Name: capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange for conformational characterization of proteins with top-down mass spectrometry
Uploaded: 2021-06-08T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC 21974069). Los autores también recibieron apoyo del Instituto de Análisis Celular del Laboratorio de la Bahía de Shenzhen, China; Jiangsu Collaborative Innovation Center of Biomedical Functional Materials; y jiangsu Key Laboratory of Biomedical Materials en la Universidad Normal de Nanjing, China.

NOTA: Utilice reactivos de grado de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) o grado MS siempre que sea posible para minimizar los contaminantes que pueden interferir con el análisis de EM. No toque la interfaz CE-MS con las manos desnudas durante la medición para evitar la posibilidad de una descarga eléctrica causada por el voltaje electroforético o el voltaje electrospray.
1. Preparación del material
<ol><li>Modificación del capilar de sílice fundida para CE<ol>
<li>Prepa...

<ol>
	<li>Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+methods+in+characterization+of+the+higher+order+structure+of+protein+therapeutics.">Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169 (2020).</li><li>Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry.">Developments in hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 93 (1), 567-582 (2021).</li><li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformer-specific+hydrogen+exchange+analysis+of+Abeta(1-42)+oligomers+by+top-down+electron+capture+dissociation+mass+spectrometry.">Conformer-specific hydrogen exchange analysis of Abeta(1-42) oligomers by top-down electron capture dissociation mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 83 (13), 5386-5393 (2011).</li><li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+small+soluble+Abeta(1-40)+oligomers+studied+by+top-down+hydrogen+exchange+mass+spectrometry.">Structure and dynamics of small soluble Abeta(1-40) oligomers studied by top-down hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Biochemistry. 51 (17), 3694-3703 (2012).</li><li>Pan, J., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+structural+analysis+of+posttranslationally+modified+proteins+by+Fourier+transform+ion+cyclotron+resonance-MS+with+hydrogen/deuterium+exchange+and+electron+capture+dissociation.">Top-down structural analysis of posttranslationally modified proteins by Fourier transform ion cyclotron resonance-MS with hydrogen/deuterium exchange and electron capture dissociation.</a> Proteomics. 13 (6), 974-981 (2013).</li><li>Wang, G., Abzalimov, R. R., Bobst, C. E., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformer-specific+characterization+of+nonnative+protein+states+using+hydrogen+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Conformer-specific characterization of nonnative protein states using hydrogen exchange and top-down mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United. States of America. 110 (50), 20087-20092 (2013).</li><li>Mironov, G. G., Clouthier, C. M., Akbar, A., Keillor, J. W., Berezovski, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+enzyme+structure+and+activity+by+kinetic+capillary+electrophoresis-MS.">Simultaneous analysis of enzyme structure and activity by kinetic capillary electrophoresis-MS.</a> Nature Chemical Biology. 12 (11), 918-922 (2016).</li><li>Shen, Y., Zhao, X., Wang, G., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+hydrogen/deuterium+exchange+during+proteoform+separation+enables+characterization+of+conformational+differences+between+coexisting+protein+states.">Differential hydrogen/deuterium exchange during proteoform separation enables characterization of conformational differences between coexisting protein states.</a> Analytical Chemistry. 91 (6), 3805-3809 (2019).</li><li>Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invited+review:+&#946;-lactoglobulin:+binding+properties,+structure,+and+function.">Invited review: &#946;-lactoglobulin: binding properties, structure, and function.</a> Journal of Dairy Science. 87 (4), 785-796 (2004).</li><li>Qin, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+Tanford+transition+of+bovine+&#946;-lactoglobulin.">Structural basis of the Tanford transition of bovine &#946;-lactoglobulin.</a> Biochemistry. 37 (40), 14014-14023 (1998).</li><li>Qin, B. Y., Bewley, M. C., Creamer, L. K., Baker, E. N., Jameson, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+implications+of+structural+differences+between+variants+A+and+B+of+bovine+beta-lactoglobulin.">Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin.</a> Protein Science. 8 (1), 75-83 (1999).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+capillary+isoelectric+focusing+mass+spectrometry+analysis+of+peptides,+proteins,+and+monoclonal+antibodies+with+a+flow-through+microvial+interface.">High resolution capillary isoelectric focusing mass spectrometry analysis of peptides, proteins, and monoclonal antibodies with a flow-through microvial interface.</a> Analytical Chemistry. 90 (15), 9495-9503 (2018).</li><li>Busch, M. H. A., Kraak, J. C., Poppe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+acetate-coated+fused-silica+capillaries+for+the+separation+of+proteins+by+capillary+zone+electrophoresis.">Cellulose acetate-coated fused-silica capillaries for the separation of proteins by capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography A. 1695 (2), 287-296 (1995).</li><li>Zhao, X., Shen, Y., Tong, W., Wang, G., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deducing+disulfide+patterns+of+cysteine-rich+proteins+using+signature+fragments+produced+by+top-down+mass+spectrometry.">Deducing disulfide patterns of cysteine-rich proteins using signature fragments produced by top-down mass spectrometry.</a> Analyst. 143 (4), 817-823 (2018).</li><li>Sutera, S. P., Skalak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+Poiseuille's+law.">The history of Poiseuille's law.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 25 (1), 1-20 (1993).</li><li>Wang, G., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+characterization+of+the+higher+order+structure+of+disulfide-containing+proteins+using+hydrogen/deuterium+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).</li><li>Wang, G., Johnson, A. J., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+electrospray+ionization+mass+spectrometry+as+a+tool+for+characterization+of+small+soluble+protein+aggregates.">Evaluation of electrospray ionization mass spectrometry as a tool for characterization of small soluble protein aggregates.</a> Analytical Chemistry. 84 (3), 1718-1724 (2012).</li><li>Fellers, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProSight+Lite:+graphical+software+to+analyze+top-down+mass+spectrometry+data.">ProSight Lite: graphical software to analyze top-down mass spectrometry data.</a> Proteomics. 15 (7), 1235-1238 (2015).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MASH+Suite+Pro:+A+comprehensive+software+tool+for+top-down+proteomics.">MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 15 (2), 703-714 (2016).</li><li>Paterson, G. R., Hill, J. P., Otter, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+&#946;-lactoglobulin+A,+B+and+C+variants+of+bovine+whey+using+capillary+zone+electrophoresis.">Separation of &#946;-lactoglobulin A, B and C variants of bovine whey using capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography A. 700 (1), 105-110 (1995).</li><li>Wang, G., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+characterization+of+the+higher+order+structure+of+disulfide-containing+proteins+using+hydrogen/deuterium+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).</li><li>Nicolardi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-line+electrochemical+reduction+of+disulfide+bonds:+improved+FTICR-CID+and+-ETD+coverage+of+oxytocin+and+hepcidin.">On-line electrochemical reduction of disulfide bonds: improved FTICR-CID and -ETD coverage of oxytocin and hepcidin.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (12), 1980-1987 (2013).</li><li>Adhikari, S., Xia, Y., McLuckey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+analysis+of+disulfide-linked+proteins+using+photoinduced+radical+reactions+and+ET-DDC.">Top-down analysis of disulfide-linked proteins using photoinduced radical reactions and ET-DDC.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 444, 116173 (2019).</li><li>Rush, M. J. P., Riley, N. M., Westphall, M. S., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+characterization+of+proteins+with+intact+disulfide+bonds+using+activated-ion+electron+transfer+dissociation.">Top-down characterization of proteins with intact disulfide bonds using activated-ion electron transfer dissociation.</a> Analytical Chemistry. 90 (15), 8946-8953 (2018).</li><li>Zhong, X., Maxwell, E. J., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transport+in+a+micro+flow-through+vial+of+a+junction-at-the-tip+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry+interface.">Mass transport in a micro flow-through vial of a junction-at-the-tip capillary electrophoresis-mass spectrometry interface.</a> Analytical Chemistry. 83 (12), 4916-4923 (2011).</li></ol>

Los objetivos del recubrimiento de la pared interna del capilar CE incluyen la minimización del flujo electroosmótico y la absorción de proteínas durante el proceso CE13. Aunque el flujo electroosmótico es beneficioso para el análisis CE convencional de moléculas pequeñas debido a su capacidad de conducir especies neutras o con carga opuesta al detector, compromete la eficiencia de separación de especies de proteínas con tamaños similares y cargas netas en solución. El recubrimiento de...

Distinguir las especies de proteínas en diferentes estados conformacionales, de unión o modificación y caracterizar sus diferencias estructurales es importante para monitorear las vías de transición entre estas especies involucradas en eventos biológicos, que van desde el reconocimiento molecular hasta la catálisis enzimática, y comprender los mecanismos subyacentes a estos eventos. Las técnicas biofísicas convencionales no proporcionan una solución completa debido a las limitaciones como la resolución insuficiente y la pérdida de información dinámica en la solución. El intercambio hidrógeno/deuterio junto con la espectrometría de masas (HDX MS) es una técnica que etiqueta las características estructurales y conformacionales de las proteínas con deuterio (2H) a través del intercambio entre átomos de hidrógeno lábil de proteínas y 2H de la solución 2H2O introducida deliberadamente. Los protones involucrados en el enlace de hidrógeno o que están secuestrados del disolvente en el interior de la proteína no se intercambian fácilmente1. Por lo tanto, como el tipo de cambio en un sitio intercambiable depende en gran medida de su participación en estructuras de orden superior, las estructuras de proteínas pueden ser reveladas a alta resolución espacial por MS que sondea la extensión y la tasa de absorción de 2H en función de las diferentes masas atómicas entre 1H y 2H. En las últimas décadas, HDX MS se ha convertido en una técnica extraordinariamente exitosa para estudiar conformaciones y dinámicas de proteínas2.
En el enfoque clásico de abajo hacia arriba de HDX MS, el conjunto de especies de proteínas en diferentes estados conformacionales, de unión o modificación se proteoliza sin separación a nivel de proteína intacta, lo que hace inviable caracterizar especies individuales mediante el análisis de los fragmentos proteolíticos resultantes con contenido de deuterio enrevesado. En contraste, en el enfoque de arriba hacia abajo, diferentes estados de proteínas o proteoformas que han incorporado diferentes contenidos de deuterio dan lugar a múltiples distribuciones de masas de proteínas intactas en una exploración de EM. Esto permite separar especies individuales mediante la selección masiva de iones correspondientes a cada distribución de masa utilizando un filtro de masa adecuado (como un cuadrupolo) y la caracterización de sus diferencias conformacionales en el posterior análisis de EM en tándem 3,4,5,6. Sin embargo, la eficiencia de separar los estados proteicos o proteoformas en esta estrategia está limitada por el grado de diferencia en sus correspondientes distribuciones de masa.
La electroforesis capilar (CE) proporciona un medio para separar las especies de proteínas en función de sus diferentes cargas y tamaños hidrodinámicos en la fase de solución con alta eficiencia7. La combinación de CE con HDX ofrece una separación adicional de los estados proteicos o proteoformas en la fase de solución. Además, el pequeño volumen del capilar CE permite la utilización de una solución totalmente deuterada como solución electrolítica de fondo (BGE), es decir, el tampón en funcionamiento, lo que hace que el capilar sea un reactor HDX para muestras de proteínas. Debido a la diferencia en la movilidad electroforética entre las proteínas y los reactivos próticos en el proceso de electroforesis, la realización de HDX durante la CE da como resultado un entorno de deuteratización casi completo para los analitos de proteínas con un contenido residual no deuterado mínimo, mejorando así la sensibilidad del análisis estructural utilizando datos hdx. Como tal, desarrollamos un enfoque HDX diferencial basado en CE junto con MS de arriba hacia abajo para caracterizar las estructuras de orden superior de proteínas de una manera específica de estado o proteoforma8.
Este documento describe los protocolos para este enfoque detallando los pasos de preparación de materiales, procedimientos experimentales y análisis de datos. Los factores que pueden afectar el rendimiento del método o la calidad de los datos se enumeran en notas cortas. Los resultados representativos aquí presentados incluyen datos diferenciales de HDX de mezclas de diferentes proteínas y variantes naturales de β-lactoglobulina bovina (β-lg), la principal proteína de suero presente en la leche9. Demostramos eficiencia de separación, reproducibilidad y rendimiento de etiquetado 2H de las dos variantes abundantes de β-lg, es decir, A y B10,11 durante el HDX basado en CE y la caracterización específica de variantes de sus conformaciones.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ammonium acetate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A/3446/50</td>
			<td>&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI 8000 plus capillary electrophoresis system</td>
			<td>Sciex, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5406000097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal filter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC201024</td>
			<td>10 kDa cutoff</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deuterium oxide</td>
			<td>Energy Chemical</td>
			<td>E090001</td>
			<td>99.9 % D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formic acid</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>&#160;270480250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fused silica glass capillary</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150017</td>
			<td>ID 50&#956;m, OD 360&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gas chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>GC6890N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydroxypropyl cellulose</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>H113415</td>
			<td>MW 100000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stirrers</td>
			<td>DLAB</td>
			<td>8030101212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A456-4</td>
			<td>MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microvolume UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>84677JK7731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myoglobin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td colspan="2">Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive UHMR mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium&#160;hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ubiquitin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U6253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasonicator</td>
			<td>SCIENTZ</td>
			<td>SB-5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-lactoglobulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L0130</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange for conformational characterization of proteins with top-down mass spectrometry

Resolver la heterogeneidad conformacional de múltiples estados proteicos que coexisten en solución sigue siendo uno de los principales obstáculos en la caracterización de la terapéutica proteica y la determinación de las vías de transición conformacional críticas para las funciones biológicas, que van desde el reconocimiento molecular hasta la catálisis enzimática. La reacción de intercambio de hidrógeno/deuterio (HDX) junto con el análisis espectrométrico de masas (MS) de arriba hacia abajo proporciona un medio para caracterizar las estructuras y dinámicas de orden superior de proteínas de una manera específica del conformador. El poder de resolución conformacional de esta técnica depende en gran medida de la eficiencia de separar los estados de proteína a nivel de proteína intacta y minimizar el contenido protico residual no deuterado durante las reacciones HDX. 
Aquí describimos una variante basada en electroforesis capilar (CE) del enfoque HDX MS que tiene como objetivo mejorar la resolución conformacional. En este enfoque, las proteínas experimentan reacciones HDX mientras migran a través de una solución de electrolito de fondo deuterado (BGE) durante la separación electroforética capilar. Los diferentes estados de proteínas o proteoformas que coexisten en solución se pueden separar de manera eficiente en función de sus diferentes proporciones de carga a tamaño. La diferencia en la movilidad electroforética entre las proteínas y las moléculas de disolvente prótico minimiza el disolvente residual no deuterado, lo que resulta en un entorno de deuteratización casi completo durante el proceso HDX. La interfaz CE-MS microvial de flujo continuo permite una ionización electrospray eficiente de las especies de proteínas eluidas después de una rápida mezcla con la solución modificadora de enfriamiento y desnaturalización en la salida del pulverizador. El análisis de EM de arriba hacia abajo en línea mide el nivel de deuteración global de las especies de proteínas intactas eluidas y, posteriormente, la deuteración de sus fragmentos en fase gaseosa. Este artículo demuestra este enfoque en HDX diferencial para sistemas, incluidas las variantes de proteínas naturales que coexisten en la leche.

El cambio de la presión de infusión de BGE permite ajustar tanto la eficiencia de separación como el tiempo de migración, lo que equivale al tiempo de reacción HDX de las proteínas a separar (Figura 3). Una presión de infusión más baja da como resultado una mejor separación de los picos de CE a costa de la duración del experimento (Figura 3A). Un tiempo de reacción de migración/HDX más largo da como resultado un mayor nivel de deuteración de los a...

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Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Aquí se presenta un protocolo para un enfoque de intercambio de hidrógeno / deuterio (HDX) basado en electroforesis capilar junto con espectrometría de masas de arriba hacia abajo. Este enfoque caracteriza la diferencia en las estructuras de orden superior entre diferentes especies de proteínas, incluidas proteínas en diferentes estados y diferentes proteoformas, mediante la realización de HDX diferencial concurrente y separación electroforética.

Intercambio de hidrógeno/deuterio basado en electroforesis capilar para la caracterización conformacional de proteínas con espectrometría de masas de arriba hacia abajo

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Este método permite completar la separación de especies proteicas coexistentes, incluidos diferentes conformadores o variantes y la caracterización en línea de sus diferencias de estructura de orden superior en una sola medición CEMS. Utiliza el efecto electroforético para proporcionar un entorno de casi el 100% de duración para las reacciones HDX y la separación ortogonal de las especies de proteínas coexistentes durante HDX para el análisis de EM de arriba hacia abajo. Comience con el preacondicionamiento de la electroforesis capilar, el intercambio de hidrógeno deuterio o la configuración ce HDX.Usando ultrasonido en una mezcla de 50% de metanol, 49% de agua y 1% de ácido fórmico, limpie el flujo a través de la interfaz microvial CE-MS durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente. Monte el capilar modificado HPC en la electroféresis capilar o instrumento CE. Enjuague el capilar con solución de electrolito de fondo o BGE durante 10 minutos con el muestreador automático y déjelo lleno con el BGE.Utilice una longitud adecuada de tubo capilar de sílice fundida sin modificar como tubo de infusión para la solución modificadora. Use una unión y una funda adecuada para conectar el tubo modificador a una jeringa de vidrio hermético al gas con una temperatura roma y enjuague el tubo con la solución modificadora durante al menos 10 minutos con una bomba de infusión. Inserte las salidas de los tubos capilares y modificadores CE codificados HPC cargados con las soluciones correspondientes en la interfaz CE-MS limpia.Avance la jeringa con las bombas de infusión de tal manera que la solución modificadora llegue a la punta de la interfaz. Monte la interfaz CE-MS ensamblada en una carcasa de fuente de ionización por pulverización de nano electrones de un espectrómetro de masas. Aplique un voltaje de pulverización de 3-5 kilovoltios a la interfaz CE-MS.Infundir la solución modificadora con la bomba del infusor a un caudal que oscila entre 0,1 y 10 microlitros por minuto y garantizar una electropulsión estable en la punta de la interfaz CE-MS. Coloque el vial de muestra que contiene el BGE y el muestreador automático, que se utilizará más tarde para adquirir electroferogramas en blanco y espectros de masas en blanco. Estimar el volumen de inyección utilizando la relación entre el volumen de inyección y los parámetros de inyección.E inyecte la solución de muestra utilizando el muestreador automático a dos PSI durante un período adecuado. Iniciar la separación CE aplicando una tensión electroforética de 20 kilovoltios en una presión de infusión que oscila entre 0-2 PSI y adquirir el electroferograma. Mientras tanto, adquiera los datos de MS en el modo cromatográfico donde el gráfico de corriente iónica se adquiere en función del tiempo y los escaneos MS correspondientes no se combinan automáticamente en un solo espectro.Guarde el electroferograma en blanco y los espectros de masas como referencias. Coloque los viales de muestra que contienen las concentraciones deseadas de las soluciones de muestra de proteínas en el automuestreador y adquiera los electroferogramas y espectros MS1 de las especies de proteínas separadas electroforéticamente y marcadas con deuterio. Realizar mediciones en tándem de Ms. para las especies de interés, ya sea después de adquirir los espectros MS1 dentro de la misma ejecución o en una ejecución separada posterior.Después de cada medición, enjuague el capilar con BGE a una presión de 20 PSI durante al menos 10 minutos. Limpie la interfaz CEMS y todos los tubos para el almacenamiento una vez finalizados los experimentos. Adquiera un conjunto de datos de la muestra de punto final HDX con MS en modo de infusión directa.Una baja presión de infusión resultó en una mejor separación de los picos de CE, pero condujo a un aumento tanto en el tiempo de migración como en la duración del experimento. Un tiempo de reacción HDX más largo resultó en un mayor nivel de deduración de los analitos de proteínas. La varianza A y B de la inmunoglobulina beta o beta IG, que difieren por solo dos residuos de aminoácidos en su secuencia, dio lugar a dos picos adecuadamente separados en el electroferograma derivado de EIC.La varianza diferencial marcada con deuterio resultó en una distribución de masa distinta de iones. Se observó un número menor en abundancia relativa de iones Z que de iones C debido al enlace disofificado único en la confirmación de beta IG que limita la eficiencia de fragmentación entre CS 82 y CS 176. La mayoría de los iones fragmentos producidos a partir de beta IGA y beta IGB exhiben un grado similar de absorción de deuterio.Sin embargo, los segmentos más grandes que cubren los sitios de variación de secuencia de beta IGA se dedutraron en una medida significativamente mayor que beta IGB. El pH de BGE se ajusta de acuerdo con el punto isoeléctrico de la muestra para evitar la agregación de proteínas y facilitar la separación mientras se mantiene el complejo.

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Chemistry

Unit 1

Principles of Mass Spectrometry

SCIENTISTS IN ACTION

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

El análisis de dinámica de proteínas utilizando hidrógeno Intercambio de Espectrometría de Masas

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Investigación

Química

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Submillisecond Cambios conformacionales en proteínas resueltas por fototérmica Desviación de haz

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

La visualización del ambiente Espectrometría de Masas con el uso de la fotografía Schlieren

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

Un ensayo de HS-MRM para la cuantificación de las proteínas de la célula huésped en productos biofarmacéuticos de proteínas por cromatografía líquida QTOF masa espectrometría por movilidad iónica

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

Microsondeo electrónico capilar electroforesis de espectrometría de masas para unicelular metabolómica en embriones de Rana viva (Xenopus laevis)

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometry

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometry

Caracterización de polímeros sintéticos vía matriz asistida por láser desorción de ionización tiempo de vuelo (MALDI-TOF) espectrometría de masas

There are many techniques that can be employed in the characterization of synthetic homopolymers, but few provide as useful of information for end group ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Proteómica de arriba hacia abajo a gran escala mediante electroforesis capilar de zona Spectrometry total en tándem

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Alto rendimiento y amplio farmacovigilancia mediante espectrometría de masas siguientes electroforesis capilar de inyección

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III))

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry CE-ICP-MS for Quantification of Iron Redox Species FeII, FeIII

Configuración de Espectrometría de Masas De Plasma Acoplada Inductivamente Electroforesistiva (CE-ICP-MS) para Cuantificación de Especies redox de Hierro (Fe(II), Fe(III))

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Electroforesis capilar Enfoques de espectrometría de masas para la caracterización de la proteína y el metabolito Corona adquiridos por nanomateriales

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...