Name: capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange for conformational characterization of proteins with top-down mass spectrometry
Uploaded: 2021-06-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry at JoVE.com

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (NSFC 21974069) gelen hibelerle desteklenmiştir. Yazarlar ayrıca Hücre Analizi Enstitüsü, Shenzhen Körfezi Laboratuvarı, Çin'den destek aldı; Jiangsu Biyomedikal Fonksiyonel Malzemeler İşbirlikçi İnovasyon Merkezi; ve Nanjing Normal Üniversitesi, Çin'deki Jiangsu Anahtar Biyomedikal Malzemeler Laboratuvarı.

NOT: MS analizine müdahale edebilecek kirleticileri en aza indirmek için mümkün olduğunca yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) sınıfı veya MS sınıfı reaktifler kullanın. Elektroforetik voltaj veya elektrosprey voltajının neden olduğu bir elektrik çarpması olasılığını önlemek için ölçüm sırasında CE-MS arayüzüne çıplak elle dokunmayın.
1. Malzeme hazırlama
<ol><li>CE için kaynaşmış silika kılcal damarın modifikasyonu<ol>
<li>HPC tozunu (m...

<ol>
	<li>Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+methods+in+characterization+of+the+higher+order+structure+of+protein+therapeutics.">Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169 (2020).</li><li>Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry.">Developments in hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 93 (1), 567-582 (2021).</li><li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformer-specific+hydrogen+exchange+analysis+of+Abeta(1-42)+oligomers+by+top-down+electron+capture+dissociation+mass+spectrometry.">Conformer-specific hydrogen exchange analysis of Abeta(1-42) oligomers by top-down electron capture dissociation mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 83 (13), 5386-5393 (2011).</li><li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+small+soluble+Abeta(1-40)+oligomers+studied+by+top-down+hydrogen+exchange+mass+spectrometry.">Structure and dynamics of small soluble Abeta(1-40) oligomers studied by top-down hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Biochemistry. 51 (17), 3694-3703 (2012).</li><li>Pan, J., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+structural+analysis+of+posttranslationally+modified+proteins+by+Fourier+transform+ion+cyclotron+resonance-MS+with+hydrogen/deuterium+exchange+and+electron+capture+dissociation.">Top-down structural analysis of posttranslationally modified proteins by Fourier transform ion cyclotron resonance-MS with hydrogen/deuterium exchange and electron capture dissociation.</a> Proteomics. 13 (6), 974-981 (2013).</li><li>Wang, G., Abzalimov, R. R., Bobst, C. E., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformer-specific+characterization+of+nonnative+protein+states+using+hydrogen+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Conformer-specific characterization of nonnative protein states using hydrogen exchange and top-down mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United. States of America. 110 (50), 20087-20092 (2013).</li><li>Mironov, G. G., Clouthier, C. M., Akbar, A., Keillor, J. W., Berezovski, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+enzyme+structure+and+activity+by+kinetic+capillary+electrophoresis-MS.">Simultaneous analysis of enzyme structure and activity by kinetic capillary electrophoresis-MS.</a> Nature Chemical Biology. 12 (11), 918-922 (2016).</li><li>Shen, Y., Zhao, X., Wang, G., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+hydrogen/deuterium+exchange+during+proteoform+separation+enables+characterization+of+conformational+differences+between+coexisting+protein+states.">Differential hydrogen/deuterium exchange during proteoform separation enables characterization of conformational differences between coexisting protein states.</a> Analytical Chemistry. 91 (6), 3805-3809 (2019).</li><li>Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invited+review:+&#946;-lactoglobulin:+binding+properties,+structure,+and+function.">Invited review: &#946;-lactoglobulin: binding properties, structure, and function.</a> Journal of Dairy Science. 87 (4), 785-796 (2004).</li><li>Qin, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+Tanford+transition+of+bovine+&#946;-lactoglobulin.">Structural basis of the Tanford transition of bovine &#946;-lactoglobulin.</a> Biochemistry. 37 (40), 14014-14023 (1998).</li><li>Qin, B. Y., Bewley, M. C., Creamer, L. K., Baker, E. N., Jameson, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+implications+of+structural+differences+between+variants+A+and+B+of+bovine+beta-lactoglobulin.">Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin.</a> Protein Science. 8 (1), 75-83 (1999).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+capillary+isoelectric+focusing+mass+spectrometry+analysis+of+peptides,+proteins,+and+monoclonal+antibodies+with+a+flow-through+microvial+interface.">High resolution capillary isoelectric focusing mass spectrometry analysis of peptides, proteins, and monoclonal antibodies with a flow-through microvial interface.</a> Analytical Chemistry. 90 (15), 9495-9503 (2018).</li><li>Busch, M. H. A., Kraak, J. C., Poppe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+acetate-coated+fused-silica+capillaries+for+the+separation+of+proteins+by+capillary+zone+electrophoresis.">Cellulose acetate-coated fused-silica capillaries for the separation of proteins by capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography A. 1695 (2), 287-296 (1995).</li><li>Zhao, X., Shen, Y., Tong, W., Wang, G., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deducing+disulfide+patterns+of+cysteine-rich+proteins+using+signature+fragments+produced+by+top-down+mass+spectrometry.">Deducing disulfide patterns of cysteine-rich proteins using signature fragments produced by top-down mass spectrometry.</a> Analyst. 143 (4), 817-823 (2018).</li><li>Sutera, S. P., Skalak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+Poiseuille's+law.">The history of Poiseuille's law.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 25 (1), 1-20 (1993).</li><li>Wang, G., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+characterization+of+the+higher+order+structure+of+disulfide-containing+proteins+using+hydrogen/deuterium+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).</li><li>Wang, G., Johnson, A. J., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+electrospray+ionization+mass+spectrometry+as+a+tool+for+characterization+of+small+soluble+protein+aggregates.">Evaluation of electrospray ionization mass spectrometry as a tool for characterization of small soluble protein aggregates.</a> Analytical Chemistry. 84 (3), 1718-1724 (2012).</li><li>Fellers, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProSight+Lite:+graphical+software+to+analyze+top-down+mass+spectrometry+data.">ProSight Lite: graphical software to analyze top-down mass spectrometry data.</a> Proteomics. 15 (7), 1235-1238 (2015).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MASH+Suite+Pro:+A+comprehensive+software+tool+for+top-down+proteomics.">MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 15 (2), 703-714 (2016).</li><li>Paterson, G. R., Hill, J. P., Otter, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+&#946;-lactoglobulin+A,+B+and+C+variants+of+bovine+whey+using+capillary+zone+electrophoresis.">Separation of &#946;-lactoglobulin A, B and C variants of bovine whey using capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography A. 700 (1), 105-110 (1995).</li><li>Wang, G., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+characterization+of+the+higher+order+structure+of+disulfide-containing+proteins+using+hydrogen/deuterium+exchange+and+top-down+mass+spectrometry.">Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).</li><li>Nicolardi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-line+electrochemical+reduction+of+disulfide+bonds:+improved+FTICR-CID+and+-ETD+coverage+of+oxytocin+and+hepcidin.">On-line electrochemical reduction of disulfide bonds: improved FTICR-CID and -ETD coverage of oxytocin and hepcidin.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (12), 1980-1987 (2013).</li><li>Adhikari, S., Xia, Y., McLuckey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+analysis+of+disulfide-linked+proteins+using+photoinduced+radical+reactions+and+ET-DDC.">Top-down analysis of disulfide-linked proteins using photoinduced radical reactions and ET-DDC.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 444, 116173 (2019).</li><li>Rush, M. J. P., Riley, N. M., Westphall, M. S., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+characterization+of+proteins+with+intact+disulfide+bonds+using+activated-ion+electron+transfer+dissociation.">Top-down characterization of proteins with intact disulfide bonds using activated-ion electron transfer dissociation.</a> Analytical Chemistry. 90 (15), 8946-8953 (2018).</li><li>Zhong, X., Maxwell, E. J., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transport+in+a+micro+flow-through+vial+of+a+junction-at-the-tip+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry+interface.">Mass transport in a micro flow-through vial of a junction-at-the-tip capillary electrophoresis-mass spectrometry interface.</a> Analytical Chemistry. 83 (12), 4916-4923 (2011).</li></ol>

CE kılcal damarının iç duvarının kaplanmasının amaçları, CE işlemi sırasında elektroozmotik akışın ve protein emiliminin en aza indirilmesini içerir13. Elektroozmotik akış, nötr veya zıt yüklü türleri dedektöre sürme kabiliyeti nedeniyle küçük moleküllerin geleneksel CE analizi için faydalı olsa da, benzer boyutlara ve çözeltideki net yüklere sahip protein türlerinin ayırma verimliliğini tehlikeye atar. Kılcal damarın HPC ile kaplanması, kılcal damarın i?...

Farklı konformasyonel, bağlanma veya modifikasyon durumlarındaki protein türlerini ayırt etmek ve yapısal farklılıklarını karakterize etmek, moleküler tanımadan enzimatik katalize kadar biyolojik olaylarda yer alan bu türler arasındaki geçiş yollarının izlenmesi ve bu olayların altında yatan mekanizmaların anlaşılması için önemlidir. Konvansiyonel biyofizik teknikler, yetersiz çözünürlük ve çözümdeki dinamik bilgi kaybı gibi sınırlamalar nedeniyle tam bir çözüm sağlamamaktadır. Kütle spektrometresi (HDX MS) ile birleştirilmiş hidrojen / döteryum değişimi, proteinlerin yapısal ve konformasyonel özelliklerini, proteinlerin kararsız hidrojen atomları ile kasıtlı olarak tanıtılan 2H 2 O çözeltisinden 2 H arasındaki değişim yoluyla döteryum (2H) ile etiketleyen bir tekniktir. Hidrojen bağında rol oynayan veya protein içindeki çözücüden ayrılan protonlar kolayca değiş tokuş yapmazlar1. Bu nedenle, değiştirilebilir bir bölgedeki döviz kuru, daha yüksek dereceli yapılara katılımına büyük ölçüde bağlı olduğundan, protein yapıları, 1H ile 2 H arasındaki farklı atomik kütlelere dayanarak 2H-alımının kapsamını ve oranını araştıran MS tarafından yüksek uzamsal çözünürlükte ortaya çıkarılabilir. Son yıllarda, HDX MS, protein konformasyonlarını ve dinamiklerini incelemek için olağanüstü başarılı bir teknik haline gelmiştir2.
HDX MS'in klasik aşağıdan yukarıya yaklaşımında, farklı konformasyonel, bağlanma veya modifikasyon durumlarındaki protein türlerinin topluluğu, bozulmamış protein seviyesinde ayrılmadan proteolizlenir ve bu da ortaya çıkan proteolitik fragmanları kıvrımlı döteryum içeriğine sahip analiz ederek bireysel türlerin karakterize edilmesini imkansız kılar. Buna karşılık, yukarıdan aşağıya yaklaşımda, farklı döteryum içeriğini içeren farklı protein durumları veya proteoformlar, bir MS taramasında bozulmamış protein kütlelerinin çoklu dağılımlarına yol açar. Bu, bireysel türlerin, uygun bir kütle filtresi (dörtlü kutup gibi) kullanılarak her kütle dağılımına karşılık gelen iyonların kütle seçimi ve sonraki tandem MS analizi 3,4,5,6'daki konformasyonel farklılıklarının karakterizasyonu ile ayrılmasını sağlar. Bununla birlikte, bu stratejide protein durumlarını veya proteoformları ayırmanın etkinliği, karşılık gelen kütle dağılımlarındaki farkın derecesi ile sınırlıdır.
Kapiler elektroforez (CE), protein türlerini çözelti fazındaki farklı yüklerine ve hidrodinamik boyutlarına göre yüksek verimlilikle ayırmak için bir araç sağlar7. CE'yi HDX ile birleştirmek, çözelti aşamasında protein durumlarının veya proteoformların ek olarak ayrılmasını sağlar. Ek olarak, CE kılcal damarının küçük hacmi, arka plan elektrolit çözeltisi (BGE), yani çalışan tampon olarak tamamen deuterated bir çözeltinin kullanılmasına izin verir ve kılcal damarı protein numuneleri için bir HDX reaktörü olarak oluşturur. Elektroforez işleminde proteinler ve protik reaktifler arasındaki elektroforetik hareketlilik farkı nedeniyle, CE sırasında HDX'in yürütülmesi, minimum kalıntı deuterated olmayan içeriğe sahip protein analitleri için neredeyse tam bir deuterasyon ortamı ile sonuçlanır, böylece HDX verilerini kullanarak yapısal analizin duyarlılığını arttırır. Bu nedenle, protein üst düzey yapılarını duruma veya proteoforma özgü bir şekilde karakterize etmek için yukarıdan aşağıya MS ile birlikte CE tabanlı bir diferansiyel HDX yaklaşımı geliştirdik8.
Bu yazıda, materyal hazırlama, deneysel prosedür ve veri analizi adımlarını detaylandırarak bu yaklaşım için protokoller açıklanmaktadır. Yöntem performansını veya veri kalitesini etkileyebilecek faktörler kısa notlarda listelenmiştir. Burada sunulan temsili sonuçlar, farklı proteinlerin karışımlarının diferansiyel HDX verilerini ve süt9'da bulunan başlıca peynir altı suyu proteini olan sığır β-laktoglobulinin (β-lg) doğal varyantlarını içerir. CE tabanlı HDX sırasında β-lg'nin iki bol varyantının, yani A ve B10,11'in ayırma verimliliğini, tekrarlanabilirliğini ve 2H-etiketleme performansını ve konformasyonlarının varyanta özgü karakterizasyonunu gösteriyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ammonium acetate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A/3446/50</td>
			<td>&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI 8000 plus capillary electrophoresis system</td>
			<td>Sciex, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5406000097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal filter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC201024</td>
			<td>10 kDa cutoff</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deuterium oxide</td>
			<td>Energy Chemical</td>
			<td>E090001</td>
			<td>99.9 % D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formic acid</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>&#160;270480250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fused silica glass capillary</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150017</td>
			<td>ID 50&#956;m, OD 360&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gas chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>GC6890N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydroxypropyl cellulose</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>H113415</td>
			<td>MW 100000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stirrers</td>
			<td>DLAB</td>
			<td>8030101212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A456-4</td>
			<td>MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microvolume UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>84677JK7731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myoglobin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td colspan="2">Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive UHMR mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium&#160;hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ubiquitin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U6253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasonicator</td>
			<td>SCIENTZ</td>
			<td>SB-5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-lactoglobulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L0130</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange for conformational characterization of proteins with top-down mass spectrometry

Çözelti içinde bir arada bulunan çoklu protein durumlarının konformasyonel heterojenliğinin çözülmesi, protein terapötiklerinin karakterizasyonunda ve moleküler tanımadan enzimatik katalize kadar biyolojik fonksiyonlar için kritik olan konformasyonel geçiş yollarının belirlenmesinde ana engellerden biri olmaya devam etmektedir. Hidrojen / döteryum değişimi (HDX) reaksiyonu, yukarıdan aşağıya kütle spektrometrik (MS) analizi ile birleştiğinde, protein yüksek dereceli yapıları ve dinamiklerini uygunlaştırıcıya özgü bir şekilde karakterize etmek için bir araç sağlar. Bu tekniğin konformasyonel çözme gücü, protein durumlarını bozulmamış protein seviyesinde ayırmanın ve HDX reaksiyonları sırasında deuterated olmayan protik içeriği en aza indirmenin verimliliğine büyük ölçüde bağlıdır. 
Burada, konformasyonel çözünürlüğü iyileştirmeyi amaçlayan HDX MS yaklaşımının kılcal elektroforez (CE) tabanlı bir varyantını tanımladık. Bu yaklaşımda, proteinler kılcal elektroforetik ayırma sırasında deuterated bir arka plan elektrolit çözeltisinden (BGE) geçerken HDX reaksiyonlarına uğrarlar. Çözeltide bir arada bulunan farklı protein durumları veya proteoformlar, farklı yük-boyut oranlarına göre verimli bir şekilde ayrılabilir. Proteinler ve protik çözücü molekülleri arasındaki elektroforetik hareketlilikteki fark, artık deuterated olmayan çözücüyü en aza indirir ve HDX işlemi sırasında neredeyse tam bir deuterasyon ortamı sağlar. Akışlı mikroflaköz CE-MS arayüzü, püskürtücünün çıkışındaki söndürme ve denatüre edici değiştirici çözelti ile hızlı bir karıştırmanın ardından salınan protein türlerinin verimli elektrosprey iyonizasyonuna izin verir. Çevrimiçi yukarıdan aşağıya MS analizi, salınımlı bozulmamış protein türlerinin küresel deuterasyon seviyesini ve daha sonra gaz fazı parçalarının deuterasyonunu ölçer. Bu yazıda, sütte bir arada bulunan doğal protein varyantları da dahil olmak üzere sistemler için diferansiyel HDX'te bu yaklaşım gösterilmektedir.

BGE'nin infüzyon basıncının değiştirilmesi, ayrılacak proteinlerin HDX reaksiyon süresine eşdeğer olan hem ayırma verimliliğinin hem de migrasyon süresinin ayarlanmasını sağlar (Şekil 3). Daha düşük bir infüzyon basıncı, deney süresi pahasına CE zirvelerinin daha iyi ayrılmasına neden olur (Şekil 3A). Daha uzun bir migrasyon / HDX reaksiyon süresi, protein analitlerinin daha yüksek düzeyde deuterasyonuna neden olur (<strong class="...

Watch this Scientific Journal Video about Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry at JoVE.com

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Burada, yukarıdan aşağıya kütle spektrometrisi ile birlikte kılcal elektroforez bazlı hidrojen / döteryum değişimi (HDX) yaklaşımı için bir protokol sunulmaktadır. Bu yaklaşım, eşzamanlı diferansiyel HDX ve elektroforetik ayırma gerçekleştirerek, farklı durumlardaki proteinler ve farklı proteoformlar da dahil olmak üzere farklı protein türleri arasındaki yüksek dereceli yapılardaki farkı karakterize eder.

Yukarıdan Aşağıya Kütle Spektrometrisi ile Proteinlerin Konformasyonel Karakterizasyonu için Kapiler Elektroforez Bazlı Hidrojen/Döteryum Değişimi

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Bu yöntem, farklı konformatörler veya varyantlar dahil olmak üzere birlikte var olan protein türlerinin ayrılmasını ve daha yüksek dereceli yapı farklılıklarının çevrimiçi karakterizasyonunun tek bir CEMS ölçümünde tamamlanmasını sağlar. HDX reaksiyonları için yaklaşık% 100 süreli bir ortam sağlamak için elektroforetik etkiyi ve yukarıdan aşağıya MS analizi için HDX sırasında birlikte var olan protein türlerinin ortogonal olarak ayrılmasını sağlar. Kılcal elektroforez, hidrojen döteryum değişimi veya CE HDX kurulumunun ön koşullandırılması ile başlayın.% 50 metanol,% 49 su ve% 1 formik asit karışımında ultrasonikasyon kullanarak, oda sıcaklığında en az 30 dakika boyunca mikroftek CE-MS arayüzünden akışı temizleyin. HPC modifiye kılcal damarı kılcal elektroferez veya CE aleti üzerine monte edin. Otomatik numune alma cihazını kullanarak kılcal damarı arka plan elektrolit çözeltisi veya BGE ile 10 dakika durulayın ve BGE ile dolu bırakın.Modifiye edici çözelti için infüzyon borusu olarak uygun uzunlukta değiştirilmemiş kaynaşmış silika kılcal boru kullanın. Modifiye edici boruyu künt bir sıcaklığa sahip gaz geçirmez bir cam şırıngaya bağlamak için bir birleştirici ve uygun manşon kullanın ve bir infüzyon pompası kullanarak tüpü değiştirici çözelti ile en az 10 dakika durulayın. İlgili çözeltilerle yüklenen HPC kodlu CE kılcal damar ve değiştirici borunun çıkışlarını temizlenmiş CE-MS arayüzüne yerleştirin.Şırıngayı infüzyon pompalarıyla ilerletin, böylece değiştirici çözelti arayüzün ucuna ulaşır. Birleştirilmiş CE-MS arayüzünü, bir kütle spektrometresinin nano elektron sprey iyonizasyon kaynağı muhafazasına monte edin. CE-MS arayüzüne 3-5 kilovoltluk bir püskürtme voltajı uygulayın.Değiştirici çözeltiyi demlik pompası ile dakikada 0,1-10 mikrolitre arasında değişen bir akış hızında demleyin ve CE-MS arayüzünün ucunda kararlı bir elektro sprey sağlayın. BGE ve otomatik numune alma işlemini içeren numune şişesini yerleştirin, bunlar daha sonra boş elektroferogramlar ve boş kütle spektrumları elde etmek için kullanılacaktır. Enjeksiyon hacmi ve enjeksiyon parametreleri arasındaki ilişkiyi kullanarak enjeksiyon hacmini tahmin edin.Ve iki PSI'daki otomatik örnekleyiciyi kullanarak numune çözeltisini uygun bir süre boyunca enjekte edin. CE ayrımını, 0-2 PSI arasında değişen bir infüzyon basıncına 20 kilovoltluk bir elektroforetik voltaj uygulayarak başlatın ve elektroferogramı edinin. Bu arada, MS verilerini, iyon akım grafiğinin zamanın bir fonksiyonu olarak alındığı ve karşılık gelen MS taramalarının otomatik olarak tek bir spektrumda birleştirilmediği kromatografik modda elde edin.Boş elektroferogramı ve kütle spektrumlarını referans olarak kaydedin. Protein numune çözeltilerinin istenen konsantrasyonlarını içeren numune şişelerini otomatik numune alma cihazına yerleştirin ve elektroforetik olarak ayrılmış ve döteryum etiketli protein türlerinin elektroferogramlarını ve MS1 spektrumlarını elde edin. MS1 spektrumlarını aynı çalıştırmada edindikten sonra veya sonraki ayrı bir çalıştırmada ilgilenilen türler için tandem Ms.ölçümleri gerçekleştirin.Her ölçümden sonra, kılcal damarı BGE ile en az 10 dakika boyunca 20 PSI basınçta yıkayın. Deneylerin tamamlanmasının ardından CEMS arayüzünü ve tüm boruları depolama için temizleyin. Doğrudan infüzyon modunda MS ile HDX uç nokta örneğinin bir veri kümesini edinin.Düşük infüzyon basıncı, CE zirvelerinin daha iyi ayrılmasına neden oldu, ancak hem göç süresinde hem de deneyin süresinde bir artışa neden oldu. Daha uzun bir HDX reaksiyon süresi, protein analitlerinin daha yüksek düzeyde dedurmasına neden oldu. Beta immünoglobulin veya beta IG'nin A ve B varyansı, dizilimlerinde sadece iki amino asit kalıntısı ile farklılık gösterir, EIC türevi elektroferogramda yeterince ayrılmış iki pike yol açmıştır.Diferansiyel döteryum etiketli varyans, iyonların farklı bir kütle dağılımı ile sonuçlandı. CS 82 ve CS 176 arasındaki parçalanma verimliliğini sınırlayan beta IG'nin doğrulanmasındaki benzersiz disofied bağlantı nedeniyle Z iyonlarının göreceli bolluğunda C iyonlarından daha düşük bir sayı gözlenmiştir. Beta IGA ve beta IGB'den üretilen fragman iyonlarının çoğu, benzer miktarda döteryum alımı sergiler.Bununla birlikte, beta IGA'dan dizi varyasyon bölgelerini kapsayan daha büyük segmentler, beta IGB'den önemli ölçüde daha fazla çıkarılmıştır. BGE'nin pH'ı, protein birikimini önlemek ve kompleksi korurken ayırmayı kolaylaştırmak için numunenin izoelektrik noktasına göre ayarlanır.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Chemistry

Unit 1

Principles of Mass Spectrometry

SCIENTISTS IN ACTION

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Hidrojen Değişim Kütle Spektrometre Kullanarak Protein Dinamiği Analizi

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Fototermal Işın Sapmasına tarafından Çözülmüş Proteinler Submillisecond Konformasyonel değişiklikler

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

Schlieren Fotoğraf Kullanımına Ortam kütle spektrometresi görselleştirme

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

Bir HS-MRM tahlil için Protein Biyofarmasötikler sıvı Kromatografi iyon hareketlilik QTOF kütle spektrometresi tarafından Host-hücre proteinleri miktar

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

Microprobe kılcal Elektroforez kütle spektrometresi canlı Kurbağa (Xenopus laevis) embriyo tek hücreli Metabolomics için

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometry

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometry

Matris ile sentetik polimerler karakterizasyonu Lazer Desorpsiyon iyonlaşma zaman uçuş (MALDI-TOF) kütle spektrometresi destekli

There are many techniques that can be employed in the characterization of synthetic homopolymers, but few provide as useful of information for end group ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Büyük ölçekli tepeden proteomik kılcal bölge Elektroforez Tandem kütle spektrometresi kullanılarak

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Multisegment enjeksiyon-kılcal Elektroforez kütle spektrometresi kullanılarak yüksek üretilen iş ve kapsamlı uyuşturucu gözetim

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III))

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry CE-ICP-MS for Quantification of Iron Redox Species FeII, FeIII

Demir Redoks Türlerinin Nicelleştirilmesi İçin Kapiller Elektroforez-Endüktif Birleştirilmiş Plazma Kütle Spektrometresi (CE-ICP-MS) Kurulumu (Fe(II), Fe(III))

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Nanomalzemeler Tarafından Elde Edilen Protein ve Metabolit Koronanın Karakterizasyonu için Kılcal Elektroforez Kütle Spektrometresi Yaklaşımları

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...