이 프로토콜은 C.elegans 뉴런에서 수지상 척추 형태와 칼슘 과도 현상을 시각화하는 방법을 설명합니다. 우리의 접근 방식은 척추 형태 형성 및 기능의 결정 요인을 발견하기 위한 유전적 접근을 촉진해야 합니다. 우리의 프로토콜은 GABA 성 뉴런의 수지상 척추를 특징으로합니다.
다른 종류의 C.elegans 뉴런의 가시도 이러한 방법으로 조사 할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 살아있는 C.elegans를 고정시키는 방법을 설명합니다. 이미지 획득 중 동물의 움직임을 방지하고 신경 활동을 자극하고 기록하는 데 적합한 레이저 구성을 선택하는 것이 특히 중요합니다.
고해상도 이미지를 얻으려면 3 마이크로 리터의 마취액을 추가하고 10 % 아가 로스 패드에 15-20 개의 젊은 성인 벌레를 양을하십시오. 그런 다음 커버 슬립을 적용하여 웜을 고정시키고 커버 슬립 가장자리를 녹인 접착 실란트 혼합물로 밀봉하십시오. 초고해상도 획득의 경우 초고해상도 현미경이 장착된 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하십시오.
제조업체의 소프트웨어에서 권장하는 단계 크기를 사용하여 Z 스택을 획득합니다. 등쪽 D 또는 DD 복부 과정의 전체 부피에 걸쳐 있는 일련의 광학 섹션을 수집합니다. 제조업체의 소프트웨어를 사용하여 이미지 처리를 위해 Z 스택을 제출하고 7점 이상의 점수로 이미지를 분석합니다.
나이퀴스트 획득의 경우 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하고 빛의 파장과 대물 렌즈의 개구수에 대한 최적의 픽셀 크기를 선택합니다. 그런 다음 자동 알고리즘을 사용하여 3D 디콘볼루션을 위해 스택을 제출합니다. 이미지 분석의 경우 적절한 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 Z 스택의 최대 강도 투영을 만듭니다.
그리고 DD 수상 돌기의 돌출부를 수동으로 계산합니다. 이어서 스코어링된 DD 수상돌기의 길이를 결정하여 DD 수상돌기의 10 마이크로미터당 가시의 밀도를 계산한다. 그런 다음 등뼈를 얇거나 버섯, 필로 포디얼, 뭉툭하거나 가지로 분류하십시오.
미세 주입과 같은 기존 기술을 사용하여 DD 뉴런에서 칼슘 센서 GCaMP를 발현하는 형질전환 웜과 시냅스 전 VA 뉴런에서 적색 이동 채널 로돕신인 크림슨을 만듭니다. 다음으로, 층류 후드 아래에서 300 마이크로 리터의 하룻밤 성장 OP50 박테리아 배양 및 0.25 마이크로 리터의 ATR을 각 60 밀리미터 선충 성장 배지 영양 한천 플레이트에 추가하여 모든 트랜스 망막 또는 ATR 플레이트를 준비합니다. 그런 다음 멸균 유리 막대로 배양 물을 퍼뜨립니다.
대조군 플레이트의 경우 300마이크로리터의 OP50 박테리아와 0.25마이크로리터의 에탄올을 추가합니다. 박테리아 성장을 허용하려면 플레이트를 실온에서 24 시간 동안 배양하여 주변 광으로부터 보호하십시오. 실험을 설정하려면 5 개의 L4 단계 유충을 OP50 시드 ATR 또는 대조군 플레이트에 놓고 섭씨 23 도의 어둠 속에서 플레이트를 배양합니다.
3일 후 실체 해부 현미경을 사용하여 외음부 발달을 확인하고 ATR 및 대조군 플레이트에서 L4 단계 자손을 선택하여 이미징합니다. 다음으로, 현미경 슬라이드에 0.05 마이크로 미터 폴리 비드 2 마이크로 리터를 놓습니다. 그리고 약 10 개의 L4 유충을 용액에 넣으십시오.
백금 와이어를 사용하여 용액에 작은 슈퍼 접착제 덩어리를 추가하십시오. 용액을 부드럽게 소용돌이 치면 필라멘트 같은 접착제 가닥이 생성됩니다. 그런 다음 3 마이크로 리터의 M9 버퍼를 추가하십시오.
그런 다음 커버 슬립을 적용하고 앞에서 설명한 대로 가장자리를 밀봉합니다. 수지상 가시에서 유발된 칼슘 과도 현상을 기록하려면 회전 디스크 컨포칼 현미경을 사용하고 현미경 스테이지를 조정하여 초점면에 DD 가시를 배치합니다. 그런 다음 타임랩스 획득을 설정하여 GCaMP 형광을 검출하기 위해 모든 프레임에서 488나노미터 레이저 라인으로 샘플을 비추고 Chrimson 여기를 위해 주기적인 간격으로 561나노미터 레이저 라인을 설정합니다.
생체 내 칼슘 이미징의 경우 2D 디콘볼루션 및 이미지 정렬을 사용하여 획득 중 웜 움직임의 사소한 편차를 수정합니다. 그런 다음 DD 수지상 척추를 관심 영역 또는 ROI로 정의합니다. ROI를 복제하고 웜 내부의 인접 영역으로 재배치하여 백그라운드 신호를 수집합니다.
그런 다음 적절한 소프트웨어를 사용하여 각 시점에 대해 GFP 강도를 Excel로 내보내고 척추 ROI 형광에서 배경 형광을 뺍니다. 여기 직전 또는 여기 또는 델타 F 후 각 시점에서 0에서 프레임에서 GFP 형광을 빼서 형광의 변화를 결정하고, 그런 다음 F0으로 나누어 F0에 대한 델타 F를 결정합니다. 그리고 정규화 된 트레이스를 그래프로 표시합니다.
먼저 Shapiro-Wilk 검정을 사용하여 데이터가 정규 분포를 따르는지 확인합니다. 정규 분포를 따르지 않는 데이터의 경우 여러 검정을 위해 사후 수정이 있는 비모수 분산 분석을 사용합니다. 또는 정규 또는 가우스 분포를 나타내는 측정의 경우 각 561나노미터 펄스 전후의 GCaMP 형광 측정에 대해 쌍을 이루는 파라메트릭 분산 분석 테스트를 수행합니다.
그리고 두 그룹 각각에서 다중 비교를 수정합니다. 3개의 독립적인 마커인 세포질 mCherry, MYR:mRuby 및 LifeAct:GFP로 DD 수지상 가시를 표지한 결과 야생형 젊은 성인에서 DD 수상돌기 10미크론당 평균 밀도가 3.4DD 수지상 가시를 산출했습니다. GFP:Utrophin 마커는 잠재적으로 척추 형태 형성을 유도하는 액틴 세포 골격과 유트로핀의 상호 작용으로 인해 상당히 낮은 척추 밀도를 산출했기 때문에 이 분석에서 제외되었습니다.
라이브 셀 이미징 접근법은 DD 가시의 얇은 버섯 모양의 형태가 필로 포디알, 뭉툭한 및 가지와 같은 대체 척추 모양과 비교하여 성인에서 우세하다는 것을 확인했습니다. DD 수지상 척추의 활성화는 DD 뉴런에서 GCaMP를 발현하는 형질전환 웜에서의 시냅스 전 콜린성 신호전달 및 시냅스전 VA 뉴런에서 크림슨에 의해 평가되었다. GCaMP 신호의 일시적인 파열은 시냅스 전 VA 뉴런에서 크림슨의 광유전학적 활성화 직후 DD 척추에서 검출되었습니다.
ATR이 없는 대조군 실험에서 GCaMP 신호에 대한 측정은 엄격하게 ATR에 의존하는 Chrimson의 광유전학적 활성화에 의존한다는 것이 확인되었습니다. DD 가시를 시각화하려면 튀어나온 가시가 빛 경로에 직각을 이루는 등 옆으로 누워 있는 동물을 이미지화하는 것이 가장 좋습니다. 이 방법을 통해 과학자들은 DD 척추에서 칼슘 과도 현상을 유도하는 메커니즘을 이해하기 위해 약리학 적 조작을 사용할 수도 있습니다.
