Name: capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange for conformational characterization of proteins with top-down mass spectrometry
Uploaded: 2021-06-08T14:00:00
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Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (NSFC 21974069). Os autores também receberam apoio do Instituto de Análise Celular, Laboratório de Shenzhen Bay, China; Jiangsu Centro de Inovação Colaborativa de Materiais Funcionais Biomédicos; e Jiangsu Key Laboratory of Biomedical Materials na Universidade Normal de Nanjing, China.

NOTA: Utilize reagentes de grau de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) ou reagentes de grau MS sempre que possível para minimizar os contaminantes que possam interferir na análise de MS. Não toque na interface CE-MS com as mãos nuas durante a medição para evitar a possibilidade de um choque elétrico causado pela tensão eletroforética ou por tensão eletrospray.
1. Preparação do material
<ol><li>Modificação da capilar de sílica fundida para CE<ol>
<li>Prepare uma so...

<ol>
	<li>Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+methods+in+characterization+of+the+higher+order+structure+of+protein+therapeutics.">Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169 (2020).</li><li>Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry.">Developments in hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 93 (1), 567-582 (2021).</li><li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformer-specific+hydrogen+exchange+analysis+of+Abeta(1-42)+oligomers+by+top-down+electron+capture+dissociation+mass+spectrometry.">Conformer-specific hydrogen exchange analysis of Abeta(1-42) oligomers by top-down electron capture dissociation mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 83 (13), 5386-5393 (2011).</li><li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+small+soluble+Abeta(1-40)+oligomers+studied+by+top-down+hydrogen+exchange+mass+spectrometry.">Structure and dynamics of small soluble Abeta(1-40) oligomers studied by top-down hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Biochemistry. 51 (17), 3694-3703 (2012).</li><li>Pan, J., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+structural+analysis+of+posttranslationally+modified+proteins+by+Fourier+transform+ion+cyclotron+resonance-MS+with+hydrogen/deuterium+exchange+and+electron+capture+dissociation.">Top-down structural analysis of posttranslationally modified proteins by Fourier transform ion cyclotron resonance-MS with hydrogen/deuterium exchange and electron capture dissociation.</a> Proteomics. 13 (6), 974-981 (2013).</li><li>Wang, G., Abzalimov, R. R., Bobst, C. E., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformer-specific+characterization+of+nonnative+protein+states+using+hydrogen+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Conformer-specific characterization of nonnative protein states using hydrogen exchange and top-down mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United. States of America. 110 (50), 20087-20092 (2013).</li><li>Mironov, G. G., Clouthier, C. M., Akbar, A., Keillor, J. W., Berezovski, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+enzyme+structure+and+activity+by+kinetic+capillary+electrophoresis-MS.">Simultaneous analysis of enzyme structure and activity by kinetic capillary electrophoresis-MS.</a> Nature Chemical Biology. 12 (11), 918-922 (2016).</li><li>Shen, Y., Zhao, X., Wang, G., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+hydrogen/deuterium+exchange+during+proteoform+separation+enables+characterization+of+conformational+differences+between+coexisting+protein+states.">Differential hydrogen/deuterium exchange during proteoform separation enables characterization of conformational differences between coexisting protein states.</a> Analytical Chemistry. 91 (6), 3805-3809 (2019).</li><li>Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invited+review:+&#946;-lactoglobulin:+binding+properties,+structure,+and+function.">Invited review: &#946;-lactoglobulin: binding properties, structure, and function.</a> Journal of Dairy Science. 87 (4), 785-796 (2004).</li><li>Qin, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+Tanford+transition+of+bovine+&#946;-lactoglobulin.">Structural basis of the Tanford transition of bovine &#946;-lactoglobulin.</a> Biochemistry. 37 (40), 14014-14023 (1998).</li><li>Qin, B. Y., Bewley, M. C., Creamer, L. K., Baker, E. N., Jameson, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+implications+of+structural+differences+between+variants+A+and+B+of+bovine+beta-lactoglobulin.">Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin.</a> Protein Science. 8 (1), 75-83 (1999).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+capillary+isoelectric+focusing+mass+spectrometry+analysis+of+peptides,+proteins,+and+monoclonal+antibodies+with+a+flow-through+microvial+interface.">High resolution capillary isoelectric focusing mass spectrometry analysis of peptides, proteins, and monoclonal antibodies with a flow-through microvial interface.</a> Analytical Chemistry. 90 (15), 9495-9503 (2018).</li><li>Busch, M. H. A., Kraak, J. C., Poppe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+acetate-coated+fused-silica+capillaries+for+the+separation+of+proteins+by+capillary+zone+electrophoresis.">Cellulose acetate-coated fused-silica capillaries for the separation of proteins by capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography A. 1695 (2), 287-296 (1995).</li><li>Zhao, X., Shen, Y., Tong, W., Wang, G., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deducing+disulfide+patterns+of+cysteine-rich+proteins+using+signature+fragments+produced+by+top-down+mass+spectrometry.">Deducing disulfide patterns of cysteine-rich proteins using signature fragments produced by top-down mass spectrometry.</a> Analyst. 143 (4), 817-823 (2018).</li><li>Sutera, S. P., Skalak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+Poiseuille's+law.">The history of Poiseuille's law.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 25 (1), 1-20 (1993).</li><li>Wang, G., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+characterization+of+the+higher+order+structure+of+disulfide-containing+proteins+using+hydrogen/deuterium+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).</li><li>Wang, G., Johnson, A. J., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+electrospray+ionization+mass+spectrometry+as+a+tool+for+characterization+of+small+soluble+protein+aggregates.">Evaluation of electrospray ionization mass spectrometry as a tool for characterization of small soluble protein aggregates.</a> Analytical Chemistry. 84 (3), 1718-1724 (2012).</li><li>Fellers, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProSight+Lite:+graphical+software+to+analyze+top-down+mass+spectrometry+data.">ProSight Lite: graphical software to analyze top-down mass spectrometry data.</a> Proteomics. 15 (7), 1235-1238 (2015).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MASH+Suite+Pro:+A+comprehensive+software+tool+for+top-down+proteomics.">MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 15 (2), 703-714 (2016).</li><li>Paterson, G. R., Hill, J. P., Otter, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+&#946;-lactoglobulin+A,+B+and+C+variants+of+bovine+whey+using+capillary+zone+electrophoresis.">Separation of &#946;-lactoglobulin A, B and C variants of bovine whey using capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography A. 700 (1), 105-110 (1995).</li><li>Wang, G., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+characterization+of+the+higher+order+structure+of+disulfide-containing+proteins+using+hydrogen/deuterium+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).</li><li>Nicolardi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-line+electrochemical+reduction+of+disulfide+bonds:+improved+FTICR-CID+and+-ETD+coverage+of+oxytocin+and+hepcidin.">On-line electrochemical reduction of disulfide bonds: improved FTICR-CID and -ETD coverage of oxytocin and hepcidin.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (12), 1980-1987 (2013).</li><li>Adhikari, S., Xia, Y., McLuckey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+analysis+of+disulfide-linked+proteins+using+photoinduced+radical+reactions+and+ET-DDC.">Top-down analysis of disulfide-linked proteins using photoinduced radical reactions and ET-DDC.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 444, 116173 (2019).</li><li>Rush, M. J. P., Riley, N. M., Westphall, M. S., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+characterization+of+proteins+with+intact+disulfide+bonds+using+activated-ion+electron+transfer+dissociation.">Top-down characterization of proteins with intact disulfide bonds using activated-ion electron transfer dissociation.</a> Analytical Chemistry. 90 (15), 8946-8953 (2018).</li><li>Zhong, X., Maxwell, E. J., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transport+in+a+micro+flow-through+vial+of+a+junction-at-the-tip+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry+interface.">Mass transport in a micro flow-through vial of a junction-at-the-tip capillary electrophoresis-mass spectrometry interface.</a> Analytical Chemistry. 83 (12), 4916-4923 (2011).</li></ol>

Os objetivos do revestimento da parede interna do capilar CE incluem a minimização do fluxo eletroosmótico e da absorção de proteínas durante o processo CE13. Embora o fluxo eletroosmótico seja benéfico para a análise ce convencional de pequenas moléculas devido à sua capacidade de conduzir espécies neutras ou opostamente carregadas para o detector, compromete a eficiência de separação de espécies proteicas com tamanhos semelhantes e cargas líquidas em solução. O revestimento do...

Distinguir espécies proteicas em diferentes estados conformais, vinculantes ou modificadores e caracterizar suas diferenças estruturais são importantes para monitorar os caminhos das transições entre essas espécies envolvidas em eventos biológicos, que vão desde o reconhecimento molecular até a catálise enzimática, e a compreensão dos mecanismos subjacentes a esses eventos. As técnicas biofísicas convencionais não fornecem uma solução completa devido às limitações como resolução insuficiente e perda de informações dinâmicas na solução. A troca de hidrogênio/deutério juntamente com espectrometria de massa (HDX MS) é uma técnica que rotula as características estruturais e conformais das proteínas com deutério (2H) através da troca entre átomos de hidrogênio labile de proteínas e 2H da solução deliberadamente introduzida 2H2O. Prótons envolvidos na ligação de hidrogênio ou que são sequestrados do solvente no interior da proteína não trocam prontamente1. Assim, como a taxa de câmbio em um local de troca é altamente dependente de seu envolvimento em estruturas de alta ordem, as estruturas proteicas podem ser reveladas em alta resolução espacial por MS que sonda a extensão e taxa de captação de 2H com base nas diferentes massas atômicas entre 1H e 2H. Nas últimas décadas, o HDX MS tornou-se uma técnica de excelente sucesso para estudar conformações e dinâmicas proteicas2.
Na abordagem clássica de baixo para cima do HDX MS, o conjunto de espécies proteicas em diferentes estados conformais, vinculativos ou modificações é proteolisado sem separação ao nível de proteína intacta, tornando inviável caracterizar espécies individuais analisando os fragmentos proteolíticos resultantes com conteúdo de deutério convolucido. Em contraste, na abordagem de cima para baixo, diferentes estados proteicos ou proteoforms que incorporaram diferentes conteúdos de deutério dão origem a múltiplas distribuições de massas proteicas intactas em um exame de ESM. Isso permite que as espécies individuais sejam separadas por seleção em massa de íons correspondentes a cada distribuição de massa usando um filtro de massa adequado (como um quadrupole) e a caracterização de suas diferenças conformais na análise subsequente de MS 3,4,5,6. No entanto, a eficiência da separação de estados proteicos ou proteoformes nesta estratégia é limitada pela extensão da diferença em suas distribuições de massa correspondentes.
A eletroforese capilar (CE) fornece um meio de separar espécies proteicas com base em suas diferentes cargas e tamanhos hidrodinâmicos na fase de solução com alta eficiência7. A combinação de CE com HDX oferece separação adicional de estados proteicos ou proteoforms na fase da solução. Além disso, o pequeno volume do capilar CE permite a utilização de uma solução totalmente deutada como a solução de eletrólito de fundo (BGE), ou seja, o buffer em execução, tornando o capilar como um reator HDX para amostras de proteínas. Devido à diferença na mobilidade eletroforética entre proteínas e reagentes protic no processo de eletroforese, a condução do HDX durante a CE resulta em um ambiente de deuteração quase completo para os analitos proteicos com conteúdo residual mínimo não deutedado, aumentando assim a sensibilidade da análise estrutural usando dados HDX. Como tal, desenvolvemos uma abordagem HDX diferencial baseada em CE, juntamente com MS de cima para baixo para caracterizar estruturas de alta ordem proteicas de forma específica do estado ouproteoforme 8.
Este artigo descreve protocolos para essa abordagem detalhando as etapas de preparação de materiais, procedimento experimental e análise de dados. Fatores que podem afetar o desempenho do método ou a qualidade dos dados estão listados em notas curtas. Os resultados representativos aqui apresentados incluem dados diferenciais de HDX de misturas de diferentes proteínas e variantes naturais de β-lactoglobulina bovina (β-lg), a maior proteína de soro de leite presente no leite9. Demonstramos eficiência de separação, reprodutibilidade e desempenho de rotulagem em 2H das duas variantes abundantes de β-lg, ou seja, A e B10,11 durante o HDX baseado em CE e caracterização específica de variantes de suas conformações.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ammonium acetate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A/3446/50</td>
			<td>&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI 8000 plus capillary electrophoresis system</td>
			<td>Sciex, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5406000097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal filter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC201024</td>
			<td>10 kDa cutoff</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deuterium oxide</td>
			<td>Energy Chemical</td>
			<td>E090001</td>
			<td>99.9 % D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formic acid</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>&#160;270480250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fused silica glass capillary</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150017</td>
			<td>ID 50&#956;m, OD 360&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gas chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>GC6890N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydroxypropyl cellulose</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>H113415</td>
			<td>MW 100000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stirrers</td>
			<td>DLAB</td>
			<td>8030101212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A456-4</td>
			<td>MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microvolume UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>84677JK7731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myoglobin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td colspan="2">Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive UHMR mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium&#160;hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ubiquitin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U6253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasonicator</td>
			<td>SCIENTZ</td>
			<td>SB-5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-lactoglobulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L0130</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange for conformational characterization of proteins with top-down mass spectrometry

A resolução da heterogeneidade conformacional de múltiplos estados protetivos que coexistem na solução continua sendo um dos principais obstáculos na caracterização da terapêutica proteica e na determinação das vias de transição conformais críticas para funções biológicas, que vão do reconhecimento molecular à catálise enzimática. A reação de troca de hidrogênio/deutério (HDX), juntamente com a análise espectrométrica de massa superior para baixo (MS), fornece um meio de caracterizar estruturas e dinâmicas de alta ordem de proteínas de forma mais adequada. O poder de resolução conformacional desta técnica é altamente dependente da eficiência de separar estados proteicos no nível de proteína intacta e minimizar o teor protic residual não deutado durante as reações HDX. 
Aqui descrevemos uma variante capilar baseada em eletroforese (CE) da abordagem HDX MS que visa melhorar a resolução conformacional. Nesta abordagem, as proteínas sofrem reações HDX enquanto migram através de uma solução de eletrólito de fundo deuterado (BGE) durante a separação eletroforética capilar. Diferentes estados proteicos ou proteoformes que coexistem na solução podem ser eficientemente separados com base em suas diferentes relações carga-tamanho. A diferença na mobilidade eletroforética entre proteínas e moléculas de solventes protic minimiza o solvente residual não deuterado, resultando em um ambiente de deuteração quase completo durante o processo HDX. A interface de fluxo microvial CE-MS permite uma ionização de eletrospray eficiente das espécies de proteínas elucidadas após uma rápida mistura com a solução de modificação de saciamento e desnaturação na saída do pulverizador. A análise on-line de cima para baixo de MS mede o nível global de deuteração das espécies de proteínas intactas e, posteriormente, a deuteração de seus fragmentos de fase gasosa. Este artigo demonstra essa abordagem em HDX diferencial para sistemas, incluindo as variantes de proteína natural que coexistem no leite.

A alteração da pressão de infusão do BGE permite o ajuste tanto da eficiência de separação quanto do tempo de migração, o que equivale ao tempo de reação HDX das proteínas a serem separadas (Figura 3). Uma menor pressão de infusão resulta em uma melhor separação dos picos de CE ao custo da duração do experimento (Figura 3A). Um tempo de reação de migração/HDX mais longo resulta em um nível mais alto de deuteração dos analitos proteicos (...

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Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Apresentado aqui é um protocolo para uma abordagem de troca de hidrogênio/deutério à base de eletroforese capilar (HDX), juntamente com espectrometria de massa de cima para baixo. Essa abordagem caracteriza a diferença nas estruturas de alta ordem entre diferentes espécies proteicas, incluindo proteínas em diferentes estados e diferentes proteoformes, conduzindo o diferencial simultâneo HDX e a separação eletroforética.

Troca de hidrogênio/deutério à base de eletroforose capilar para caracterização conformacional de proteínas com espectrometria de massa de cima para baixo

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Este método permite que a separação de espécies proteicas coexistindo, incluindo diferentes conformadores ou variantes e caracterização on-line de suas diferenças de estrutura de ordem superior a serem concluídas em uma única medição cems. Ele utiliza o efeito eletroforético para fornecer um ambiente de quase 100% de duração para as reações HDX e separação ortogonal das espécies de proteína coexistindo durante o HDX para análise de MS de cima para baixo. Comece com o pré-condicionamento da eletroforese capilar, troca de deutério de hidrogênio ou configuração DE HDX CE.Usando ultrassônica em uma mistura de 50% de metanol, 49% de água e 1% de ácido fórmico, limpe o fluxo através da interface microvial CE-MS por pelo menos 30 minutos à temperatura ambiente. Monte o capilar modificado HPC na eletroferese capilar ou instrumento CE. Enxágüe o capilar com solução de eletrólito de fundo ou BGE por 10 minutos usando o amostrador automático e deixe-o preenchido com o BGE.Use um comprimento apropriado de tubo capilar de sílica fundido não modificado como tubo de infusão para a solução modificador. Use uma manga de união e adequada para conectar a tubulação do modificador a uma seringa de vidro apertada a gás com uma temperatura sem cortes e enxágue a tubulação com a solução de modificador por pelo menos 10 minutos usando uma bomba de infusão. Insira as saídas do tubo capilar e modificador CE codificado por HPC carregados com as soluções correspondentes na interface CE-MS limpa.Avance a seringa com as bombas de infusão de tal forma que a solução modificador atinja a ponta da interface. Monte a interface CE-MS montada em uma carcaça de fonte de ionização de spray de nano elétron de um espectrômetro de massa. Aplique uma tensão de pulverização de 3-5 quilovolts na interface CE-MS.Infundir a solução do modificador com a bomba infusora a uma taxa de fluxo que varia de 0,1-10 microliters por minuto e garantir um spray eletro estável na ponta da interface CE-MS. Coloque o frasco de amostra contendo o BGE e o amostrador automático, que será usado posteriormente para adquirir eletroferogramas em branco e espectros de massa em branco. Estime o volume de injeção usando a relação entre o volume de injeção e os parâmetros de injeção.E injete a solução amostral usando o amostrador automático em dois PSI por uma duração apropriada. Inicie a separação ce aplicando uma tensão eletroforética de 20 quilovolts em uma pressão de infusão que varia de 0-2 PSI e adquira o eletroferograma. Enquanto isso, adquira os dados de MS no modo cromatógrafo onde o gráfico atual de íon é adquirido em função do tempo e as varreduras de MS correspondentes não são automaticamente combinadas em um único espectro.Salve o eletroferograma em branco e o espectro de massa como referências. Coloque os frascos de amostra contendo as concentrações desejadas das soluções de amostragem de proteínas no amostrador automático e adquira os eletroferógramas e espectros MS1 das espécies de proteínas eletroforeticamente separadas e deutério. Realize as medições tandem Ms.para as espécies de interesse, seja após a aquisição do espectro MS1 dentro da mesma corrida ou em uma corrida separada subsequente.Após cada medição, lave o capilar com bge a uma pressão de 20 PSI por pelo menos 10 minutos. Limpe a interface CEMS e todos os tubos para armazenamento após a conclusão dos experimentos. Adquira um conjunto de dados da amostra de ponto final HDX com MS no modo de infusão direta.Uma baixa pressão de infusão resultou em uma melhor separação dos picos de CE, mas levou a um aumento tanto no tempo de migração quanto na duração do experimento. Um tempo de reação mais longo do HDX resultou em um maior nível de desduração dos analitos proteicos. A variância A e B da imunoglobulina beta ou beta IG, que diferem por apenas dois resíduos de aminoácidos em sua sequência, deram origem a dois picos adequadamente separados no eletroferógrafo derivado do EIC.A variância diferenciada rotulada de deutério resultou em uma distribuição em massa distinta de íons. Observou-se menor número em abundância relativa de íons Z do que os íons C devido à ligação disofiada única na confirmação do IG beta que limita a eficiência de fragmentação entre CS 82 e CS 176. A maioria dos íons fragmentados produzidos a partir de Beta IGA, e beta IGB exibem uma extensão semelhante de absorção de deutério.No entanto, os segmentos maiores que cobrem os sites de variação de sequência do IGA beta foram dedurados em uma extensão significativamente maior do que o Beta IGB. O pH do BGE é ajustado de acordo com o ponto isoelétrico da amostra para evitar a agregação de proteínas e facilitar a separação, mantendo o complexo.

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Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Analisando Dynamics proteína utilizando hidrogênio câmbio Espectrometria de Massa

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Química

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Submillisecond alterações na conformação das proteínas resolvidas por Photothermal Boca deflexão

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

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Visualização de ambiente Espectrometria de Massa com o uso da fotografia Schlieren

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

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Um ensaio de HS-MRM para a quantificação de proteínas de célula hospedeira em biofármacos de proteínas por espectrometria de massa líquida cromatografia iônica mobilidade QTOF

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

Microsonda eletroforese capilar espectrometria de massa para célula única Metabolomics em embriões de viver rã (Xenopus laevis)

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometry

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometry

Caracterização de Polímeros Sintéticos via Espectrometria de Massa por Ionização a Laser com Matriz Assistida por Tempo de Voo (MALDI-TOF)

There are many techniques that can be employed in the characterization of synthetic homopolymers, but few provide as useful of information for end group ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Em grande escala proteômica de cima para baixo usando zona capilar eletroforese espectrometria de massa em Tandem

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Vigilância de drogas de alto rendimento e abrangente utilizando espectrometria de massa Multisegment eletroforese capilar-injeção

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III))

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry CE-ICP-MS for Quantification of Iron Redox Species FeII, FeIII

Configuração da Espectrometria de Massa de Plasma Acoplada de Eletroforese Capilar (CE-ICP-MS) para quantificação de espécies de redox de ferro (Fe(II), Fe(III))

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Abordagens de espectrometria de massa de eletroforese capilar para caracterização da proteína e corona metabólica adquirida por nanomateriais

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...