Name: capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange for conformational characterization of proteins with top-down mass spectrometry
Uploaded: 2021-06-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (NSFC 21974069). Gli autori hanno anche ricevuto il supporto dell'Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, Cina; Jiangsu Collaborative Innovation Center of Biomedical Functional Materials; e Jiangsu Key Laboratory of Biomedical Materials presso la Nanjing Normal University, Cina.

NOTA: utilizzare reagenti di grado HPLC (Ad alte prestazioni) per cromatografia liquida (HPLC) o di grado MS quando possibile per ridurre al minimo i contaminanti che possono interferire con l'analisi della SM. Non toccare l'interfaccia CE-MS a mani nude durante la misurazione per evitare la possibilità di una scossa elettrica causata dalla tensione elettroforetica o dalla tensione elettrospray.
1. Preparazione del materiale
<ol><li>Modifica del capillare di silice fusa per CE<ol>
<li>Prepa...

<ol>
	<li>Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+methods+in+characterization+of+the+higher+order+structure+of+protein+therapeutics.">Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169 (2020).</li><li>Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry.">Developments in hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 93 (1), 567-582 (2021).</li><li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformer-specific+hydrogen+exchange+analysis+of+Abeta(1-42)+oligomers+by+top-down+electron+capture+dissociation+mass+spectrometry.">Conformer-specific hydrogen exchange analysis of Abeta(1-42) oligomers by top-down electron capture dissociation mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 83 (13), 5386-5393 (2011).</li><li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+small+soluble+Abeta(1-40)+oligomers+studied+by+top-down+hydrogen+exchange+mass+spectrometry.">Structure and dynamics of small soluble Abeta(1-40) oligomers studied by top-down hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Biochemistry. 51 (17), 3694-3703 (2012).</li><li>Pan, J., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+structural+analysis+of+posttranslationally+modified+proteins+by+Fourier+transform+ion+cyclotron+resonance-MS+with+hydrogen/deuterium+exchange+and+electron+capture+dissociation.">Top-down structural analysis of posttranslationally modified proteins by Fourier transform ion cyclotron resonance-MS with hydrogen/deuterium exchange and electron capture dissociation.</a> Proteomics. 13 (6), 974-981 (2013).</li><li>Wang, G., Abzalimov, R. R., Bobst, C. E., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformer-specific+characterization+of+nonnative+protein+states+using+hydrogen+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Conformer-specific characterization of nonnative protein states using hydrogen exchange and top-down mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United. States of America. 110 (50), 20087-20092 (2013).</li><li>Mironov, G. G., Clouthier, C. M., Akbar, A., Keillor, J. W., Berezovski, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+enzyme+structure+and+activity+by+kinetic+capillary+electrophoresis-MS.">Simultaneous analysis of enzyme structure and activity by kinetic capillary electrophoresis-MS.</a> Nature Chemical Biology. 12 (11), 918-922 (2016).</li><li>Shen, Y., Zhao, X., Wang, G., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+hydrogen/deuterium+exchange+during+proteoform+separation+enables+characterization+of+conformational+differences+between+coexisting+protein+states.">Differential hydrogen/deuterium exchange during proteoform separation enables characterization of conformational differences between coexisting protein states.</a> Analytical Chemistry. 91 (6), 3805-3809 (2019).</li><li>Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invited+review:+&#946;-lactoglobulin:+binding+properties,+structure,+and+function.">Invited review: &#946;-lactoglobulin: binding properties, structure, and function.</a> Journal of Dairy Science. 87 (4), 785-796 (2004).</li><li>Qin, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+Tanford+transition+of+bovine+&#946;-lactoglobulin.">Structural basis of the Tanford transition of bovine &#946;-lactoglobulin.</a> Biochemistry. 37 (40), 14014-14023 (1998).</li><li>Qin, B. Y., Bewley, M. C., Creamer, L. K., Baker, E. N., Jameson, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+implications+of+structural+differences+between+variants+A+and+B+of+bovine+beta-lactoglobulin.">Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin.</a> Protein Science. 8 (1), 75-83 (1999).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+capillary+isoelectric+focusing+mass+spectrometry+analysis+of+peptides,+proteins,+and+monoclonal+antibodies+with+a+flow-through+microvial+interface.">High resolution capillary isoelectric focusing mass spectrometry analysis of peptides, proteins, and monoclonal antibodies with a flow-through microvial interface.</a> Analytical Chemistry. 90 (15), 9495-9503 (2018).</li><li>Busch, M. H. A., Kraak, J. C., Poppe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+acetate-coated+fused-silica+capillaries+for+the+separation+of+proteins+by+capillary+zone+electrophoresis.">Cellulose acetate-coated fused-silica capillaries for the separation of proteins by capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography A. 1695 (2), 287-296 (1995).</li><li>Zhao, X., Shen, Y., Tong, W., Wang, G., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deducing+disulfide+patterns+of+cysteine-rich+proteins+using+signature+fragments+produced+by+top-down+mass+spectrometry.">Deducing disulfide patterns of cysteine-rich proteins using signature fragments produced by top-down mass spectrometry.</a> Analyst. 143 (4), 817-823 (2018).</li><li>Sutera, S. P., Skalak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+Poiseuille's+law.">The history of Poiseuille's law.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 25 (1), 1-20 (1993).</li><li>Wang, G., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+characterization+of+the+higher+order+structure+of+disulfide-containing+proteins+using+hydrogen/deuterium+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).</li><li>Wang, G., Johnson, A. J., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+electrospray+ionization+mass+spectrometry+as+a+tool+for+characterization+of+small+soluble+protein+aggregates.">Evaluation of electrospray ionization mass spectrometry as a tool for characterization of small soluble protein aggregates.</a> Analytical Chemistry. 84 (3), 1718-1724 (2012).</li><li>Fellers, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProSight+Lite:+graphical+software+to+analyze+top-down+mass+spectrometry+data.">ProSight Lite: graphical software to analyze top-down mass spectrometry data.</a> Proteomics. 15 (7), 1235-1238 (2015).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MASH+Suite+Pro:+A+comprehensive+software+tool+for+top-down+proteomics.">MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 15 (2), 703-714 (2016).</li><li>Paterson, G. R., Hill, J. P., Otter, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+&#946;-lactoglobulin+A,+B+and+C+variants+of+bovine+whey+using+capillary+zone+electrophoresis.">Separation of &#946;-lactoglobulin A, B and C variants of bovine whey using capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography A. 700 (1), 105-110 (1995).</li><li>Wang, G., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+characterization+of+the+higher+order+structure+of+disulfide-containing+proteins+using+hydrogen/deuterium+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).</li><li>Nicolardi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-line+electrochemical+reduction+of+disulfide+bonds:+improved+FTICR-CID+and+-ETD+coverage+of+oxytocin+and+hepcidin.">On-line electrochemical reduction of disulfide bonds: improved FTICR-CID and -ETD coverage of oxytocin and hepcidin.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (12), 1980-1987 (2013).</li><li>Adhikari, S., Xia, Y., McLuckey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+analysis+of+disulfide-linked+proteins+using+photoinduced+radical+reactions+and+ET-DDC.">Top-down analysis of disulfide-linked proteins using photoinduced radical reactions and ET-DDC.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 444, 116173 (2019).</li><li>Rush, M. J. P., Riley, N. M., Westphall, M. S., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+characterization+of+proteins+with+intact+disulfide+bonds+using+activated-ion+electron+transfer+dissociation.">Top-down characterization of proteins with intact disulfide bonds using activated-ion electron transfer dissociation.</a> Analytical Chemistry. 90 (15), 8946-8953 (2018).</li><li>Zhong, X., Maxwell, E. J., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transport+in+a+micro+flow-through+vial+of+a+junction-at-the-tip+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry+interface.">Mass transport in a micro flow-through vial of a junction-at-the-tip capillary electrophoresis-mass spectrometry interface.</a> Analytical Chemistry. 83 (12), 4916-4923 (2011).</li></ol>

Gli obiettivi del rivestimento della parete interna del capillare CE includono la minimizzazione del flusso elettroosmotico e l'assorbimento delle proteine durante il processo CE13. Sebbene il flusso elettroosmotico sia vantaggioso per l'analisi CE convenzionale di piccole molecole grazie alla sua capacità di guidare specie neutre o caricate in modo opposto al rivelatore, compromette l'efficienza di separazione di specie proteiche con dimensioni simili e cariche nette in soluzione. Rivestire il c...

Distinguere le specie proteiche in diversi stati conformazionali, leganti o modificativi e caratterizzare le loro differenze strutturali è importante per monitorare i percorsi di transizione tra queste specie coinvolte in eventi biologici, che vanno dal riconoscimento molecolare alla catalisi enzimatica, e comprendere i meccanismi alla base di questi eventi. Le tecniche biofisiche convenzionali non forniscono una soluzione completa a causa delle limitazioni come la risoluzione insufficiente e la perdita di informazioni dinamiche in soluzione. Lo scambio idrogeno/deuterio accoppiato con la spettrometria di massa (HDX MS) è una tecnica che etichetta le caratteristiche strutturali e conformazionali delle proteine con deuterio (2H) attraverso lo scambio tra atomi di idrogeno labile di proteine e 2H dalla soluzione di 2H2O deliberatamente introdotta. I protoni coinvolti nel legame idrogeno o che sono sequestrati dal solvente all'interno della proteina non si scambiano facilmente1. Pertanto, poiché il tasso di cambio in un sito scambiabile dipende fortemente dal suo coinvolgimento in strutture di ordine superiore, le strutture proteiche possono essere rivelate ad alta risoluzione spaziale da MS che sonda l'estensione e il tasso di assorbimento di 2H in base alle diverse masse atomiche tra 1H e 2H. Negli ultimi decenni, HDX MS è diventata una tecnica di eccezionale successo per lo studio delle conformazioni proteiche e delladinamica 2.
Nel classico approccio bottom-up di HDX MS, l'insieme di specie proteiche in diversi stati conformazionali, leganti o modificativi è proteolizzato senza separazione a livello proteico intatto, rendendo impossibile caratterizzare le singole specie analizzando i frammenti proteolitici risultanti con contenuto di deuterio contorto. Al contrario, nell'approccio top-down, diversi stati proteici o proteoforme che hanno incorporato diversi contenuti di deuterio danno origine a molteplici distribuzioni di masse proteiche intatte in una scansione della SM. Ciò consente di separare le singole specie mediante la selezione di massa di ioni corrispondenti a ciascuna distribuzione di massa utilizzando un filtro di massa appropriato (come un quadrupolo) e la caratterizzazione delle loro differenze conformazionali nella successiva analisi TANDEM MS 3,4,5,6. Tuttavia, l'efficienza della separazione degli stati proteici o dei proteoformi in questa strategia è limitata dall'entità della differenza nelle loro corrispondenti distribuzioni di massa.
L'elettroforesi capillare (CE) fornisce un mezzo per separare le specie proteiche in base alle loro diverse cariche e dimensioni idrodinamiche nella fase di soluzione con alta efficienza7. La combinazione di CE con HDX offre un'ulteriore separazione degli stati proteici o delle proteoforme nella fase di soluzione. Inoltre, il piccolo volume del capillare CE consente l'utilizzo di una soluzione completamente deuterata come soluzione elettrolitica di fondo (BGE), cioè il buffer in esecuzione, rendendo il capillare come reattore HDX per campioni proteici. A causa della differenza nella mobilità elettroforetica tra proteine e reagenti protici nel processo di elettroforesi, la conduzione di HDX durante la CE si traduce in un ambiente di deuterazione quasi completo per gli analiti proteici con contenuti residui non deuterati minimi, migliorando così la sensibilità dell'analisi strutturale utilizzando i dati HDX. Pertanto, abbiamo sviluppato un approccio HDX differenziale basato su CE accoppiato con SM top-down per caratterizzare le strutture proteiche di ordine superiore in modo specifico per stato o proteoforme8.
Questo documento descrive i protocolli per questo approccio dettagliando le fasi di preparazione dei materiali, procedura sperimentale e analisi dei dati. I fattori che possono influire sulle prestazioni del metodo o sulla qualità dei dati sono elencati in brevi note. I risultati rappresentativi qui presentati includono i dati HDX differenziali di miscele di diverse proteine e varianti naturali di β-lattoglobulina bovina (β-lg), la principale proteina del siero di latte presente nel latte9. Dimostriamo l'efficienza di separazione, la riproducibilità e le prestazioni di etichettatura 2H delle due abbondanti varianti di β-lg, cioè A e B10,11 durante l'HDX basato su CE e la caratterizzazione specifica della variante delle loro conformazioni.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ammonium acetate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A/3446/50</td>
			<td>&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI 8000 plus capillary electrophoresis system</td>
			<td>Sciex, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5406000097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal filter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC201024</td>
			<td>10 kDa cutoff</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deuterium oxide</td>
			<td>Energy Chemical</td>
			<td>E090001</td>
			<td>99.9 % D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formic acid</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>&#160;270480250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fused silica glass capillary</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150017</td>
			<td>ID 50&#956;m, OD 360&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gas chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>GC6890N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydroxypropyl cellulose</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>H113415</td>
			<td>MW 100000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stirrers</td>
			<td>DLAB</td>
			<td>8030101212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A456-4</td>
			<td>MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microvolume UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>84677JK7731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myoglobin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td colspan="2">Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive UHMR mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium&#160;hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ubiquitin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U6253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasonicator</td>
			<td>SCIENTZ</td>
			<td>SB-5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-lactoglobulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L0130</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange for conformational characterization of proteins with top-down mass spectrometry

La risoluzione dell'eterogeneità conformazionale di più stati proteici che coesistono in soluzione rimane uno dei principali ostacoli nella caratterizzazione delle terapie proteiche e nella determinazione delle vie di transizione conformazionali critiche per le funzioni biologiche, che vanno dal riconoscimento molecolare alla catalisi enzimatica. La reazione di scambio idrogeno/deuterio (HDX) accoppiata con l'analisi spettrometrica di massa top-down (MS) fornisce un mezzo per caratterizzare le strutture e le dinamiche di ordine superiore delle proteine in modo conforme-specifico. Il potere risolutivo conformazionale di questa tecnica dipende fortemente dall'efficienza di separare gli stati proteici a livello proteico intatto e ridurre al minimo il contenuto protico residuo non deuterato durante le reazioni HDX. 
Qui descriviamo una variante basata sull'elettroforesi capillare (CE) dell'approccio HDX MS che mira a migliorare la risoluzione conformazionale. In questo approccio, le proteine subiscono reazioni HDX mentre migrano attraverso una soluzione elettrolitica di fondo deuterata (BGE) durante la separazione elettroforetica capillare. Diversi stati proteici o proteoforme che coesistono in soluzione possono essere separati in modo efficiente in base ai loro diversi rapporti carica-dimensione. La differenza nella mobilità elettroforetica tra proteine e molecole di solvente protico riduce al minimo il solvente residuo non deuterato, risultando in un ambiente di deuterazione quasi completo durante il processo HDX. L'interfaccia CE-MS microviale flow-through consente un'efficiente ionizzazione elettrospray delle specie proteiche eluite a seguito di una rapida miscelazione con la soluzione modificante estinguente e denaturante all'uscita dello spruzzatore. L'analisi online top-down della SM misura il livello di deuterazione globale delle specie proteiche intatte eluite e, successivamente, la deuterazione dei loro frammenti in fase gassosa. Questo documento dimostra questo approccio nell'HDX differenziale per i sistemi, comprese le varianti proteiche naturali che coesistono nel latte.

La modifica della pressione di infusione di BGE consente di regolare sia l'efficienza di separazione che il tempo di migrazione, che è equivalente al tempo di reazione HDX delle proteine da separare (Figura 3). Una pressione di infusione più bassa si traduce in una migliore separazione dei picchi CE a scapito della durata dell'esperimento (Figura 3A). Un tempo di migrazione/reazione HDX più lungo si traduce in un livello più elevato di deuterazione degli ana...

Watch this Scientific Journal Video about Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry at JoVE.com

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Qui viene presentato un protocollo per un approccio di scambio idrogeno/deuterio (HDX) basato sull'elettroforesi capillare accoppiato con la spettrometria di massa top-down. Questo approccio caratterizza la differenza nelle strutture di ordine superiore tra diverse specie proteiche, comprese le proteine in diversi stati e diverse proteoforme, conducendo simultaneamente HDX differenziale e separazione elettroforetica.

Scambio idrogeno/deuterio basato sull'elettroforesi capillare per la caratterizzazione conformazionale di proteine con spettrometria di massa top-down

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Questo metodo consente di separare le specie proteiche coesistenti, inclusi diversi conformatori o varianti e di completare online le loro differenze di struttura di ordine superiore in un'unica misurazione CEMS. Utilizza l'effetto elettroforetico per fornire un ambiente di durata quasi del 100% per le reazioni HDX e la separazione ortogonale delle specie proteiche coesistenti durante l'HDX per l'analisi della SM dall'alto verso il basso. Inizia con il precondizionamento dell'elettroforesi capillare, dello scambio di idrogeno deuterio o della configurazione CE HDX.Utilizzando l'ultrasonicazione in una miscela di 50% metanolo, 49% acqua e 1% acido formico, pulire il flusso attraverso l'interfaccia microviale CE-MS per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Montare il capillare modificato HPC sull'elettroferesi capillare o sullo strumento CE. Risciacquare il capillare con soluzione di elettrolita di fondo o BGE per 10 minuti utilizzando il campionatore automatico e lasciarlo riempire con il BGE.Utilizzare una lunghezza appropriata di tubo capillare di silice fusa non modificato come tubo di infusione per la soluzione modificatrice. Utilizzare un'unione e un manicotto appropriato per collegare il tubo modificatore a una siringa di vetro a tenuta di gas con una temperatura smussata e risciacquare il tubo con la soluzione modificatore per almeno 10 minuti utilizzando una pompa per infusione. Inserire le uscite del capillare e del tubo modificatore CE codificato HPC caricato con le soluzioni corrispondenti nell'interfaccia CE-MS pulita.Far avanzare la siringa con le pompe per infusione in modo che la soluzione modificatrice raggiunga la punta dell'interfaccia. Montare l'interfaccia CE-MS assemblata su una sorgente di ionizzazione a spruzzo nanoelettronico che ospita uno spettrometro di massa. Applicare una tensione di spruzzatura di 3-5 kilovolt all'interfaccia CE-MS.Infondere la soluzione modificatrice con la pompa infusore a una portata compresa tra 0,1-10 microlitri al minuto e garantire un elettrospruzzatore stabile sulla punta dell'interfaccia CE-MS. Posizionare il flaconcino del campione contenente il BGE e il campionatore automatico, che verrà utilizzato in seguito per acquisire elettroferogrammi vuoti e spettri di massa in bianco. Stimare il volume di iniezione utilizzando la relazione tra volume di iniezione e parametri di iniezione.E iniettare la soluzione campione utilizzando il campionatore automatico a due PSI per una durata appropriata. Avviare la separazione CE applicando una tensione elettroforetica di 20 kilovolt in una pressione di infusione compresa tra 0-2 PSI e acquisire l'elettroferogramma. Nel frattempo, acquisire i dati MS in modalità cromatografica in cui il grafico a corrente ionica viene acquisito in funzione del tempo e le corrispondenti scansioni MS non vengono automaticamente combinate in un unico spettro.Salvate l'elettroferogramma vuoto e gli spettri di massa come riferimenti. Posizionare i flaconcini campione contenenti le concentrazioni desiderate delle soluzioni campione proteiche nell'autocampionatore e acquisire gli elettroferogrammi e gli spettri MS1 delle specie proteiche elettroforeticamente separate ed etichettate con deuterio. Eseguire misurazioni in tandem Ms.per le specie di interesse, dopo aver acquisito gli spettri MS1 all'interno della stessa corsa o in una successiva corsa separata.Dopo ogni misurazione, lavare il capillare con BGE ad una pressione di 20 PSI per almeno 10 minuti. Pulire l'interfaccia CEMS e tutti i tubi per lo stoccaggio al termine degli esperimenti. Acquisire un set di dati del campione di endpoint HDX con SM in modalità infusione diretta.Una bassa pressione di infusione ha portato a una migliore separazione dei picchi CE, ma ha portato ad un aumento sia del tempo di migrazione che della durata dell'esperimento. Un tempo di reazione HDX più lungo ha comportato un livello più elevato di dedurazione degli analiti proteici. La varianza A e B delle beta immunoglobuline o beta IG, che differiscono solo per due residui di amminoacidi nella loro sequenza, ha dato origine a due picchi adeguatamente separati nell'elettroferogramma derivato dall'EIC.La varianza differenziale marcata con deuterio ha portato a una distribuzione di massa distinta degli ioni. Un numero inferiore in abbondanza relativa di ioni Z rispetto agli ioni C è stato osservato a causa dell'unico legame disofiato nella conferma di beta IG che limita l'efficienza di frammentazione tra CS 82 e CS 176. La maggior parte degli ioni frammento prodotti da beta IGA e beta IGB mostrano un'estensione simile di assorbimento del deuterio.Tuttavia, i segmenti più grandi che coprono i siti di variazione della sequenza da beta IGA sono stati dedurati in misura significativamente maggiore rispetto al beta IGB. Il pH di BGE viene regolato in base al punto isoelettrico del campione per prevenire l'aggregazione proteica e facilitare la separazione mantenendo il complesso.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Chemistry

Unit 1

Principles of Mass Spectrometry

SCIENTISTS IN ACTION

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Analizzando la dinamica delle proteine ​​che utilizzano l&#39;idrogeno Scambio Spettrometria di Massa

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Ricerca

Chimica

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Millisecondo conformazionali Variazioni proteine ​​risolti dal Photothermal Rinvio del raggio

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

Visualizzazione di ambiente spettrometria di massa con l&#39;uso della fotografia Schlieren

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

Un saggio di HS-MRM per la quantificazione delle proteine di cellula ospite in biofarmaceutica di proteine mediante spettrometria di massa di liquido cromatografia dello ione mobilità QTOF

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

Spettrometria di massa di elettroforesi capillare di microsonda per cella singola metabolomica in embrioni di rana Live (Xenopus laevis)

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometry

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometry

Caratterizzazione di polimeri sintetici tramite matrice assistita Laser desorbimento ionizzazione tempo di spettrometria di massa (MALDI-TOF) di volo

There are many techniques that can be employed in the characterization of synthetic homopolymers, but few provide as useful of information for end group ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Proteomica di Top-down su larga scala usando la spettrometria totale in Tandem elettroforesi capillare zona

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Sorveglianza dei medicinali ad alta produttività e completa usando la spettrometria totale multisegmento elettroforesi di iniezione-capillare

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III))

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry CE-ICP-MS for Quantification of Iron Redox Species FeII, FeIII

Impostazione della spettrometria di massa al plasma accoppiata capillare (CE-ICP-MS) per la quantificazione delle specie di iron Redox (Fe(II), Fe(III))

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Approcci di spettrometria di massa per elettroforesi capillare per la caratterizzazione della proteina e del metabolita Corona acquisiti da nanomateriali

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...