1.9K Views
•
09:14 min
•
September 27th, 2021
DOI :
September 27th, 2021
•0:05
Introduction
0:53
Determination of Dorsal D (DD) Dendritic Spines Structure
2:44
Assessing Activation of DD Dendritic Spines by Presynaptic Cholinergic Signaling
7:06
Results: Imaging and Assessing the Function of DD Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans
8:37
Conclusion
Transcript
Denne protokol beskriver metoder til visualisering af dendritiske rygsøjlemorfologier og calciumtransienter i C.elegans neuroner. Vores tilgang bør lette genetiske tilgange til at opdage determinanter for en rygsøjlemorfogenese og funktion. Vores protokol indeholder dendritiske rygsøjler i GABAergic neuroner.
Rygsøjler i andre klasser af C.elegans neuroner kan også undersøges med disse metoder. Vores protokol beskriver metoder til immobilisering af levende C.elegans. Det er især vigtigt at forhindre dyrebevægelse under billedoptagelse og at vælge de rigtige laserkonfigurationer til at ophidse og registrere neuronal aktivitet.
For at erhverve billeder i høj opløsning skal du tilføje tre mikroliter bedøvelsesopløsning og fylde 15 til 20 unge voksne orme på 10% agarosepuder. Påfør derefter dækslippen for at immobilisere ormene, og forsegl dækslipkanterne med en smeltet klæbemiddelblanding. For en superopløsningsoptagelse skal du bruge et laserscanningskonfokalmikroskop udstyret med superopløsningsmikroskopi.
Anskaf Z-stakke ved hjælp af den trinstørrelse, der anbefales af producentens software. Saml en række optiske sektioner, der spænder over det samlede volumen af Dorsal D- eller DD-ventralprocessen. Indsend Z-stacks til billedbehandling ved hjælp af producentens software, og analyser billeder med en score højere end syv.
Til Nyquist-erhvervelse skal du bruge et laserscanningskonfokalt mikroskop og vælge den optimale pixelstørrelse for bølgelængden af lys og numerisk blænde på objektivobjektivet. Indsend derefter stakken til 3D-dekonvolution ved hjælp af en automatisk algoritme. Til billedanalyse skal du bruge en passende billedbehandlingssoftware til at skabe maksimale intensitetsprojektioner af Z-stakke.
Og manuelt tælle fremspringene på DD-dendritten. Bestem derefter længden af den scorede DD-dendrit for at beregne tætheden af rygsøjler pr. 10 mikrometer DD-dendrit. Klassificer derefter rygsøjlerne som tynde eller svampe, filopodiale, stubbe eller forgrenede.
Ved hjælp af konventionelle teknikker som mikroinjektion skal du oprette transgene orme, der udtrykker calciumsensoren GCaMP i DD-neuroner, og Chrimson, en rødforskudt kanal rhodopsin i presynaptiske VA-neuroner. Derefter skal du under en laminær hætte forberede alle trans-retinale eller ATR-plader ved at tilføje 300 mikroliter op50-bakteriekultur natten over og 0,25 mikroliter ATR til hver 60 millimeter nematodevækstmedium næringsagarplade. Spred derefter kulturen med en steril glasstang.
Til kontrolplader tilsættes 300 mikroliter OP50-bakterier og 0,25 mikroliter ethanol. For at tillade bakterievækst inkuberes pladerne ved stuetemperatur i 24 timer, beskyttet mod omgivende lys. For at oprette eksperimentet skal du placere fem L4-trinlarver på OP50-frøet ATR eller kontrolplader og inkubere pladerne i mørket ved 23 grader Celsius.
Efter tre dage skal du bruge et stereodissekerende mikroskop til at bekræfte vulva-udviklingen og vælge L4-trins afkom fra ATR og kontrolplader til billeddannelse. Placer derefter to mikroliter 0,05 mikrometer polyperler på et mikroskopglas. Og læg ca. 10 L4 larver i opløsningen.
Brug en platintråd til at tilføje en lille kugle superlim til opløsningen. Hvirvl opløsningen forsigtigt for at generere trådformede tråde af lim. Tilsæt derefter tre mikroliter M9-buffer.
Påfør derefter en dækslip og forsegl kanterne som vist tidligere. For at registrere fremkaldte calciumtransienter i dendritiske rygsøjler skal du bruge et roterende diskkonfokalmikroskop og justere mikroskoptrinnet for at placere DD-rygsøjlerne i brændplanet. Indstil derefter time-lapse-erhvervelse for at belyse prøven med en 488 nanometer laserlinje i hver ramme til detektering af GCaMP-fluorescens og en 561 nanometer laserlinje med periodiske intervaller til Chrimson-excitation.
Til in vivo calciumbilleddannelse skal du bruge 2D-dekonvolution og billedjustering til at korrigere mindre afvigelser fra ormens bevægelse under erhvervelsen. Definer derefter DD dendritisk rygsøjle som interesseområde eller ROI. Dupliker ROI og flyt til en naboregion inde i ormen for at indsamle baggrundssignalet.
Brug derefter passende software til at eksportere GFP-intensiteterne til Excel for hvert tidspunkt, og træk baggrundsfluorescens fra rygsøjlens ROI-fluorescens. Bestem ændringen i fluorescens ved at trække GFP-fluorescensen i rammen umiddelbart før 561 nanometer excitation eller ved nul fra hvert tidspunkt efter excitation eller Delta F.divider derefter med F nul for at bestemme Delta F over F nul. Og graf de normaliserede spor.
Først skal du afgøre, om dataene normalt distribueres ved hjælp af en Shapiro-Wilk-test. For data, der normalt ikke distribueres, skal du bruge en ikke-parametrisk ANOVA med post-hoc-korrektion til flere test. Alternativt kan du til målinger, der viser normal eller gaussisk fordeling, udføre en parret parametrisk ANOVA-test for hver måling af GCaMP-fluorescens før og efter hver 561 nanometer puls.
Og korriger for flere sammenligninger i hver af de to grupper. Mærkning af DD dendritiske rygsøjler med tre uafhængige markører, cytosolisk mCherry, MYR: mRuby og LifeAct: GFP gav en gennemsnitlig tæthed på 3,4 DD dendritiske rygsøjler pr. 10 mikron DD-dendrit hos vilde unge voksne. GFP: Utrophin-markøren blev udelukket fra denne analyse, fordi den gav en signifikant lavere rygsøjletæthed, potentielt på grund af interaktioner mellem utrophin og actincytoskelettet, der driver rygsøjlemorfogenese.
Den levende cellebilleddannelsesmetode bekræftede, at DD-rygsøjlernes tynde svampeformede morfologi dominerer hos voksne sammenlignet med alternative rygformer som filopodial, stubby og forgrenet. Aktivering af DD dendritiske rygsøjler blev vurderet ved presynaptisk kolinerg signalering i transgene orme, der udtrykker GCaMP i DD-neuroner og Chrimson i præsynaptiske VA-neuroner. Forbigående udbrud af GCaMP-signal blev detekteret i DD-rygsøjler umiddelbart efter optogenetisk aktivering af Chrimson i presynaptiske VA-neuroner.
Et kontroleksperiment i fravær af ATR bekræftede, at målingen til GCaMP-signal afhænger af den optogenetiske aktivering af Chrimson, som er strengt ATR-afhængig. For at visualisere DD-rygsøjler er det bedst at forestille sig dyr, der ligger på deres side, såsom rygsøjlerne, der stikker ud, vinkelret på lysstien. Med denne metode kan forskere også bruge farmakologiske manipulationer til at forstå de mekanismer, der driver calciumtransienter i DD-rygsøjler.
Dendritiske rygsøjler er vigtige cellulære træk i nervesystemet. Her beskrives levende billeddannelsesmetoder til vurdering af strukturen og funktionen af dendritiske rygsøjler i C. elegans. Disse tilgange understøtter udviklingen af mutante skærme for gener, der definerer dendritisk rygsøjleform eller funktion.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved