Name: capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange for conformational characterization of proteins with top-down mass spectrometry
Uploaded: 2021-06-08T14:00:00
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この研究は、中国国家自然科学財団(NSFC 21974069)からの助成金によって支援されました。著者らはまた、中国の深セン湾研究所の細胞分析研究所からも支援を受けた。生物医学的機能材料の江蘇省共同イノベーションセンター;南京師範大学(中国)の江蘇省生物医学材料主要研究所。

注: MS 分析を妨げる可能性のある汚染物質を最小限に抑えるために、可能な限り高速液体クロマトグラフィー (HPLC) グレードまたは MS グレードの試薬を使用してください。電気泳動電圧またはエレクトロスプレー電圧のいずれかによって引き起こされる感電の可能性を避けるために、測定中は素手でCE-MSインターフェースに触れないでください。
1. 材料準備
<ol><li>CE用溶...

<ol>
	<li>Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+methods+in+characterization+of+the+higher+order+structure+of+protein+therapeutics.">Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169 (2020).</li><li>Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry.">Developments in hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 93 (1), 567-582 (2021).</li><li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformer-specific+hydrogen+exchange+analysis+of+Abeta(1-42)+oligomers+by+top-down+electron+capture+dissociation+mass+spectrometry.">Conformer-specific hydrogen exchange analysis of Abeta(1-42) oligomers by top-down electron capture dissociation mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 83 (13), 5386-5393 (2011).</li><li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+small+soluble+Abeta(1-40)+oligomers+studied+by+top-down+hydrogen+exchange+mass+spectrometry.">Structure and dynamics of small soluble Abeta(1-40) oligomers studied by top-down hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Biochemistry. 51 (17), 3694-3703 (2012).</li><li>Pan, J., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+structural+analysis+of+posttranslationally+modified+proteins+by+Fourier+transform+ion+cyclotron+resonance-MS+with+hydrogen/deuterium+exchange+and+electron+capture+dissociation.">Top-down structural analysis of posttranslationally modified proteins by Fourier transform ion cyclotron resonance-MS with hydrogen/deuterium exchange and electron capture dissociation.</a> Proteomics. 13 (6), 974-981 (2013).</li><li>Wang, G., Abzalimov, R. R., Bobst, C. E., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformer-specific+characterization+of+nonnative+protein+states+using+hydrogen+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Conformer-specific characterization of nonnative protein states using hydrogen exchange and top-down mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United. States of America. 110 (50), 20087-20092 (2013).</li><li>Mironov, G. G., Clouthier, C. M., Akbar, A., Keillor, J. W., Berezovski, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+enzyme+structure+and+activity+by+kinetic+capillary+electrophoresis-MS.">Simultaneous analysis of enzyme structure and activity by kinetic capillary electrophoresis-MS.</a> Nature Chemical Biology. 12 (11), 918-922 (2016).</li><li>Shen, Y., Zhao, X., Wang, G., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+hydrogen/deuterium+exchange+during+proteoform+separation+enables+characterization+of+conformational+differences+between+coexisting+protein+states.">Differential hydrogen/deuterium exchange during proteoform separation enables characterization of conformational differences between coexisting protein states.</a> Analytical Chemistry. 91 (6), 3805-3809 (2019).</li><li>Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invited+review:+&#946;-lactoglobulin:+binding+properties,+structure,+and+function.">Invited review: &#946;-lactoglobulin: binding properties, structure, and function.</a> Journal of Dairy Science. 87 (4), 785-796 (2004).</li><li>Qin, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+Tanford+transition+of+bovine+&#946;-lactoglobulin.">Structural basis of the Tanford transition of bovine &#946;-lactoglobulin.</a> Biochemistry. 37 (40), 14014-14023 (1998).</li><li>Qin, B. Y., Bewley, M. C., Creamer, L. K., Baker, E. N., Jameson, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+implications+of+structural+differences+between+variants+A+and+B+of+bovine+beta-lactoglobulin.">Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin.</a> Protein Science. 8 (1), 75-83 (1999).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+capillary+isoelectric+focusing+mass+spectrometry+analysis+of+peptides,+proteins,+and+monoclonal+antibodies+with+a+flow-through+microvial+interface.">High resolution capillary isoelectric focusing mass spectrometry analysis of peptides, proteins, and monoclonal antibodies with a flow-through microvial interface.</a> Analytical Chemistry. 90 (15), 9495-9503 (2018).</li><li>Busch, M. H. A., Kraak, J. C., Poppe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+acetate-coated+fused-silica+capillaries+for+the+separation+of+proteins+by+capillary+zone+electrophoresis.">Cellulose acetate-coated fused-silica capillaries for the separation of proteins by capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography A. 1695 (2), 287-296 (1995).</li><li>Zhao, X., Shen, Y., Tong, W., Wang, G., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deducing+disulfide+patterns+of+cysteine-rich+proteins+using+signature+fragments+produced+by+top-down+mass+spectrometry.">Deducing disulfide patterns of cysteine-rich proteins using signature fragments produced by top-down mass spectrometry.</a> Analyst. 143 (4), 817-823 (2018).</li><li>Sutera, S. P., Skalak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+Poiseuille's+law.">The history of Poiseuille's law.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 25 (1), 1-20 (1993).</li><li>Wang, G., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+characterization+of+the+higher+order+structure+of+disulfide-containing+proteins+using+hydrogen/deuterium+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).</li><li>Wang, G., Johnson, A. J., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+electrospray+ionization+mass+spectrometry+as+a+tool+for+characterization+of+small+soluble+protein+aggregates.">Evaluation of electrospray ionization mass spectrometry as a tool for characterization of small soluble protein aggregates.</a> Analytical Chemistry. 84 (3), 1718-1724 (2012).</li><li>Fellers, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProSight+Lite:+graphical+software+to+analyze+top-down+mass+spectrometry+data.">ProSight Lite: graphical software to analyze top-down mass spectrometry data.</a> Proteomics. 15 (7), 1235-1238 (2015).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MASH+Suite+Pro:+A+comprehensive+software+tool+for+top-down+proteomics.">MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 15 (2), 703-714 (2016).</li><li>Paterson, G. R., Hill, J. P., Otter, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+&#946;-lactoglobulin+A,+B+and+C+variants+of+bovine+whey+using+capillary+zone+electrophoresis.">Separation of &#946;-lactoglobulin A, B and C variants of bovine whey using capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography A. 700 (1), 105-110 (1995).</li><li>Wang, G., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+characterization+of+the+higher+order+structure+of+disulfide-containing+proteins+using+hydrogen/deuterium+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).</li><li>Nicolardi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-line+electrochemical+reduction+of+disulfide+bonds:+improved+FTICR-CID+and+-ETD+coverage+of+oxytocin+and+hepcidin.">On-line electrochemical reduction of disulfide bonds: improved FTICR-CID and -ETD coverage of oxytocin and hepcidin.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (12), 1980-1987 (2013).</li><li>Adhikari, S., Xia, Y., McLuckey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+analysis+of+disulfide-linked+proteins+using+photoinduced+radical+reactions+and+ET-DDC.">Top-down analysis of disulfide-linked proteins using photoinduced radical reactions and ET-DDC.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 444, 116173 (2019).</li><li>Rush, M. J. P., Riley, N. M., Westphall, M. S., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+characterization+of+proteins+with+intact+disulfide+bonds+using+activated-ion+electron+transfer+dissociation.">Top-down characterization of proteins with intact disulfide bonds using activated-ion electron transfer dissociation.</a> Analytical Chemistry. 90 (15), 8946-8953 (2018).</li><li>Zhong, X., Maxwell, E. J., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transport+in+a+micro+flow-through+vial+of+a+junction-at-the-tip+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry+interface.">Mass transport in a micro flow-through vial of a junction-at-the-tip capillary electrophoresis-mass spectrometry interface.</a> Analytical Chemistry. 83 (12), 4916-4923 (2011).</li></ol>

CEキャピラリーの内壁を被覆する目的には、CEプロセス13中の電気浸透流およびタンパク質吸収の最小化が含まれる。電気浸透流は、中性または反対に荷電した種を検出器に駆動する能力のために、小分子の従来のCE分析に有益であるが、溶液中で同様のサイズおよび正味電荷を有するタンパク質種の分離効率を損なう。キャピラリーをHPCでコーティングすると、キャピラリ?...

異なる立体構造、結合、または修飾状態のタンパク質種を区別し、それらの構造的差異を特徴付けることは、分子認識から酵素触媒作用に至るまで、生物学的事象に関与するこれらの種間の遷移経路をモニターし、これらの事象の根底にあるメカニズムを理解するために重要である。従来の生物物理学的技術は、不十分な分解能および溶液中の動的情報の損失などの制限のために、完全な解決策を提供しない。質量分析(HDX MS)と組み合わせた水素/重水素交換は、意図的に導入された2H2O溶液からのタンパク質の不安定な水素原子と2Hとの間の交換を介して、タンパク質の構造的および立体構造的特徴を重水素(2H)で標識する技術である。水素結合に関与するプロトンは、タンパク質内部で溶媒から隔離されているものや、容易に交換しない1。このように、交換可能な部位における交換速度は、その高次構造への関与に大きく依存するため、1Hと2Hの異なる原子質量に基づいて2H取り込みの程度と速度をプローブするMSによって、タンパク質構造を高い空間分解能で明らかにすることができる。ここ数十年にわたり、HDX MSはタンパク質の立体構造とダイナミクス2を研究するための卓越した技術となっています。
HDX MSの古典的なボトムアップアプローチでは、異なる立体構造、結合、または修飾状態のタンパク質種のアンサンブルは、無傷のタンパク質レベルで分離することなくタンパク質分解されるため、複雑な重水素含有量で得られたタンパク質分解断片を分析することによって個々の種を特徴付けることは不可能です。対照的に、トップダウンアプローチでは、異なる重水素含有量を組み込んだ異なるタンパク質状態またはプロテオフォームは、MSスキャンにおいて無傷のタンパク質塊の複数の分布を生じる。これにより、適切な質量フィルタ(四重極など)を用いた各質量分布に対応するイオンの質量選択と、その後のタンデムMS分析3、4、5、6におけるそれらの立体構造の違いの特性評価によって、個々の種を分離することができる。しかしながら、この戦略におけるタンパク質状態またはプロテオフォームの分離効率は、それらの対応する質量分布の違いの程度によって制限される。
キャピラリー電気泳動(CE)は、溶液相におけるそれらの異なる電荷および流体力学的サイズに基づいてタンパク質種を高効率で分離する手段を提供する7。CEとHDXを組み合わせることで、溶液相におけるタンパク質状態またはプロテオフォームのさらなる分離が可能になります。さらに、CEキャピラリーの容量が小さいため、完全に重水素化された溶液をバックグラウンド電解質溶液(BGE)、すなわちランニングバッファーとして利用でき、キャピラリーをタンパク質サンプルのHDXリアクターとしてレンダリングできます。電気泳動プロセスにおけるタンパク質とプロトン性試薬間の電気泳動移動度の違いにより、CE中にHDXを実施すると、残留非重水素化含有量が最小限に抑えられたタンパク質分析物の重水素化環境がほぼ完全になり、HDXデータを使用した構造解析の感度が向上します。そのため、CEベースの差動HDXアプローチをトップダウンMSと組み合わせて開発し、タンパク質の高次構造を状態またはプロテオフォーム特異的な方法で特徴付けました8。
このホワイトペーパーでは、材料調製、実験手順、およびデータ分析の手順を詳述することによって、このアプローチのプロトコルについて説明します。メソッドのパフォーマンスまたはデータ品質に影響を与える可能性のある要因は、短いメモにリストされています。ここで提示される代表的な結果には、乳中に存在する主要な乳清タンパク質であるウシβ-ラクトグロブリン(β-lg)の異なるタンパク質および天然変異体の混合物の差動HDXデータが含まれる9。我々は、CEベースのHDXおよびそれらの立体構造の変異体特異的特性評価中に、β-lgの2つの豊富な変異体、すなわちAおよびB10,11の分離効率、再現性、および2H標識性能を実証する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ammonium acetate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A/3446/50</td>
			<td>&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI 8000 plus capillary electrophoresis system</td>
			<td>Sciex, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5406000097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal filter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC201024</td>
			<td>10 kDa cutoff</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deuterium oxide</td>
			<td>Energy Chemical</td>
			<td>E090001</td>
			<td>99.9 % D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formic acid</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>&#160;270480250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fused silica glass capillary</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150017</td>
			<td>ID 50&#956;m, OD 360&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gas chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>GC6890N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydroxypropyl cellulose</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>H113415</td>
			<td>MW 100000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stirrers</td>
			<td>DLAB</td>
			<td>8030101212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A456-4</td>
			<td>MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microvolume UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>84677JK7731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myoglobin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td colspan="2">Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive UHMR mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium&#160;hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ubiquitin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U6253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasonicator</td>
			<td>SCIENTZ</td>
			<td>SB-5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-lactoglobulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L0130</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange for conformational characterization of proteins with top-down mass spectrometry

溶液中で共存する複数のタンパク質状態の立体構造不均一性の解決は、分子認識から酵素触媒作用に至るまで、タンパク質治療薬の特性評価および生物学的機能に重要な立体構造遷移経路の決定における主要な障害の1つであり続けている。水素/重水素交換(HDX)反応とトップダウン質量分析(MS)分析を組み合わせることで、タンパク質の高次構造とダイナミクスをコンフォーマー特異的な方法で特徴付ける手段を提供します。この技術の立体構造分解能は、インタクトなタンパク質レベルでタンパク質状態を分離し、HDX反応中に残留する非重水素化プロトン含有量を最小限に抑える効率に大きく依存します。 
ここでは、立体配座分解能の向上を目的としたHDX MSアプローチのキャピラリー電気泳動(CE)ベースのバリアントについて説明します。このアプローチでは、タンパク質は、キャピラリー電気泳動分離中に重水素化バックグラウンド電解質溶液(BGE)を通って移動しながらHDX反応を受ける。溶液中に共存する異なるタンパク質状態またはプロテオフォームは、それらの異なる電荷対サイズ比に基づいて効率的に分離することができる。タンパク質とプロトン性溶媒分子との間の電気泳動移動度の差は、残留非重水素化溶媒を最小限に抑え、HDXプロセス中にほぼ完全な重水素化環境をもたらす。フロースルーマイクロバイアルCE-MSインターフェースは、噴霧器の出口で急冷および変性修飾剤溶液と迅速に混合した後、溶出タンパク質種の効率的なエレクトロスプレーイオン化を可能にする。オンラインのトップダウンMS分析は、溶出された無傷のタンパク質種の全球重水素化レベルを測定し、続いてそれらの気相断片の重水素化を測定する。このホワイトペーパーでは、牛乳中に共存する天然のタンパク質バリアントを含む、システム用の差動HDXにおけるこのアプローチを実証します。

BGEの注入圧力を変えることで、分離効率と遊走時間の両方を調整でき、分離するタンパク質のHDX反応時間に相当します(図3)。注入圧力が低いほど、実験期間を犠牲にしてCEピークの分離が良好になります(図3A)。マイグレーション/HDX反応時間が長くなると、タンパク質分析物の重水素化レベルが高くなります(図3B-D</strong...

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Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

ここでは、キャピラリー電気泳動ベースの水素/重水素交換(HDX)アプローチとトップダウン質量分析を組み合わせたプロトコルを紹介します。このアプローチは、同時差動HDXおよび電気泳動分離を行うことによって、異なる状態および異なるプロテオ形態のタンパク質を含む、異なるタンパク質種間の高次構造の違いを特徴付ける。

トップダウン質量分析によるタンパク質の立体構造特性評価のためのキャピラリー電気泳動ベースの水素/重水素交換

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

この方法により、異なるコンフォーマーまたはバリアントを含む共存するタンパク質種の分離と、それらの高次構造の違いのオンライン特性評価を単一のCEMS測定で完了することができます。電気泳動効果を利用して、HDX反応のためのほぼ100%の持続時間環境を提供し、トップダウンMS分析のためのHDX中の共存タンパク質種の直交分離を提供します。キャピラリー電気泳動の事前調整、水素交換、またはCE HDXセットアップから始めます。50%メタノール、49%水および1%ギ酸の混合物中で超音波処理を使用して、室温で少なくとも30分間、マイクロバイアルCE-MS界面を通る流れをきれいにする。HPC修正キャピラリーをキャピラリー電気フェレーシスまたはCE装置に取り付けます。オートサンプラーを使用して、キャピラリーをバックグラウンド電解質溶液またはBGEで10分間すすぎ、BGEで満たしたままにします。適当な長さの未変性溶融シリカキャピラリーチューブを改質剤溶液用の注入チューブとして使用する。ユニオンと適切なスリーブを使用して、調整剤チューブを鈍い温度で気密ガラスシリンジに接続し、注入ポンプを使用して改質剤溶液でチューブを少なくとも10分間すすぎます。対応する溶液をロードしたHPCコード化されたCEキャピラリーおよびモディファイアチューブの出口を、洗浄されたCE-MSインターフェースに挿入します。調整剤溶液が界面の先端に達するように、注入ポンプでシリンジを前進させる。組み立てられたCE-MS界面を質量分析計のナノ電子噴霧イオン化源ハウジング上に取り付ける。CE-MSインターフェースに3~5キロボルトのスプレー電圧を印加します。改質剤溶液に注入ポンプを毎分0.1〜10マイクロリットルの範囲の流量で注入し、CE-MSインターフェースの先端で安定したエレクトロスプレーを確保します。BGEとオートサンプラーを含むサンプルバイアルを配置し、後でブランク電気泳動図とブランク質量スペクトルを取得するために使用されます。注入量と注入パラメータの関係を使用して注入量を推定する。オートサンプラーを用いて試料溶液を2つのPSIで適当な期間注入する。0〜2PSIの範囲の注入圧力で20キロボルトの電気泳動電圧を印加することによってCE分離を開始し、電気泳動を得る。一方、イオン電流グラフが時間の関数として取得され、対応するMSスキャンが自動的に単一のスペクトルに結合されないクロマトグラフィーモードでMSデータを取得する。空白の電気泳動図と質量スペクトルを基準として保存します。所望の濃度のタンパク質試料溶液を含む試料バイアルをオートサンプラーに入れ、電気泳動的に分離された重水素標識タンパク質種の電気泳動およびMS1スペクトルを取得する。目的の種に対して、同じ実行内でMS1スペクトルを取得した後、または後続の別の実行でタンデムMs.測定を実行します。各測定後、キャピラリーをBGEで20PSIの圧力で少なくとも10分間フラッシュします。CEMSインターフェースとすべてのチューブを清掃し、実験の完了時に保管してください。HDXエンドポイントサンプルのデータセットをMSで直接注入モードで取得します。低い注入圧力は、CEピークのより良い分離をもたらしたが、実験の遊走時間と持続時間の両方の増加をもたらした。HDXの反応時間が長くなると、タンパク質分析物の持続時間が短くなりました。β免疫グロブリンまたはβIGのAおよびB分散は、それらの配列中のわずか2アミノ酸残基によって異なり、EIC由来電気泳動図において2つの適切に分離されたピークを生じさせた。重水素標識された差異は、イオンの明確な質量分布をもたらした。CイオンよりもZイオンの相対的存在量が少ない数値は、CS82とCS176との間のフラグメンテーション効率を制限するベータIGの確認における固有のジソフィ化結合のために観察された。ベータIGAから産生されるフラグメントイオンの大部分、およびベータIGBは、同様の程度の重水素取り込みを示す。しかしながら、β IGAからの配列変動部位をカバーするより大きなセグメントは、β IGBよりも有意に大きい程度に脱送された。BGEのpHは、サンプルの等電点に応じて調整され、タンパク質凝集を防ぎ、複合体を維持しながら分離を容易にします。

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Analytical Chemistry

Chemistry

Unit 1

Principles of Mass Spectrometry

SCIENTISTS IN ACTION

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

水素交換質量分析法を用いてタンパク質のダイナミクスを分析する

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

光熱ビーム偏向によって分離したタンパク質におけるミリ秒以下構造変化

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

シュリーレン写真の使用とアンビエント質量分析の可視化

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

液体クロマトグラフィーによるイオン移動 QTOF 質量分析法によるタンパク質のバイオ医薬品の宿主細胞蛋白質の定量化のための HS MRM アッセイ

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

生きているカエル (アフリカツメガエル) 胚の単一細胞メタボロミクスのマイクロ プローブ キャピラリー電気泳動質量分析法

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometry

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometry

マトリクスによる合成高分子のキャラクタリゼーション支援レーザー脱離イオン化時間 (MALDI Tof) 質量分析装置

There are many techniques that can be employed in the characterization of synthetic homopolymers, but few provide as useful of information for end group ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

キャピラリー ゾーン電気泳動タンデム質量分析法による大規模なトップダウン プロテオミクス

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

マルチ セグメントの注入キャピラリー電気泳動質量分析法による高スループットかつ包括的な薬物監視

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III))

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry CE-ICP-MS for Quantification of Iron Redox Species FeII, FeIII

鉄レドックス種(Fe(II)、Fe(III)の定量化のためのキャピラリー電気泳動誘導結合プラズマ質量分析(CE-ICP-MS)のセットアップ

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

ナノ材料で獲得したタンパク質と代謝物コロナの特性解析のためのキャピラリー電気泳動質量分析法

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...