Name: capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange for conformational characterization of proteins with top-down mass spectrometry
Uploaded: 2021-06-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (NSFC 21974069). Forfatterne fikk også støtte fra Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, Kina; Jiangsu samarbeidsinnovasjonssenter for biomedisinske funksjonelle materialer; og Jiangsu Key Laboratory of Biomedical Materials ved Nanjing Normal University, Kina.

MERK: Bruk hplc-grade (high-performance liquid chromatography) eller MS-reagenser når det er mulig for å minimere forurensningene som kan forstyrre MS-analysen. Ikke berør CE-MS-grensesnittet med bare hender under målingen for å unngå muligheten for elektrisk støt forårsaket av enten elektroforetisk spenning eller elektrosprayspenning.
1. Materialforberedelse
<ol><li>Modifikasjon av smeltet silika kapillær for CE<ol>
<li>Forbered en 5% (w / w) hydroksypropylcellulose (HPC) løsning ...

<ol>
	<li>Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+methods+in+characterization+of+the+higher+order+structure+of+protein+therapeutics.">Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169 (2020).</li><li>Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry.">Developments in hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 93 (1), 567-582 (2021).</li><li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformer-specific+hydrogen+exchange+analysis+of+Abeta(1-42)+oligomers+by+top-down+electron+capture+dissociation+mass+spectrometry.">Conformer-specific hydrogen exchange analysis of Abeta(1-42) oligomers by top-down electron capture dissociation mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 83 (13), 5386-5393 (2011).</li><li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+small+soluble+Abeta(1-40)+oligomers+studied+by+top-down+hydrogen+exchange+mass+spectrometry.">Structure and dynamics of small soluble Abeta(1-40) oligomers studied by top-down hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Biochemistry. 51 (17), 3694-3703 (2012).</li><li>Pan, J., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+structural+analysis+of+posttranslationally+modified+proteins+by+Fourier+transform+ion+cyclotron+resonance-MS+with+hydrogen/deuterium+exchange+and+electron+capture+dissociation.">Top-down structural analysis of posttranslationally modified proteins by Fourier transform ion cyclotron resonance-MS with hydrogen/deuterium exchange and electron capture dissociation.</a> Proteomics. 13 (6), 974-981 (2013).</li><li>Wang, G., Abzalimov, R. R., Bobst, C. E., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformer-specific+characterization+of+nonnative+protein+states+using+hydrogen+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Conformer-specific characterization of nonnative protein states using hydrogen exchange and top-down mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United. States of America. 110 (50), 20087-20092 (2013).</li><li>Mironov, G. G., Clouthier, C. M., Akbar, A., Keillor, J. W., Berezovski, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+enzyme+structure+and+activity+by+kinetic+capillary+electrophoresis-MS.">Simultaneous analysis of enzyme structure and activity by kinetic capillary electrophoresis-MS.</a> Nature Chemical Biology. 12 (11), 918-922 (2016).</li><li>Shen, Y., Zhao, X., Wang, G., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+hydrogen/deuterium+exchange+during+proteoform+separation+enables+characterization+of+conformational+differences+between+coexisting+protein+states.">Differential hydrogen/deuterium exchange during proteoform separation enables characterization of conformational differences between coexisting protein states.</a> Analytical Chemistry. 91 (6), 3805-3809 (2019).</li><li>Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invited+review:+&#946;-lactoglobulin:+binding+properties,+structure,+and+function.">Invited review: &#946;-lactoglobulin: binding properties, structure, and function.</a> Journal of Dairy Science. 87 (4), 785-796 (2004).</li><li>Qin, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+Tanford+transition+of+bovine+&#946;-lactoglobulin.">Structural basis of the Tanford transition of bovine &#946;-lactoglobulin.</a> Biochemistry. 37 (40), 14014-14023 (1998).</li><li>Qin, B. Y., Bewley, M. C., Creamer, L. K., Baker, E. N., Jameson, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+implications+of+structural+differences+between+variants+A+and+B+of+bovine+beta-lactoglobulin.">Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin.</a> Protein Science. 8 (1), 75-83 (1999).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+capillary+isoelectric+focusing+mass+spectrometry+analysis+of+peptides,+proteins,+and+monoclonal+antibodies+with+a+flow-through+microvial+interface.">High resolution capillary isoelectric focusing mass spectrometry analysis of peptides, proteins, and monoclonal antibodies with a flow-through microvial interface.</a> Analytical Chemistry. 90 (15), 9495-9503 (2018).</li><li>Busch, M. H. A., Kraak, J. C., Poppe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+acetate-coated+fused-silica+capillaries+for+the+separation+of+proteins+by+capillary+zone+electrophoresis.">Cellulose acetate-coated fused-silica capillaries for the separation of proteins by capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography A. 1695 (2), 287-296 (1995).</li><li>Zhao, X., Shen, Y., Tong, W., Wang, G., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deducing+disulfide+patterns+of+cysteine-rich+proteins+using+signature+fragments+produced+by+top-down+mass+spectrometry.">Deducing disulfide patterns of cysteine-rich proteins using signature fragments produced by top-down mass spectrometry.</a> Analyst. 143 (4), 817-823 (2018).</li><li>Sutera, S. P., Skalak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+Poiseuille's+law.">The history of Poiseuille's law.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 25 (1), 1-20 (1993).</li><li>Wang, G., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+characterization+of+the+higher+order+structure+of+disulfide-containing+proteins+using+hydrogen/deuterium+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).</li><li>Wang, G., Johnson, A. J., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+electrospray+ionization+mass+spectrometry+as+a+tool+for+characterization+of+small+soluble+protein+aggregates.">Evaluation of electrospray ionization mass spectrometry as a tool for characterization of small soluble protein aggregates.</a> Analytical Chemistry. 84 (3), 1718-1724 (2012).</li><li>Fellers, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProSight+Lite:+graphical+software+to+analyze+top-down+mass+spectrometry+data.">ProSight Lite: graphical software to analyze top-down mass spectrometry data.</a> Proteomics. 15 (7), 1235-1238 (2015).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MASH+Suite+Pro:+A+comprehensive+software+tool+for+top-down+proteomics.">MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 15 (2), 703-714 (2016).</li><li>Paterson, G. R., Hill, J. P., Otter, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+&#946;-lactoglobulin+A,+B+and+C+variants+of+bovine+whey+using+capillary+zone+electrophoresis.">Separation of &#946;-lactoglobulin A, B and C variants of bovine whey using capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography A. 700 (1), 105-110 (1995).</li><li>Wang, G., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+characterization+of+the+higher+order+structure+of+disulfide-containing+proteins+using+hydrogen/deuterium+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).</li><li>Nicolardi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-line+electrochemical+reduction+of+disulfide+bonds:+improved+FTICR-CID+and+-ETD+coverage+of+oxytocin+and+hepcidin.">On-line electrochemical reduction of disulfide bonds: improved FTICR-CID and -ETD coverage of oxytocin and hepcidin.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (12), 1980-1987 (2013).</li><li>Adhikari, S., Xia, Y., McLuckey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+analysis+of+disulfide-linked+proteins+using+photoinduced+radical+reactions+and+ET-DDC.">Top-down analysis of disulfide-linked proteins using photoinduced radical reactions and ET-DDC.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 444, 116173 (2019).</li><li>Rush, M. J. P., Riley, N. M., Westphall, M. S., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+characterization+of+proteins+with+intact+disulfide+bonds+using+activated-ion+electron+transfer+dissociation.">Top-down characterization of proteins with intact disulfide bonds using activated-ion electron transfer dissociation.</a> Analytical Chemistry. 90 (15), 8946-8953 (2018).</li><li>Zhong, X., Maxwell, E. J., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transport+in+a+micro+flow-through+vial+of+a+junction-at-the-tip+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry+interface.">Mass transport in a micro flow-through vial of a junction-at-the-tip capillary electrophoresis-mass spectrometry interface.</a> Analytical Chemistry. 83 (12), 4916-4923 (2011).</li></ol>

Målene med å belegge den indre veggen til CE-kapillæren inkluderer minimering av elektroosmotisk strømning og proteinabsorpsjon under CE-prosessen13. Selv om elektroosmotisk strømning er gunstig for konvensjonell CE-analyse av små molekyler på grunn av dens evne til å drive nøytrale eller motsatt ladede arter til detektoren, kompromitterer den separasjonseffektiviteten til proteinarter med lignende størrelser og netto kostnader i løsningen. Belegg kapillæren med HPC minimerer den elekt...

Å skille proteinarter i forskjellige konformasjons-, bindings- eller modifikasjonstilstander og karakterisere deres strukturelle forskjeller er viktig for å overvåke overgangsveiene mellom disse artene som er involvert i biologiske hendelser, alt fra molekylær anerkjennelse til enzymatisk katalyse, og forstå mekanismene som ligger til grunn for disse hendelsene. Konvensjonelle biofysiske teknikker gir ikke en komplett løsning på grunn av begrensningene som utilstrekkelig oppløsning og tap av dynamisk informasjon i løsningen. Hydrogen/deuteriumutveksling kombinert med massespektrometri (HDX MS) er en teknikk som merker de strukturelle og konformasjonsmessige egenskapene til proteiner med deuterium (2H) via utvekslingen mellom labile hydrogenatomer av proteiner og 2H fra den bevisst introduserte 2H2O-løsningen. Protoner involvert i hydrogenbinding eller som er beslaglagt fra løsningsmidlet i proteininteriøret, utveksles ikke lett1. Dermed, ettersom valutakursen på et utvekslingssted er svært avhengig av sitt engasjement i høyere ordens strukturer, kan proteinstrukturene avsløres ved høy romlig oppløsning av MS som undersøker omfanget og hastigheten på 2H-opptak basert på de forskjellige atommassene mellom 1H og 2H. I løpet av de siste tiårene har HDX MS blitt en fremragende vellykket teknikk for å studere proteinkonformasjoner og dynamikk2.
I den klassiske nedenfra-og-opp-tilnærmingen til HDX MS er ensemblet av proteinarter i forskjellige konformasjons-, bindings- eller modifikasjonstilstander proteolysert uten separasjon på intakt proteinnivå, noe som gjør det umulig å karakterisere individuelle arter ved å analysere de resulterende proteolytiske fragmentene med innviklet deuteriuminnhold. I motsetning, i ovenfra og ned-tilnærmingen, gir forskjellige proteintilstander eller proteoformer som har innlemmet forskjellig deuteriuminnhold, opphav til flere distribusjoner av intakte proteinmasser i en MS-skanning. Dette gjør at individuelle arter kan skilles ved massevalg av ioner som tilsvarer hver massefordeling ved hjelp av et riktig massefilter (for eksempel en quadrupole) og karakteriseringen av deres konformasjonsforskjeller i den påfølgende tandem MS-analysen 3,4,5,6. Effektiviteten av å skille proteintilstander eller proteoformer i denne strategien er imidlertid begrenset av omfanget av forskjell i deres tilsvarende massefordelinger.
Kapillær elektroforese (CE) gir et middel til å skille proteinarter basert på deres forskjellige ladninger og hydrodynamiske størrelser i løsningsfasen med høy effektivitet7. Kombinere CE med HDX tilbyr ytterligere separasjon av proteintilstander eller proteoformer i løsningsfasen. I tillegg tillater det lille volumet av CE-kapillæren utnyttelse av en fullt deutert løsning som bakgrunnselektrolyttløsning (BGE), det vil si løpebufferen, som gjengir kapillæren som en HDX-reaktor for proteinprøver. På grunn av forskjellen i elektroforetisk mobilitet mellom proteiner og protiske reagenser i elektroforeseprosessen, resulterer det i et nesten komplett deuteringsmiljø for proteinanalyttene med minimalt gjenværende ikke-deutert innhold, og dermed forbedrer følsomheten til strukturanalysen ved hjelp av HDX-data. Som sådan utviklet vi en CE-basert differensial HDX-tilnærming kombinert med ovenfra og ned MS for å karakterisere protein høyere orden strukturer på en tilstands- eller proteoform-spesifikk måte8.
Dette dokumentet beskriver protokoller for denne tilnærmingen ved å detaljere trinnene for materialforberedelse, eksperimentell prosedyre og dataanalyse. Faktorer som kan påvirke metodeytelsen eller datakvaliteten, vises i korte merknader. De representative resultatene som presenteres her inkluderer differensial HDX-data av blandinger av forskjellige proteiner og naturlige varianter av storfe β-lactoglobulin (β-lg), det store myseproteinet som finnes i melk9. Vi demonstrerer separasjonseffektivitet, reproduserbarhet og 2H-merkingsytelse av de to rikelige variantene av β-lg, det vil si A og B10,11 under CE-basert HDX og variantspesifikk karakterisering av deres konformasjoner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ammonium acetate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A/3446/50</td>
			<td>&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI 8000 plus capillary electrophoresis system</td>
			<td>Sciex, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5406000097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal filter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC201024</td>
			<td>10 kDa cutoff</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deuterium oxide</td>
			<td>Energy Chemical</td>
			<td>E090001</td>
			<td>99.9 % D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formic acid</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>&#160;270480250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fused silica glass capillary</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150017</td>
			<td>ID 50&#956;m, OD 360&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gas chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>GC6890N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydroxypropyl cellulose</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>H113415</td>
			<td>MW 100000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stirrers</td>
			<td>DLAB</td>
			<td>8030101212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A456-4</td>
			<td>MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microvolume UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>84677JK7731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myoglobin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td colspan="2">Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive UHMR mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium&#160;hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ubiquitin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U6253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasonicator</td>
			<td>SCIENTZ</td>
			<td>SB-5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-lactoglobulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L0130</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange for conformational characterization of proteins with top-down mass spectrometry

Å løse konformasjonell heterogenitet av flere proteintilstander som sameksisterer i løsning, er fortsatt en av de viktigste hindringene i karakteriseringen av proteinterapeutikk og bestemmelse av konformasjonsovergangsveiene som er kritiske for biologiske funksjoner, alt fra molekylær anerkjennelse til enzymatisk katalyse. Hydrogen/deuterium utveksling (HDX) reaksjon kombinert med ovenfra og ned massespektrometrisk (MS) analyse gir et middel til å karakterisere protein høyere orden strukturer og dynamikk på en konform-spesifikk måte. Konformasjonsløsningskraften til denne teknikken er svært avhengig av effektiviteten ved å skille proteintilstander på intakt proteinnivå og minimere det gjenværende ikke-deutererte protiske innholdet under HDX-reaksjonene. 
Her beskriver vi en kapillær elektroforese (CE)-basert variant av HDX MS-tilnærmingen som tar sikte på å forbedre konformasjonsoppløsningen. I denne tilnærmingen gjennomgår proteiner HDX-reaksjoner mens de migrerer gjennom en deutert bakgrunnselektrolyttløsning (BGE) under kapillær elektroforetisk separasjon. Ulike proteintilstander eller proteoformer som sameksisterer i oppløsning, kan effektivt separeres basert på deres forskjellige forhold mellom ladning og størrelse. Forskjellen i elektroforetisk mobilitet mellom proteiner og protiske løsningsmiddelmolekyler minimerer det gjenværende ikke-deutererte løsningsmidlet, noe som resulterer i et nesten komplett deuteringsmiljø under HDX-prosessen. Det gjennomstrømningsbaserte mikroviale CE-MS-grensesnittet muliggjør effektiv elektrosprayionisering av de eluterte proteinartene etter en rask blanding med slukke- og denatureringsmodifikatorløsningen ved utløpet av sprøyten. Den elektroniske ovenfra-og-ned MS-analysen måler det globale deuteringsnivået til de rømte intakte proteinartene, og deretter deutering av gassfasefragmentene. Dette dokumentet demonstrerer denne tilnærmingen i differensial HDX for systemer, inkludert de naturlige proteinvariantene som sameksisterer i melk.

Endring av infusjonstrykket til BGE gjør det mulig å justere både separasjonseffektivitet og migrasjonstid, noe som tilsvarer HDX-reaksjonstiden til proteinene som skal separeres (figur 3). Et lavere infusjonstrykk resulterer i bedre separasjon av CE-topper på bekostning av eksperimentets varighet (figur 3A). En lengre migrerings-/HDX-reaksjonstid resulterer i et høyere nivå av deutering av proteinanalyttene (figur 3B-D<strong...

Watch this Scientific Journal Video about Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry at JoVE.com

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Presentert her er en protokoll for en kapillær elektroforesebasert hydrogen / deuteriumutveksling (HDX) tilnærming kombinert med ovenfra og ned massespektrometri. Denne tilnærmingen karakteriserer forskjellen i høyere ordens strukturer mellom forskjellige proteinarter, inkludert proteiner i forskjellige tilstander og forskjellige proteoformer, ved å gjennomføre samtidig differensial HDX og elektroforetisk separasjon.

Kapillær elektroforesebasert hydrogen/deuteriumutveksling for konformasjonskarakterisering av proteiner med massespektrometri ovenfra og ned

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Denne metoden gjør det mulig å skille mellom sameksistensproteinarter, inkludert forskjellige konforme eller varianter og online karakterisering av deres høyere rekkefølgestrukturforskjeller som skal fullføres i en enkelt CEMS-måling. Den benytter den elektroforetiske effekten for å gi et nesten 100% varighetsmiljø for HDX-reaksjonene og ortogonal separasjon av de sameksistenserende proteinartene under HDX for ovenfra og ned MS-analyse. Begynn med prekondisjonering av kapillær elektroforese, hydrogendeuteriumutveksling eller CE HDX-oppsett.Ved hjelp av ultralydbehandling i en blanding av 50% metanol, 49% vann og 1% maursyre, rengjør strømmen gjennom mikrovial CE-MS-grensesnitt i minst 30 minutter ved romtemperatur. Monter den HPC-modifiserte kapillæren på kapillærelektroferesen eller CE-instrumentet. Skyll kapillæren med bakgrunnselektrolyttoppløsning eller BGE i 10 minutter ved hjelp av den automatiske prøvetakeren og la den være fylt med BGE.Bruk en passende lengde på umodifisert smeltet silika kapillærrør som infusjonsrør for modifikatoroppløsningen. Bruk en kobling og riktig hylse for å koble modifikatorslangen til en gasstett glasssprøyte med en stump temperatur og skyll slangen med modifikatoroppløsningen i minst 10 minutter ved hjelp av en infusjonspumpe. Sett inn uttakene til HPC-kodet CE-kapillær- og modifikatorrør lastet med de tilsvarende løsningene i det rensede CE-MS-grensesnittet.Før sprøyten med infusjonspumpene slik at modifikatoroppløsningen når spissen av grensesnittet. Monter det monterte CE-MS-grensesnittet på et nanoelektronsprayioniseringskildehus av et massespektrometer. Påfør en sprayspenning på 3-5 kilovolt på CE-MS-grensesnittet.Tilsett modifikatorløsningen med infuserpumpen med en strømningshastighet fra 0,1-10 mikroliter per minutt og sørg for en stabil elektrospray på spissen av CE-MS-grensesnittet. Plasser prøvehette hetteglasset som inneholder BGE og den automatiske prøvetakeren, som senere vil bli brukt til å skaffe seg tomme elektroferogrammer og blank massespektra. Beregn injeksjonsvolumet ved hjelp av forholdet mellom injeksjonsvolum og injeksjonsparametere.Og injiser prøveløsningen ved hjelp av den automatiske prøven ved to PSI for en passende varighet. Start CE-separasjonen ved å påføre en elektroforetisk spenning på 20 kilovolt i et infusjonstrykk fra 0-2 PSI og skaffe elektrofarmogrammet. I mellomtiden skaffer du MS-dataene i kromatografisk modus der ionstrømsgrafen er anskaffet som en funksjon av tid, og de tilsvarende MS-skanningene kombineres ikke automatisk til et enkelt spektrum.Lagre det tomme elektropherogrammet og massespektraet som referanser. Plasser prøvehettene som inneholder de ønskede konsentrasjonene av proteinprøveløsningene i autoprøven og skaff elektroferogrammer og MS1-spektra av de elektroforetisk separerte og deuteriummerkede proteinartene. Utfør tandem Ms.measurements for arten av interesse, enten etter å ha anskaffet MS1-spektra i samme løp eller i et påfølgende separat løp.Etter hver måling, skyll kapillæren med BGE med et trykk på 20 PSI i minst 10 minutter. Rengjør CEMS-grensesnittet og all rør for lagring når eksperimentene er fullført. Hent et datasett for HDX-endepunktprøven med MS i direkte infusjonsmodus.Et lavt infusjonstrykk resulterte i bedre separasjon av CE-topper, men førte til en økning i både migrasjonstiden og varigheten av eksperimentet. En lengre HDX-reaksjonstid resulterte i et høyere nivå av dedurasjon av proteinanalyttene. A- og B-variansen av betaimmunoglobulin eller beta-IG, som varierer med bare to aminosyrerester i sekvensen, ga opphav til to tilstrekkelig separerte topper i EIC-avledet elektroferogram.Differensialdeuteriet merket varians resulterte i en tydelig massefordeling av ioner. Et lavere antall i relativ overflod av Z-ioner enn C-ioner ble observert på grunn av den unike dysofierte koblingen i bekreftelse av beta-IG som begrenser fragmenteringseffektiviteten mellom CS 82 og CS 176. De fleste fragmentionene produsert fra beta IGA, og beta IGB viser en lignende grad av deuteriumopptak.De større segmentene som dekker sekvensvariasjonsstedene fra beta-IGA, ble imidlertid utledet i betydelig større grad enn beta-IGB. PH for BGE justeres i henhold til det isoelektriske punktet i prøven for å forhindre proteinaggregering og lette separasjon samtidig som komplekset opprettholdes.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Chemistry

Unit 1

Principles of Mass Spectrometry

SCIENTISTS IN ACTION

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Analysere Protein Dynamics Bruke Hydrogen Exchange-massespektrometri

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Submillisecond konformasjonsendring Endringer i Proteiner løst ved Photothermal bjelkenedbøying

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

Visualisering av Ambient massespektrometri med bruk av Schlieren Photography

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

HS-MRM analysen for kvantifisering av verten celle proteiner i Protein Biopharmaceuticals av flytende kromatografi Ion mobilitet QTOF massespektrometri

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

Microprobe kapillært geleelektroforese massespektrometri for én celle Metabolomics i Live Frog (Xenopus laevis) embryoer

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometry

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometry

Karakteristikk av syntetiske polymerer via Matrix assistert Laser desorpsjon Ionization tiden av fly (MALDI-TOF) massespektrometri

There are many techniques that can be employed in the characterization of synthetic homopolymers, but few provide as useful of information for end group ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Store ovenfra og ned Proteomikk bruker kapillær sone geleelektroforese Tandem massespektrometri

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Høy gjennomstrømming og omfattende narkotika overvåkning bruker Multisegment injeksjon-kapillære geleelektroforese massespektrometri

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III))

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry CE-ICP-MS for Quantification of Iron Redox Species FeII, FeIII

Oppsett av kapillær elektroforese-induktivt skrevet plasma massespektrometri (CE-ICP-MS) for kvantifisering av jern redox arter (Fe(II), Fe(III))

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Kapillær elektroforese massespektrometri tilnærminger for karakterisering av protein og metabolitt korona ervervet av nanomaterialer

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...