मात्रात्मक फास्फोरस एनएमआर पिछले तीन दशकों के दौरान लिग्निन और टैनिन विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान में सबसे महत्वपूर्ण सफलताओं में से एक का प्रतिनिधित्व करता है। यह तकनीक नमूने में विभिन्न हाइड्रोक्सी समूह के लिए तेज, विश्वसनीय और मात्रात्मक जानकारी प्रदान करता है। इन एनएमआर विधियों में लिग्नान और टैनिन की संरचना को समझने में जबरदस्त मूल्य होता है।
इसे कई तरह के अन्य सिस्टम पर भी लागू किया गया है जिनमें रिएक्टिव हाइड्रोक्सिल ग्रुप हैं । 40 डिग्री सेल्सियस पर वैक्यूम ओवन में रात भर सूखने से लिग्निन या टैनिन नमूने के 100 मिलीग्राम का पूर्व-इलाज करें। सूखने के बाद, नमूना को तेजी से एक निर्जल कैल्शियम सल्फेट डेसीकेट डेसीकेट में स्थानांतरित करें जब तक कि यह कमरे के तापमान तक न पहुंच जाए।
एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए नमूना तैयार करने के लिए, एक सरगर्मी बार से लैस दो मिलीलीटर शीशी में नमूने के लगभग 30 मिलीग्राम का सही वजन करें। इसके बाद, नमूना शीशी के लिए ताजा तैयार सॉल्वेंट समाधान के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें और एक टोपी के साथ शीशी सील। माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, नमूना शीशी में आंतरिक मानक समाधान के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें, फिर चुंबकीय रूप से प्रति मिनट 500 घूर्णन पर परिणामस्वरूप फैलाव को हिलाएं।
जब नमूना पूरी तरह से भंग हो जाता है, तो हुड के नीचे काम करते समय टेट्रामेथिल डायक्सीफोस्फोलेन या टीएमडीपी के 100 माइक्रोलीटर को नमूना समाधान में स्थानांतरित करें और जोरदार चुंबकीय सरगर्मी के लिए नमूना रखने से पहले नमूना समाधान को सील करें। इस बिंदु पर, इंगित प्रतिक्रिया लिग्निन और टैनिन नमूनों पर होती है। एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, विश्लेषण के लिए नमूना समाधान को एनएमआर ट्यूब में स्थानांतरित करें।
यदि नमूने में पीले रंग की वर्षा देखी जाती है, तो यह सुनिश्चित करके प्रक्रिया दोहराएं कि सभी संभव नमी संदूषण से बचा जाए। ब्रॉडबैंड जांच से लैस एनएमआर इंस्ट्रूमेंट में सैंपल ट्यूब लोड करें और प्रायोगिक मापदंड तय करें । ड्यूटेरेटेड क्लोरोफॉर्म की गूंज आवृत्ति का उपयोग करके, स्पेक्ट्रोमीटर में आवृत्ति निर्धारित करें।
नमूना शिम और अधिग्रहण शुरू करने से पहले स्पेक्ट्रोमीटर धुन। फोरियर ट्रांसफॉर्मेशन करके P31 एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी से कच्चे डेटा को प्रोसेस करना शुरू करें। प्रोसेसिंग टैब का विस्तार करके और चरण सुधार और मैनुअल सुधार का चयन करके मैनुअल चरण सुधार द्वारा चरण को समायोजित करें।
प्रसंस्करण पर क्लिक करने और बेसलाइन और मल्टी-पॉइंट बेसलाइन सुधार का चयन करने के बाद ध्यान से शून्य अंक सेट करके मैन्युअल रूप से बेसलाइन को सही करें। सिग्नल अंशांकन के लिए, विश्लेषण टैब खोलकर प्रति मिलियन 132.2 भागों के रासायनिक शिफ्ट मूल्य पर फॉस्फोरिलेटेड पानी के लिए सिग्नल सेट करें, फिर संदर्भ टैब में संदर्भ का चयन करें। संकेत एकीकरण के लिए, विश्लेषण मेनू में खुला अभिन्न।
एकीकरण को सामान्य बनाने के लिए, संपादित अभिन्न का चयन करने के लिए चोटी पर क्लिक करके आंतरिक मानक को 1.0 तक सेट करें और सामान्यीकृत टैब में मूल्य 1.00 दर्ज करें, फिर पांडुलिपि में रिपोर्ट किए गए रासायनिक बदलावों के अनुसार स्पेक्ट्रम एकीकरण करें। आंतरिक मानक, या आईएस, समाधान के मोलर एकाग्रता की गणना करने के लिए समीकरण का उपयोग करें और नमूने के प्रति ग्राम विशिष्ट संकेत की बराबर राशि का अनुमान लगाने के लिए गणना मूल्य का उपयोग करें। टीएमडीपी के साथ व्युत्पन्न सॉफ्टवुड क्राफ्ट लिग्निन में विभिन्न हाइड्रोक्सी समूहों का स्पेक्ट्रम मात्राकरण 300 मेगाहर्ट्ज और 700 मेगाहर्ट्ज एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके दर्ज किया गया था।
एनएमआर स्पेक्ट्रा में आंतरिक मानक और टीएमडी के हाइड्रोक्सिलेशन के कारण क्रमश 144 और 132 पीपीएम पर तेज और मजबूत चोटियों का पता चला। लिग्निन के मात्रात्मक P31 एनएमआर स्पेक्ट्रा के सभी में हाइड्रोक्सी समूहों के विभिन्न संकेत स्पष्ट थे। टीएमडीपी का उपयोग करके प्राप्त टैनिन नमूने के मात्रात्मक पी 31 एनएमआर स्पेक्ट्रम में, विभिन्न एलिफैटिक ओह पायरोफिलोल और कैटेकोल इकाइयों से एक विशिष्ट संकेत अच्छी तरह से दिखाई दे रहे थे।
लिग्निन के एनएमआर स्पेक्ट्रम से पहले और बाद में ऑक्सीकरण के बीच तुलना 300 मेगाहर्ट्ज एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके दर्ज की गई थी जिसमें हाइड्रोक्सी समूहों की चोटियों की तीव्रता में कमी दिखाई गई थी। महत्वपूर्ण कदम सुखाने और नमूने के भार और एनएमआर प्रसंस्करण मापदंडों का उपयोग करने से संबंधित हैं। और सबसे महत्वपूर्ण बात, प्राप्त स्पेक्ट्रा का चरणबद्ध रूप से।
जब इस विधि को दो-आयामी एनएमआर और जेल परमीशन क्रोमेटोग्राफी के साथ जोड़ा जाता है, तो प्राकृतिक पॉलीफेनॉल की एक बहुत विस्तृत तस्वीर उभर सकती है, जो अभूतपूर्व संरचनात्मक जानकारी और नई अंतर्दृष्टि प्रदान करती है।