Name: capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange for conformational characterization of proteins with top-down mass spectrometry
Uploaded: 2021-06-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry at JoVE.com

Detta arbete stöddes av bidrag från National Natural Science Foundation of China (NSFC 21974069). Författarna fick också stöd från Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, Kina; Jiangsu Collaborative Innovation Center för biomedicinska funktionella material; och Jiangsu Key Laboratory of Biomedical Materials vid Nanjing Normal University, Kina.

OBS: Använd högpresterande vätskekromatografi (HPLC) eller MS-klassade reagenser när det är möjligt för att minimera de föroreningar som kan störa MS-analysen. Vidrör inte CE-MS-gränssnittet med bara händer under mätningen för att undvika risken för en elektrisk stöt orsakad av antingen den elektroforetiska spänningen eller elektrosprayspänningen.
1. Beredning av material
<ol><li>Modifiering av smält kiseldioxidkapillär för CE<ol>
<li>Bered en 5 % (vikt/vikt) hydroxiprop...

<ol>
	<li>Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+methods+in+characterization+of+the+higher+order+structure+of+protein+therapeutics.">Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169 (2020).</li><li>Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry.">Developments in hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 93 (1), 567-582 (2021).</li><li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformer-specific+hydrogen+exchange+analysis+of+Abeta(1-42)+oligomers+by+top-down+electron+capture+dissociation+mass+spectrometry.">Conformer-specific hydrogen exchange analysis of Abeta(1-42) oligomers by top-down electron capture dissociation mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 83 (13), 5386-5393 (2011).</li><li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+small+soluble+Abeta(1-40)+oligomers+studied+by+top-down+hydrogen+exchange+mass+spectrometry.">Structure and dynamics of small soluble Abeta(1-40) oligomers studied by top-down hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Biochemistry. 51 (17), 3694-3703 (2012).</li><li>Pan, J., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+structural+analysis+of+posttranslationally+modified+proteins+by+Fourier+transform+ion+cyclotron+resonance-MS+with+hydrogen/deuterium+exchange+and+electron+capture+dissociation.">Top-down structural analysis of posttranslationally modified proteins by Fourier transform ion cyclotron resonance-MS with hydrogen/deuterium exchange and electron capture dissociation.</a> Proteomics. 13 (6), 974-981 (2013).</li><li>Wang, G., Abzalimov, R. R., Bobst, C. E., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformer-specific+characterization+of+nonnative+protein+states+using+hydrogen+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Conformer-specific characterization of nonnative protein states using hydrogen exchange and top-down mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United. States of America. 110 (50), 20087-20092 (2013).</li><li>Mironov, G. G., Clouthier, C. M., Akbar, A., Keillor, J. W., Berezovski, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+enzyme+structure+and+activity+by+kinetic+capillary+electrophoresis-MS.">Simultaneous analysis of enzyme structure and activity by kinetic capillary electrophoresis-MS.</a> Nature Chemical Biology. 12 (11), 918-922 (2016).</li><li>Shen, Y., Zhao, X., Wang, G., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+hydrogen/deuterium+exchange+during+proteoform+separation+enables+characterization+of+conformational+differences+between+coexisting+protein+states.">Differential hydrogen/deuterium exchange during proteoform separation enables characterization of conformational differences between coexisting protein states.</a> Analytical Chemistry. 91 (6), 3805-3809 (2019).</li><li>Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invited+review:+&#946;-lactoglobulin:+binding+properties,+structure,+and+function.">Invited review: &#946;-lactoglobulin: binding properties, structure, and function.</a> Journal of Dairy Science. 87 (4), 785-796 (2004).</li><li>Qin, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+Tanford+transition+of+bovine+&#946;-lactoglobulin.">Structural basis of the Tanford transition of bovine &#946;-lactoglobulin.</a> Biochemistry. 37 (40), 14014-14023 (1998).</li><li>Qin, B. Y., Bewley, M. C., Creamer, L. K., Baker, E. N., Jameson, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+implications+of+structural+differences+between+variants+A+and+B+of+bovine+beta-lactoglobulin.">Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin.</a> Protein Science. 8 (1), 75-83 (1999).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+capillary+isoelectric+focusing+mass+spectrometry+analysis+of+peptides,+proteins,+and+monoclonal+antibodies+with+a+flow-through+microvial+interface.">High resolution capillary isoelectric focusing mass spectrometry analysis of peptides, proteins, and monoclonal antibodies with a flow-through microvial interface.</a> Analytical Chemistry. 90 (15), 9495-9503 (2018).</li><li>Busch, M. H. A., Kraak, J. C., Poppe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+acetate-coated+fused-silica+capillaries+for+the+separation+of+proteins+by+capillary+zone+electrophoresis.">Cellulose acetate-coated fused-silica capillaries for the separation of proteins by capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography A. 1695 (2), 287-296 (1995).</li><li>Zhao, X., Shen, Y., Tong, W., Wang, G., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deducing+disulfide+patterns+of+cysteine-rich+proteins+using+signature+fragments+produced+by+top-down+mass+spectrometry.">Deducing disulfide patterns of cysteine-rich proteins using signature fragments produced by top-down mass spectrometry.</a> Analyst. 143 (4), 817-823 (2018).</li><li>Sutera, S. P., Skalak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+Poiseuille's+law.">The history of Poiseuille's law.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 25 (1), 1-20 (1993).</li><li>Wang, G., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+characterization+of+the+higher+order+structure+of+disulfide-containing+proteins+using+hydrogen/deuterium+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).</li><li>Wang, G., Johnson, A. J., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+electrospray+ionization+mass+spectrometry+as+a+tool+for+characterization+of+small+soluble+protein+aggregates.">Evaluation of electrospray ionization mass spectrometry as a tool for characterization of small soluble protein aggregates.</a> Analytical Chemistry. 84 (3), 1718-1724 (2012).</li><li>Fellers, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProSight+Lite:+graphical+software+to+analyze+top-down+mass+spectrometry+data.">ProSight Lite: graphical software to analyze top-down mass spectrometry data.</a> Proteomics. 15 (7), 1235-1238 (2015).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MASH+Suite+Pro:+A+comprehensive+software+tool+for+top-down+proteomics.">MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 15 (2), 703-714 (2016).</li><li>Paterson, G. R., Hill, J. P., Otter, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+&#946;-lactoglobulin+A,+B+and+C+variants+of+bovine+whey+using+capillary+zone+electrophoresis.">Separation of &#946;-lactoglobulin A, B and C variants of bovine whey using capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography A. 700 (1), 105-110 (1995).</li><li>Wang, G., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+characterization+of+the+higher+order+structure+of+disulfide-containing+proteins+using+hydrogen/deuterium+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).</li><li>Nicolardi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-line+electrochemical+reduction+of+disulfide+bonds:+improved+FTICR-CID+and+-ETD+coverage+of+oxytocin+and+hepcidin.">On-line electrochemical reduction of disulfide bonds: improved FTICR-CID and -ETD coverage of oxytocin and hepcidin.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (12), 1980-1987 (2013).</li><li>Adhikari, S., Xia, Y., McLuckey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+analysis+of+disulfide-linked+proteins+using+photoinduced+radical+reactions+and+ET-DDC.">Top-down analysis of disulfide-linked proteins using photoinduced radical reactions and ET-DDC.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 444, 116173 (2019).</li><li>Rush, M. J. P., Riley, N. M., Westphall, M. S., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+characterization+of+proteins+with+intact+disulfide+bonds+using+activated-ion+electron+transfer+dissociation.">Top-down characterization of proteins with intact disulfide bonds using activated-ion electron transfer dissociation.</a> Analytical Chemistry. 90 (15), 8946-8953 (2018).</li><li>Zhong, X., Maxwell, E. J., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transport+in+a+micro+flow-through+vial+of+a+junction-at-the-tip+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry+interface.">Mass transport in a micro flow-through vial of a junction-at-the-tip capillary electrophoresis-mass spectrometry interface.</a> Analytical Chemistry. 83 (12), 4916-4923 (2011).</li></ol>

Målen med att belägga CE-kapillärens innervägg innefattar minimering av det elektroosmotiska flödet och proteinabsorptionen under CE-processen13. Även om elektroosmotiskt flöde är fördelaktigt för konventionell CE-analys av små molekyler på grund av dess förmåga att driva neutrala eller motsatt laddade arter till detektorn, äventyrar det separationseffektiviteten hos proteinarter med liknande storlekar och nettoladdningar i lösning. Beläggning av kapillären med HPC minimerar det ...

Att skilja proteinarter i olika konformations-, bindnings- eller modifieringstillstånd och karakterisera deras strukturella skillnader är viktiga för att övervaka vägarna för övergångar mellan dessa arter som är involverade i biologiska händelser, allt från molekylärt erkännande till enzymatisk katalys och förstå mekanismerna bakom dessa händelser. Konventionella biofysiska tekniker ger inte en komplett lösning på grund av begränsningar som otillräcklig upplösning och förlust av dynamisk information i lösning. Väte / deuteriumutbyte i kombination med masspektrometri (HDX MS) är en teknik som märker de strukturella och konformationella egenskaperna hos proteiner med deuterium (2H) via utbytet mellan labila väteatomer av proteiner och 2H från den avsiktligt införda2H2O-lösningen. Protoner som är involverade i vätebindning eller som är sekvestrerade från lösningsmedlet i proteinets inre utbyter inte lätt1. Eftersom växelkursen på en utbytbar plats är starkt beroende av dess inblandning i strukturer av högre ordning, kan proteinstrukturerna avslöjas vid hög rumslig upplösning av MS som undersöker omfattningen och hastigheten av 2H-upptag baserat på de olika atommassorna mellan 1H och 2H. Under de senaste decennierna har HDX MS blivit en utomordentligt framgångsrik teknik för att studera proteinkonformationer och dynamik2.
I den klassiska bottom-up-metoden för HDX MS proteolyseras ensemblen av proteinarter i olika konformations-, bindnings- eller modifieringstillstånd utan separation på intakt proteinnivå, vilket gör det omöjligt att karakterisera enskilda arter genom att analysera de resulterande proteolytiska fragmenten med invecklat deuteriuminnehåll. Däremot ger olika proteintillstånd eller proteoformer som har införlivat olika deuteriuminnehåll i top-down-metoden upphov till flera fördelningar av intakta proteinmassor i en MS-skanning. Detta gör det möjligt för enskilda arter att separeras genom massselektion av joner som motsvarar varje massfördelning med användning av ett korrekt massfilter (såsom en kvadrupol) och karakteriseringen av deras konformationsskillnader i den efterföljande tandem MS-analysen 3,4,5,6. Effektiviteten av att separera proteintillstånd eller proteoformer i denna strategi begränsas emellertid av omfattningen av skillnaden i deras motsvarande massfördelningar.
Kapillärelektrofores (CE) ger ett sätt att separera proteinarter baserat på deras olika laddningar och hydrodynamiska storlekar i lösningsfasen med hög effektivitet7. Att kombinera CE med HDX erbjuder ytterligare separation av proteintillstånd eller proteoformer i lösningsfasen. Dessutom möjliggör den lilla volymen av CE-kapillären användningen av en helt deutererad lösning som bakgrundselektrolytlösning (BGE), dvs den löpande bufferten, vilket gör kapillären till en HDX-reaktor för proteinprover. På grund av skillnaden i elektroforetisk rörlighet mellan proteiner och protiska reagenser i elektroforesprocessen resulterar ledande HDX under CE i en nästan fullständig deuterating miljö för proteinanalyterna med minimalt kvarvarande icke-deutererat innehåll, vilket ökar känsligheten för strukturanalysen med hjälp av HDX-data. Som sådan utvecklade vi en CE-baserad differentiell HDX-metod i kombination med top-down MS för att karakterisera proteinstrukturer av högre ordning på ett tillstånds- eller proteoformspecifikt sätt8.
Detta dokument beskriver protokoll för detta tillvägagångssätt genom att beskriva stegen för materialberedning, experimentell procedur och dataanalys. Faktorer som kan påverka metodens prestanda eller datakvalitet listas i korta anteckningar. De representativa resultaten som presenteras här inkluderar differentiella HDX-data för blandningar av olika proteiner och naturliga varianter av nötkreatur β-laktoglobulin (β-lg), det viktigaste vassleproteinet som finns i mjölk9. Vi demonstrerar separationseffektivitet, reproducerbarhet och 2H-märkningsprestanda för de två rikliga varianterna av β-lg, dvs A och B10,11 under CE-baserad HDX och variantspecifik karakterisering av deras konformationer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ammonium acetate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A/3446/50</td>
			<td>&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI 8000 plus capillary electrophoresis system</td>
			<td>Sciex, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5406000097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal filter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC201024</td>
			<td>10 kDa cutoff</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deuterium oxide</td>
			<td>Energy Chemical</td>
			<td>E090001</td>
			<td>99.9 % D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formic acid</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>&#160;270480250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fused silica glass capillary</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150017</td>
			<td>ID 50&#956;m, OD 360&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gas chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>GC6890N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydroxypropyl cellulose</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>H113415</td>
			<td>MW 100000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stirrers</td>
			<td>DLAB</td>
			<td>8030101212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A456-4</td>
			<td>MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microvolume UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>84677JK7731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myoglobin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td colspan="2">Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive UHMR mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium&#160;hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ubiquitin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U6253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasonicator</td>
			<td>SCIENTZ</td>
			<td>SB-5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-lactoglobulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L0130</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange for conformational characterization of proteins with top-down mass spectrometry

Att lösa konformationsheterogenitet av flera proteintillstånd som samexisterar i lösning är fortfarande ett av de största hindren vid karakteriseringen av proteinterapier och bestämningen av de konformationsövergångsvägar som är kritiska för biologiska funktioner, allt från molekylärt erkännande till enzymatisk katalys. Väte / deuteriumutbyte (HDX) reaktion i kombination med top-down masspektrometrisk (MS) analys ger ett sätt att karakterisera protein högre ordning strukturer och dynamik på ett konformerande specifikt sätt. Den konformationella upplösningskraften hos denna teknik är starkt beroende av effektiviteten av att separera proteintillstånd på intakt proteinnivå och minimera det återstående icke-deutererade protiska innehållet under HDX-reaktionerna. 
Här beskriver vi en kapillärelektrofores (CE) -baserad variant av HDX MS-metoden som syftar till att förbättra konformationsupplösningen. I detta tillvägagångssätt genomgår proteiner HDX-reaktioner medan de migrerar genom en deutererad bakgrundselektrolytlösning (BGE) under kapillärelektroforetisk separation. Olika proteintillstånd eller proteoformer som samexisterar i lösning kan effektivt separeras baserat på deras olika laddnings-till-storlek-förhållanden. Skillnaden i elektroforetisk rörlighet mellan proteiner och protiska lösningsmedelsmolekyler minimerar det återstående icke-deutererade lösningsmedlet, vilket resulterar i en nästan fullständig deuterating miljö under HDX-processen. Det genomströmningsmikroviala CE-MS-gränssnittet möjliggör effektiv elektrosprayjonisering av de eluerade proteinarterna efter en snabb blandning med den släckande och denaturerande modifierarlösningen vid sprutans utlopp. Online-top-down MS-analysen mäter den globala deuterationsnivån för de eluerade intakta proteinarterna och därefter deuterationen av deras gasfasfragment. Detta dokument visar detta tillvägagångssätt i differentiell HDX för system, inklusive de naturliga proteinvarianterna som samexisterar i mjölk.

Ändring av infusionstrycket för BGE möjliggör justering av både separationseffektivitet och migrationstid, vilket motsvarar HDX-reaktionstiden för de proteiner som ska separeras (figur 3). Ett lägre infusionstryck resulterar i bättre separation av CE-toppar på bekostnad av experimentets varaktighet (figur 3A). En längre migration/HDX-reaktionstid resulterar i en högre nivå av deuteration av proteinanalyterna (fig...

Watch this Scientific Journal Video about Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry at JoVE.com

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Här presenteras ett protokoll för en kapillärelektroforesbaserad väte/deuteriumutbytesmetod (HDX) i kombination med masspektrometri uppifrån och ner. Detta tillvägagångssätt karakteriserar skillnaden i högre ordningsstrukturer mellan olika proteinarter, inklusive proteiner i olika tillstånd och olika proteoformer, genom att genomföra samtidig differentiell HDX och elektroforetisk separation.

Kapillärelektroforesbaserat väte/deuteriumutbyte för konformationskarakterisering av proteiner med masspektrometri uppifrån och ner

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Denna metod gör det möjligt att separera samexisterande proteinarter, inklusive olika konformerare eller varianter och onlinekarakterisering av deras högre ordningsstrukturskillnader som ska slutföras i en enda CEMS-mätning. Den använder den elektroforetiska effekten för att ge en nästan 100% varaktighetsmiljö för HDX-reaktionerna och ortogonal separation av de samexisterande proteinarterna under HDX för top-down MS-analys. Börja med förkonditionering av kapillärelektroforesen, vätedeuteriumutbyte eller CE HDX-inställning.Använda ultraljud i en blandning av 50% metanol, 49% vatten och 1% myrsyra, rengör flödet genom mikrovial CE-MS gränssnitt i minst 30 minuter vid rumstemperatur. Montera den HPC-modifierade kapillären på kapillärelektroferesen eller CE-instrumentet. Skölj kapillären med bakgrundselektrolytlösning eller BGE i 10 minuter med hjälp av autoprovtagaren och låt den fyllas med BGE.Använd en lämplig längd av omodifierade kapillärslangar av kiseldioxid som infusionsslang för modifierarlösningen. Använd en koppling och korrekt hylsa för att ansluta modifierarslangen till en gastät glasspruta med en trubbig temperatur och skölj slangen med modifierarlösningen i minst 10 minuter med en infusionspump. Sätt i utloppen på den HPC-kodade CE-kapillären och modifierarslangen laddad med motsvarande lösningar i det rengjorda CE-MS-gränssnittet.Avancera sprutan med infusionspumparna så att modifierarlösningen når spetsen på gränssnittet. Montera det monterade CE-MS-gränssnittet på ett nanoelektronsprayjoniseringskällhus på en masspektrometer. Applicera en sprayspänning på 3-5 kilovolt på CE-MS-gränssnittet.Infusera modifierarlösningen med infusionspumpen med en flödeshastighet som sträcker sig från 0,1-10 mikroliter per minut och säkerställ en stabil elektrospray vid spetsen av CE-MS-gränssnittet. Placera provflaskan som innehåller BGE och den automatiska provtagaren, som senare kommer att användas för att förvärva tomma elektroferogram och tomma massspektra. Uppskatta injektionsvolymen med hjälp av förhållandet mellan injektionsvolym och injektionsparametrar.Och injicera provlösningen med hjälp av den automatiska provtagaren vid två PSI under en lämplig varaktighet. Starta CE-separationen genom att applicera en elektroforetisk spänning på 20 kilovolt i ett infusionstryck som sträcker sig från 0-2 PSI och förvärva elektroferogrammet. Under tiden kan du förvärva MS-data i det kromatografiska läget där jonströmsgrafen förvärvas som en funktion av tiden och motsvarande MS-skanningar inte automatiskt kombineras till ett enda spektrum.Spara det tomma elektroferogrammet och massspektra som referenser. Placera provflaskorna som innehåller de önskade koncentrationerna av proteinprovlösningarna i den automatiska provtagaren och förvärva elektroferogrammen och MS1-spektra av de elektroforetiskt separerade och deuteriummärkta proteinarterna. Utför tandem Ms.-mätningar för de arter som är av intresse, antingen efter att ha förvärvat MS1-spektra inom samma körning eller i en efterföljande separat körning.Spola kapillären med BGE efter varje mätning vid ett tryck av 20 PSI i minst 10 minuter. Rengör CEMS-gränssnittet och alla slangar för lagring när experimenten är klara. Skaffa en datauppsättning för HDX-effektmåttet med MS i direkt infusionsläge.Ett lågt infusionstryck resulterade i bättre separation av CE-toppar, men ledde till en ökning av både migrationstiden och varaktigheten av experimentet. En längre HDX-reaktionstid resulterade i en högre nivå av uttömning av proteinanalyterna. A- och B-variansen av beta-immunglobulin eller beta-IG, som skiljer sig åt med endast två aminosyrarester i sin sekvens, gav upphov till två tillräckligt separerade toppar i det EIC-härledda elektroferogrammet.Den differentiella deuteriummärkta variansen resulterade i en distinkt massfördelning av joner. Ett lägre antal i relativ överflöd av Z-joner än C-joner observerades på grund av den unika dysofierade kopplingen i bekräftelse av beta-IG som begränsar fragmenteringseffektiviteten mellan CS 82 och CS 176. De flesta fragmentjoner som produceras från beta IGA och beta IGB uppvisar en liknande omfattning av deuteriumupptag.De större segmenten som täckte sekvensvariationsplatserna från beta IGA deduplicerades dock i betydligt större utsträckning än beta-IGB. BGE: s pH justeras enligt provets isoelektriska punkt för att förhindra proteinaggregering och underlätta separation samtidigt som komplexet bibehålls.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Chemistry

Unit 1

Principles of Mass Spectrometry

SCIENTISTS IN ACTION

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Analysera Protein Dynamics Använda Hydrogen Exchange masspektrometri

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Submillisecond Conformational Förändringar i Proteiner lösas genom fototermisk Beam Nedböjning

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

Visualisering av Ambient masspektrometri med användning av schlierenfotografering

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

En HS-MRM analysmetod för kvantifiering av värdcellen proteiner i Protein Biopharmaceuticals genom vätskekromatografi Ion rörlighet QTOF masspektrometri

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

Microprobe kapillärelektrofores Mass Spectrometry för Single-cell metabolomik i Live groda (Xenopus laevis) embryon

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometry

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometry

Karakterisering av syntetiska polymerer via Matrix assisterad Laser Desorption jonisering tid för flygning (MALDI-TOF) masspektrometri

There are many techniques that can be employed in the characterization of synthetic homopolymers, but few provide as useful of information for end group ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Storskaliga Top-down proteomik med kapillära zonen elektrofores Tandem Mass Spectrometry

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Hög genomströmning och omfattande drog övervakning med Multisegment injektion-kapillär elektrofores masspektrometri

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III))

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry CE-ICP-MS for Quantification of Iron Redox Species FeII, FeIII

Uppställning av kapillärelektrofores-induktivt kopplade plasma masspektrometri (CE-ICP-MS) för kvantifiering av järn redox arter (Fe(II), Fe(III))

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Kapillärelektrofores masspektrometri metoder för karakterisering av protein och metabolit korona förvärvas av nanomaterial

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...