מיקרוליטרים לדקה והבטיחו תרסיס אלקטרו יציב בקצה ממשק CE-MS. מקם את בקבוקון המדגם המכיל את BGE ואת המדגם האוטומטי, אשר ישמש מאוחר יותר כדי לרכוש אלקטרופרוגרמה ריקה ספקטרום מסה ריקה. להעריך את נפח ההזרקה באמצעות הקשר בין נפח הזרקה ופרמטרים הזרקה.ולהזריק את הפתרון לדוגמה באמצעות סמפלר אוטומטי בשני PSI למשך זמן מתאים. התחל את הפרדת CE על ידי החלת מתח אלקטרופורטי של 20 קילו-וולט בלחץ עירוי הנע בין 0-2 PSI ולרכוש את האלקטרופרוגרמה. בינתיים, לרכוש את נתוני MS במצב כרומטוגרפי שבו הגרף הנוכחי יון נרכש כפונקציה של זמן וסריקות MS המתאימות אינן משולבות באופן אוטומטי לספקטרום יחיד.שמור את האלקטרופרוגרמה הריקה ואת ספקטרום המסה כהפניות. הניחו את הבקבוקונים לדוגמה המכילים את הריכוזים הרצויים של פתרונות דגימת החלבון בסמפלר האוטומטי ורכשו את האלקטרופרוגרמה ואת הספקטרום MS1 של מיני החלבון המופרדים אלקטרופורטית ודיאוטריום. בצע מדידות Ms.measurements דו-מושביות עבור מינים של עניין, או לאחר רכישת ספקטרום MS1 בתוך אותה ריצה או בריצה נפרדת עוקבת.לאחר כל מדידה, לשטוף את הנימים עם BGE בלחץ של 20 PSI במשך 10 דקות לפחות. נקו את ממשק CEMS ואת כל הצינורות לאחסון עם השלמת הניסויים. השג ערכת נתונים של דגימת נקודת הקצה HDX עם MS במצב עירוי ישיר.לחץ עירוי נמוך הביא להפרדה טובה יותר של פסגות CE, אך הוביל לעלייה הן בזמן ההגירה והן במשך הניסוי. זמן תגובה ארוך יותר של HDX הביא לרמה גבוהה יותר של הסתה של ניתוחי החלבון. השונות A ו- B של אימונוגלובולין בטא או בטא IG, אשר נבדלים על ידי רק שתי שאריות חומצת אמינו ברצף שלהם, הולידה שתי פסגות מופרדות כראוי אלקטרופרוגרמה נגזרת EIC.הדיאוטריום הדיפרנציאלי שכותרתו שונות הביאה לחלוקת מסה ברורה של יונים. מספר נמוך יותר בשפע יחסי של יוני Z מאשר יוני C נצפתה עקב הצמדה dysofied ייחודי באישור של בטא IG המגבילים את יעילות הפיצול בין CS 82 ו CS 176. רוב יוני השברים המיוצרים מביתא IGA, ובטא IGB מציגים מידה דומה של ספיגת דיטריום.עם זאת, המקטעים הגדולים יותר המכסים את אתרי וריאציית הרצף מביתא IGA הופחתו במידה רבה יותר באופן משמעותי מאשר בטא IGB. ה- pH של BGE מותאם על פי הנקודה האיזואלקטרית של המדגם כדי למנוע הצטברות חלבון ולהקל על ההפרדה תוך שמירה על המתחם.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Chemistry

Unit 1

Principles of Mass Spectrometry

SCIENTISTS IN ACTION

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

ניתוח דינמיקת חלבון באמצעות מימן Exchange ספקטרומטריית מסה

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

שינויי קונפורמציה Submillisecond בחלבונים נפתר על ידי photothermal Beam הסטה

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

ויזואליזציה של ספקטרומטריית אמביינט המוני עם השימוש של צילומי שליארן

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

וזמינותו HS-MRM עבור כימות של התא המארח חלבונים בחלבון ביופרמצבטיקה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית יון ניידות QTOF ספקטרומטר מסה

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

Microprobe נימי אלקטרופורזה ספקטרומטריית עבור מטבולומיקס תא בודד ב- Live צפרדע (צפרדע רפואית זריזה) העוברים

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometry

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometry

אפיון של פולימרים סינתטיים באמצעות מטריקס בסיוע לייזר Desorption יינון שעת הטיסה (MALDI-TOF) ספקטרומטר מסה

There are many techniques that can be employed in the characterization of synthetic homopolymers, but few provide as useful of information for end group ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

בקנה מידה גדול פרוטאומיקס מלמעלה למטה באמצעות ספקטרומטר מסה של טנדם אלקטרופורזה של אזור נים

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

מעקב סמים תפוקה גבוהה ומקיף באמצעות ספקטרומטר מסה אלקטרופורזה הזרקה-נימי Multisegment

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III))

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry CE-ICP-MS for Quantification of Iron Redox Species FeII, FeIII

התקנה של ספקטרומטריה של מסת פלזמה (CE-ICP-MS) לכמת את מיני ברזל רדוקס (Fe(II), Fe(III)

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

ספקטרומטריית מסה אלקטרופורזיס נימית גישות לאפיון החלבון וקורונה מטבולית שנרכשו על ידי ננו-חומרים

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...