6.2K Views
•
08:57 min
•
July 16th, 2021
DOI :
July 16th, 2021
•0:05
Introduction
0:49
Astrocyte Isolation and Culture
2:06
Astrocytes-laden Gelatin/GelMA/Fibrinogen Bioink Preparation
4:01
Bioprinting Syringe Preparation and Bioprinting
4:58
Bioprinted Construct and Culture Crosslinking
5:40
Astrocytes Viability Assessment
6:22
Results: 3D Bioprinted Astrocyte Cell Viability and Morphology Assessment
8:15
Conclusion
Transcript
3D-bioprinting van astrocyten vertegenwoordigt een vooruitgang in neuro tissue engineering, waardoor de biofabricage van in vitro modellen mogelijk is die nuttig zijn om de mechanismen te begrijpen die betrokken zijn bij neurologische aandoeningen. Het belangrijkste voordeel van 3D-bioprinting is het biofabriceren van cel-adjunctstructuren die de biochemische en mechanische kenmerken van de weefsels nabootsen, waardoor een beter begrip van de celdynamiek in gezondheid en ziekte wordt geboden. Dit protocol kan worden toegepast op de biofabricage van andere zachte weefsels, omdat het is gebaseerd op de 3D-bioprinting van een bio-inkt bestaande uit natuurlijke polymeren en extracellulaire matrixcomponenten.
Knip om te beginnen het corticale weefsel geïsoleerd van de geëuthanaseerde muis in kleine stukjes met een gebogen microschaar. Was de stukjes weefsel driemaal met één milliliter HBSS door op en neer te pipetteren. Voeg na het verwijderen van HBSS toegevoegd voor de derde keer, voeg een milliliter van 0,05% trypsine toe en incubaleer het weefsel gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius.
Voor mechanische weefseldissociatie pipetteer je het weefsel trypsinemengsel 15 keer op en neer. Breng vervolgens het gedissocieerde mengsel over naar een conische buis van 15 milliliter en voeg een gelijk volume FBS toe om de trypsine-activiteit te neutraliseren. Filter de suspensie door een celzeeffilter van 0,4 micrometer om niet-gedissocieerde fragmenten te verwijderen.
Was het filter met één milliliter astrocytenmedium. Pellet de gefilterde celsuspensie door centrifugeren. Na het weggooien van het supernatant, suspenseert u de celkorrel in één milliliter astrocytenkweekmedium.
Breng de celsuspensie over in een T25-kweekkolf. Maak een totaal gemiddeld volume van 3,5 milliliter en incubeer de cellen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Breng voor het verkrijgen van het fibrinogeen in de eindconcentratie van drie milligram per milliliter 0,9 milliliter fibrinogeenoplossing per milliliter over op de gelatine-gelatinemethacryloyloplossing.
Om de foto-initiator te verkrijgen bij de uiteindelijke concentratie van 0,5 volumeprocent, voegt u 0,015 g foto-initiator toe aan de bereide gelatine-gelatine methacryloyl fibrinogeenoplossing. Houd de oplossing na het vortexen op 40 graden Celsius, beschermd tegen licht om PI-degradatie te voorkomen. Filter vervolgens de oplossing door een filter van 0,2 micrometer in een steriele conische buis van 15 milliliter.
Breng 980 microliter van de biomateriaaloplossing over in een conische buis van 15 milliliter. Voor het verkrijgen van het laminine in de eindconcentratie van twee microgram per milliliter, voegt u 20 microliter verdund laminine toe aan de buis met bio-inkt. Meng voorzichtig door op en neer te pipetteren, vermijd bubbels en houd de bio-inktoplossing op 37 graden Celsius totdat deze klaar is om met de cellen te worden gemengd.
Trypsinize de primaire astrocyten met 0,05% trypsine gedurende 5 minuten en neutraliseer de trypsine-activiteit met FPS in een verhouding van één op één. Breng vervolgens de cellen over naar een conische buis van 15 milliliter en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 200 maal G. Breng na het tellen van de cellen 1 keer 10 over naar de 6 cellen naar een andere conische buis en centrifuge zoals aangetoond.
Laat slechts 200 microliter van het supernatant in de buis en hang de celkorrel op door zachtjes op de bodem van de conische buis te tikken. Om een eindconcentratie van 1 maal 10 tot de 6 cellen per milliliter te verkrijgen, brengt u één milliliter gelatine-methacryloylfibrinogeenoplossing over naar de buis met de cellen en homogeniseert u door voorzichtig op en neer te pipetteren. Gebruik een pipet van 1000 microliter om de astrocyten die in gelatine-gelatine methacryloyl fibrinogeen bio-inktoplossing zijn gelegd langzaam over te brengen naar een plastic spuit van vijf milliliter, waardoor bubbelvorming wordt voorkomen.
Sluit een steriele 22 gauge stompe naald aan op de spuit. Stel de bioprinter gedurende 15 minuten bloot aan UV-licht en veeg de bioprinter vervolgens af met 70% ethanol, sluit de spuit vervolgens aan op de bioprinterprintkop en spoel de bio-inkt handmatig door om de resterende belletjes te verwijderen. Om bioprinting uit te voeren, plaatst u de kweekschaal van 35 millimeter op de bioprintertafel, plaatst u de naald op 0,1 millimeter afstand van het oppervlak van de kweekschaal om beweging van de naald mogelijk te maken en drukt u op de knop Afdrukken.
Zodra de bioprinting voorbij is, zorg er dan voor dat de spuit weggaat van de schotel en sluit de kweekschaal. Plaats de kweekschaal onder UV-licht voor gelatine methacryloyl cross-linking. Gebruik een steriele spatel om de biobedrukte constructie over te brengen op een plaat met 24 putten.
Voeg 500 microliter trombinecalciumchlorideoplossing toe en laat 30 minuten staan om fibrineverknoping mogelijk te maken. Na het verwijderen van de cross-linking-oplossing, wast u het construct met twee milliliter PBS en vervangt u de PBS door één milliliter astrocytencultuurmedium. Incubeer bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide en ververs het medium om de drie dagen.
Gebruik een spatel om de biobedrukte constructie over te brengen naar een kweekschaal van 35 millimeter. Was de constructie met één milliliter PBS. Deponeer 100 microliter van het levende dode reagens over het construct en houd het gedurende 30 minuten op 37 graden Celsius, waardoor het beschermd blijft tegen licht.
Na het verwijderen van het levende dode reagens, wast u het construct met PBS zoals gedemonstreerd. Breng het monster over naar een confocale schaal en observeer de cellen in het construct onder een confocale microscoop met behulp van 488 en 570 nanometer excitatie voor beeldverkheersing. Na 3D-bioprinting werd de integriteit van de biogeprinte steiger geschat en werd de vorming van een goed gedefinieerde structuur waargenomen met cellen die in het biomateriaal waren ingesloten.
Na bioprinting en cross-linking processen presenteerden de meeste cellen ronde morfologie wanneer het construct werd geïncubeerd met een astrocytenmedium. De biogeprinte steigers behielden de integriteit na zeven dagen incubatie, en hoewel sommige ronde cellen werden waargenomen, verspreidden veel astrocyten zich door het hele construct en presenteerden astrocytische morfologie en interconnectie. De levensvatbaarheid van de cel werd direct na bioprinting geëvalueerd en de resultaten toonden aan dat levensvatbare cellen bij de lagere snelheid tot 74% van de totale cellen vertegenwoordigden, significant hoger dan cellen die met hogere snelheid werden gebioprint.
De levensvatbaarheid van biogeprinte astrocyten werd genormaliseerd tot 2D-gekweekte astrocyten en de resultaten gaven aan dat op de zevende dag de biogeprinte astrocyten de levensvatbaarheid aanzienlijk hadden verhoogd. Direct na de bioprinting toonden de astrocyten ronde morfologie en levende dode assay. Na een week verspreidden de astrocyten zich door het construct en presenteerden een duidelijke morfologie van cellen, identiek aan 2D-cultuur.
De 3D-biogeprinte astrocyten werden gekenmerkt door immunofluorescentie. Na zeven dagen incubatie in het biogeprinte construct werden zeer dichte astrocyten met een sterachtige morfologie waargenomen. De biogeprinte astrocytencellen drukten de specifieke astrocytenmarker glijmiddel fibrillair zuur eiwit uit, wat duidt op behoud van astrocytisch fenotype na zeven dagen bioprinting, en deze resultaten geven aan dat de bio-inktsamenstelling een biocompatibele micro-omgeving bood om de hechting, verspreiding en groei van astrocyten te bevorderen.
De evaluatie van specifieke genen en celmarkersexpressie door de biogeprinte astrocyten zou bewijs leveren van de neuroweefselachtige functie, zoals de astrocytaire reactiviteit na specifieke stimuli. Dit protocol maakt de weg vrij voor de biofabricage van complexere neuro-achtige structuren die zijn samengesteld uit verschillende soorten cellen in biomoleculen, waardoor specifieke neurogene niches kunnen worden nagebootst.
Hier rapporteren we een methode van 3D bioprinting van muriene corticale astrocyten voor het biofabriceren van neurale weefsels om de functionaliteit van astrocyten in het centrale zenuwstelsel en de mechanismen met betrekking tot gliacellen bij neurologische ziekten en behandelingen te bestuderen.
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved