La RMN quantitative du phosphore représente l’une des percées les plus importantes en chimie analytique de la lignine et du tanin au cours des trois dernières décennies. Cette technique offre des informations rapides, fiables et quantitatives pour les différents groupes hydroxy de l’échantillon. Ces méthodes de RMN ont une valeur énorme pour comprendre la structure des lignanes et des tanins.
Il a également été appliqué à une variété d’autres systèmes qui ont des groupes hydroxyles réactifs. Commencez par prétraiter 100 milligrammes de l’échantillon de lignine ou de tanin en séchant pendant la nuit dans un four à vide à 40 degrés Celsius. Après séchage, transférer rapidement l’échantillon dans un dessiccateur de sulfate de calcium anhydre jusqu’à ce qu’il atteigne la température ambiante.
Pour préparer l’échantillon à la spectroscopie RMN, peser avec précision environ 30 milligrammes de l’échantillon dans un flacon de deux millilitres équipé d’une barre d’agitation. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de la solution de solvant fraîchement préparée au flacon d’échantillon et scellez le flacon avec un bouchon. À l’aide d’une micropipette, ajouter 100 microlitres de la solution étalon interne au flacon d’échantillon, puis agiter magnétiquement la dispersion résultante à 500 rotations par minute.
Lorsque l’échantillon est complètement dissous, transférer 100 microlitres de tétraméthyldioxyphospholane ou de TMDP dans la solution de l’échantillon tout en travaillant sous le capot et sceller la solution de l’échantillon avant de placer l’échantillon pour une agitation magnétique vigoureuse. À ce stade, la réaction indiquée se produit sur les échantillons de lignine et de tanin. À l’aide d’une pipette Pasteur, transférer la solution d’échantillon dans un tube RMN pour l’analyse.
Si un précipité jaune est observé dans l’échantillon, répétez la procédure en vous assurant d’éviter toute contamination par l’humidité possible. Chargez le tube d’échantillonnage dans l’instrument RMN équipé d’une sonde à large bande et définissez les paramètres expérimentaux. En utilisant la fréquence de résonance du chloroforme deutéré, réglez la fréquence dans le spectromètre.
Calez l’échantillon et réglez le spectromètre avant de commencer l’acquisition. Commencez à traiter les données brutes de la spectroscopie RMN P31 en effectuant une transformation de Fourier. Ajustez phase par correction de phase manuelle en développant l’onglet de traitement et en sélectionnant correction de phase et correction manuelle.
Corrigez manuellement la ligne de base en définissant soigneusement les points zéro après avoir cliqué sur traitement et sélectionné la correction de la ligne de base et de la ligne de base multi-points. Pour l’étalonnage du signal, réglez le signal pour l’eau phosphorylée à la valeur de décalage chimique de 132,2 parties par million en ouvrant l’onglet d’analyse, puis sélectionnez la référence dans l’onglet de référence. Pour l’intégration du signal, ouvrez l’intégrale dans le menu d’analyse.
Pour normaliser l’intégration, définissez la norme interne sur 1.0 en cliquant sur le pic pour sélectionner modifier l’intégrale et entrez la valeur 1.00 dans l’onglet normalisé, puis effectuez l’intégration du spectre en fonction des décalages chimiques rapportés dans le manuscrit. Utilisez l’équation pour calculer la concentration molaire de la solution étalon interne, ou IS, et utilisez la valeur calculée pour estimer la quantité équivalente du signal spécifique par gramme de l’échantillon. La quantification du spectre de divers groupes hydroxy dans une lignine artisanale de résineux dérivée du TMDP a été enregistrée à l’aide d’un spectromètre RMN de 300 mégahertz et 700 mégahertz.
Dans les spectres RMN, des pics forts et forts ont été détectés à 144 et 132 PPM en raison de l’étalon interne et de l’hydroxylation du TMD respectivement. Les différents signaux des groupes hydroxy étaient évidents dans tous les spectres RMN quantitatifs P31 des lignines. Dans un spectre RMN P31 quantitatif d’un échantillon de tanin dérivé à l’aide de TMDP, un signal caractéristique des différentes unités aliphatiques OH pyrogallol et catéchol était bien visible.
La comparaison entre le spectre RMN de la lignine avant et la post-oxydation a été enregistrée à l’aide d’un spectromètre RMN de 300 mégahertz montrant la réduction de l’intensité des pics des groupes hydroxy. Les étapes cruciales sont celles relatives au séchage et à la pondération de l’échantillon et aux paramètres de traitement RMN à utiliser. Et surtout, le phasage des spectres obtenus.
Lorsque cette méthode est couplée à la RMN bidimensionnelle et à la chromatographie par perméation sur gel, une image très détaillée des polyphénols naturels peut émerger, offrant des informations structurelles sans précédent et de nouvelles perspectives.
