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September 2nd, 2021
DOI :
September 2nd, 2021
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Introduction
0:45
Radial Locomotion Assay
2:10
Computer-Analyzed Swimming Assay
5:51
Data Analysis
6:19
Results: Analysis of the Crawling Speeds in Radial Locomotion and Thrashing in the Swimming Assay
7:48
Conclusion
Transcript
हमारे प्रोटोकॉल दो assays प्रस्तुत करता है, C.elegans आंदोलन परिमाणित. ये विधियां गतिशीलता फेनोटाइप्स का मूल्यांकन करती हैं जैसे कि एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस, या एएलएस के मॉडल द्वारा प्रदर्शित किए गए। रेडियल लोकोमोशन परख एक ठोस सतह पर रेंगने का पता लगाने के लिए एक लागत प्रभावी और आसान तरीका है।
तैराकी परख तरल में पिटाई आंदोलनों के निष्पक्ष पता लगाने के लिए कंप्यूटर आधारित ट्रैकिंग का उपयोग करता है। ये विधियां C.elegans में आंदोलन के अंतर को मापने के लिए उपयोगी हैं। यद्यपि हम एएलएस का अध्ययन करते हैं, लेकिन उनका उपयोग परिवर्तित गतिशीलता के साथ किसी भी तनाव के लिए किया जा सकता है।
नीचे एनजीएम परख प्लेटों फ्लिप. और C.elegans उपभेदों के लिए एक पहचानकर्ता के साथ नीचे लेबल परख किया जा करने के लिए. उल्टा प्लेट के केंद्र में मार्कर के साथ एक छोटा सा बिंदु बनाएं।
जबकि एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के साथ काम कर रहे हैं, परख प्लेट के केंद्र में कीड़े हस्तांतरण. और 30 मिनट के लिए एक टाइमर सेट करें। ढक्कन को प्लेट पर वापस रखें और इसे एक तरफ रख दें।
सभी उपभेदों नामित परख प्लेटों पर हैं जब तक कीड़े को स्थानांतरित जारी रखें। 30 मिनट के बाद, ढक्कन को हटाकर और प्लेट चेहरे को विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे रखकर पहली प्लेट को स्कोर करना शुरू करें। माइक्रोस्कोप फोकस को तब तक समायोजित करें जब तक कि सभी कीड़े ऑगर के माध्यम से दिखाई न दें।
केंद्र बिंदु से एक अलग रंगीन महसूस टिप पेन का उपयोग करके, प्रत्येक कीड़े के स्थान पर एक छोटा सा बिंदु रखें। प्लेट के किनारे की जांच करें क्योंकि कुछ कीड़े वहां समाप्त हो सकते हैं। इसके अलावा, गिनती और रिकॉर्ड करें कि कितने कीड़े केंद्र बिंदु से स्थानांतरित नहीं हुए।
प्रत्येक कृमि के लिए अंतिम स्थान चिह्नों के लिए केंद्र बिंदु से दूरी को मापें, और एक शासक का उपयोग करके दूरी रिकॉर्ड करें। पहले कृमि बिंदु को डैश के साथ चिह्नित किया गया है। प्लेट को दक्षिणावर्त फैशन में घुमाकर प्रत्येक बिंदु के लिए लगातार लंबाई डेटा रिकॉर्ड करें।
वीडियो सेट अप करने और रिकॉर्ड करने के लिए संबद्ध सॉफ़्टवेयर खोलें. वीडियो कैप्चर आइकन पर क्लिक करें। डिमर घुंडी पर नीचे दबाएं और प्रकाश को समायोजित करने के लिए इसे दक्षिणावर्त घुमाएं।
वीडियो कैप्चर विंडो में, सेटिंग्स टैब पर क्लिक करें और वीडियो मोड को 2456x2052_Mono8 करने के लिए समायोजित करें, फ्रेम दर को 14 तक, आउटपुट को मोनोक्रोम के रूप में। 0.00300 सेकंड का एक्सपोजर। 1 डीबी के लिए लाभ.
गामा एक के लिए। और 180 करने के लिए बारी बारी से। कैप्चर टैब पर वापस ले जाएँ, रिकॉर्डिंग फ़ोल्डर का चयन करें और फ़ाइल उपसर्ग पाठ बॉक्स में दर्ज करके फ़ाइल नाम असाइन करें.
बफ़र जैसी अन्य कैप्चर सेटिंग्स, 128 फ़्रेम पर, और अवधि को एक मिनट पर सेट करें. डिवाइस चरण पर परख प्लेट को जलाया और इसे वीडियो कैप्चर स्क्रीन में केंद्र में रखें, फिर ढक्कन को हटा दें। परख प्लेट पर M9 के 1 मिलीलीटर में लगभग 50 कीड़े धोने के लिए एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करें।
धीरे से जानवरों को केंद्र में लाने के लिए प्लेट को घुमाएं, या जानवरों को अलग करने के लिए एम 9 की कुछ बूंदों को जोड़ने के लिए एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करें। कीड़े को तैराकी के लिए अनुकूलित करने की अनुमति देने के लिए 60 सेकंड के लिए एक टाइमर सेट करें। प्रकाश घुंडी को समायोजित करें जैसे कि प्रदर्शन ओवरएक्सपोजर के बिना जितना संभव हो उतना उज्ज्वल हो।
मैन्युअल रूप से कैमरे के लेंस शरीर पर फोकसिंग रिंग को मोड़कर कैमरे के फोकस को समायोजित करें, जबकि डिस्प्ले को देखते हुए। 60 सेकंड के बाद रिकॉर्ड बटन दबाएं, वर्कफ़्लो मेनू आयात छवि अनुक्रम पर पहले बटन का चयन करें "और एक वीडियो पर खोजें और डबल क्लिक करें। वर्कफ़्लो मेनू से अनुक्रम जानकारी सेट करें का चयन करें"नई मेनू विंडो में नामकरण योजना की जाँच करें, नोट्स जोड़ें, और मेटाडेटा मान्य करें.
छवि समायोजित करें का चयन करें "और छवि समायोजन" नामक एक नया पॉप-अप मेनू खुलेगा। पृष्ठभूमि स्मूदिंग को 10 पर सेट करके छवि प्रसंस्करण सेटिंग्स को समायोजित करें, पांच के लिए गाऊसी चिकनाई, दो में छेद भरें, शून्य करने के लिए छोटे ऑब्जेक्ट फ़िल्टर, और इंटीग्रल डेरिवेटिव सेगमेंटेशन को छोड़ दें। दहलीज स्तर को इस तरह से समायोजित करें कि जानवर पूरी तरह से हरे रंग से भरे हुए हैं, लेकिन अभी भी पृष्ठभूमि से अलग हैं।
फिर लागू करें "वर्कफ़्लो मेनू से, का चयन करें का चयन करें और ट्रैक करें" तीन से सात वर्म का चयन करें और पता लगाने टैब में कीड़े का पता लगाएँ"बटन क्लिक करें। ट्रैकिंग टैब पर ले जाएँ. ट्रैकिंग पैरामीटर चेक बैकट्रैकिंग का उपयोग करें "और छवि के किनारे पर ट्रैक कीड़े को अनचेक करें।
अधिकतम ट्रैक की गई परिकल्पना को पांच पर सेट करें। तैराकी के लिए ट्रैकिंग मोड सेट करें। उन्नत सेटिंग्स अनुभाग में जाएँ और फ़्रेम वर्म सेट करें जो सीमा को 50 तक छू सकते हैं.
फ्रेम्स कीड़े 500 करने के लिए ओवरलैप कर सकते हैं। 0.50 करने के लिए स्थिति सहिष्णुता. और 0.50 के लिए सहिष्णुता आकार.
इन सेटिंग्स को सहेजें और उन्हें एक कॉन्फ़िगरेशन के रूप में सहेजकर एक प्रयोग में सभी वीडियो के लिए तैनात करें। ऊपरी बाएँ चिह्न मेनू में कॉन्फ़िगरेशन प्रबंधक पर नेविगेट करें, और सहेजें "चिह्न" क्लिक करें. इस कॉन्फ़िगरेशन को कोई नाम और विवरण दें.
और ठीक "वर्कफ़्लो मेनू में, प्रोजेक्ट सहेजें पर क्लिक करें"वर्कफ़्लो मेनू पर जाकर और बैच"आइकन पर क्लिक करके वीडियो ट्रैक करें" क्लिक करें. इस बैच-संसाधन मेनू के फ़ाइल चयन अनुभाग के अंतर्गत जोड़ें"बटन क्लिक करें. नेविगेट करें और संसाधित की जाने वाली सभी प्रोजेक्ट फ़ाइलों का चयन करें।
फिर खोलें "प्रारंभ पर क्लिक करें" बटन क्लिक करें, और पहली फ़ाइल पर हरे रंग की प्रगति संकेतक नोट करें। सभी फ़ाइलों को संसाधित करने की अनुमति दें। जब पढ़ी गई सभी फ़ाइलें समाप्त हो जाती हैं, तो सॉफ़्टवेयर बंद करें.
डेटा का विश्लेषण करें "ट्रैक सारांश पर नेविगेट करें" का चयन करें। और एक स्प्रेडशीट पठनीय प्रारूप में डेटा निर्यात करने के लिए नीचे दाईं ओर निर्यात "बटन का उपयोग करें। स्प्रेड शीटिंग फ़ंक्शंस का उपयोग करके प्रत्येक ट्रैक के लिए प्रति मिनट टर्न्स की गणना करने के लिए टर्न काउंट "और ट्रैक अवधि" का उपयोग करें.
पांच अलग-अलग उपभेदों के विकासात्मक रूप से मंचित एल 4 लार्वा के अउत्तेजित फैलाव, रेडियल लोकोमोशन परख का उपयोग करके मापा गया था। और माइक्रो मीटर प्रति मिनट यात्रा के रूप में रेखांकित किया। बार ग्राफ़ के रूप में प्रदर्शित डेटा उपभेदों के बीच सापेक्ष अंतर को स्पष्ट बनाता है।
जबकि ग्राफ के भीतर प्लॉट किए गए प्रत्येक कीड़े का अंतिम विस्थापन, आबादी के भीतर भिन्नता को बेहतर ढंग से देखने की अनुमति देता है। तरल में पिटाई या अनडुलेशन आवृत्ति के संदर्भ में तैराकी की दर, निष्पक्ष कंप्यूटर-सहायता प्राप्त स्कोरिंग और विश्लेषण का उपयोग करके मापा गया था। और प्रति मिनट थ्रैश के रूप में ग्राफ किया गया।
बार ग्राफ डेटा उपभेदों के बीच सापेक्ष अंतर को देखने में आसान बनाता है। जबकि स्कोर किए गए प्रत्येक व्यक्तिगत कीड़े के डेटा को ग्राफ के भीतर प्लॉट किया जाता है, जिससे आबादी के भीतर भिन्नता को बेहतर तरीके से विज़ुअलाइज़ किया जा सकता है। रेडियल लोकोमोशन परख में, हल्के TDP-43 तनाव जंगली प्रकार के N2 तनाव से काफी अलग नहीं था।
हालांकि, तैराकी परख में, हल्के और मजबूत टीडीपी -43 उपभेदों दोनों न केवल जंगली प्रकार के एन 2 से काफी अलग थे, बल्कि एक दूसरे से भी थे। एएलएस उत्परिवर्ती टीडीपी -43 स्ट्रेन में रेडियल लोकोमोशन द्वारा गंभीर रेंगने की हानि होती है, और वे तरल में नहीं मारते हैं। ताऊ-व्यक्त तनाव रेडियल लोकोमोशन में गंभीर हानि है, लेकिन तैराकी परख में मार कर सकते हैं.
इन विधियों के साथ विचार करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण पहलू, प्रतिकृति के बीच सुसंगत नियंत्रण बनाए रखना है। यह सुनिश्चित करता है कि गतिशीलता में भिन्नता फेनोटाइपिक मतभेदों के कारण होती है, न कि पर्यावरणीय परिस्थितियों के कारण। ये विधियां दो प्रमुख C.elegans गतिशीलता प्रतिमानों का एक व्यापक मूल्यांकन प्रदान करती हैं।
अनुवर्ती विधियों में अतिरिक्त व्यवहार लक्षण वर्णन, जैव रासायनिक विश्लेषण, या मांसपेशियों या न्यूरॉन फ़ंक्शन की जांच शामिल हो सकती है।
यह प्रोटोकॉल एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस के सी एलिगन्स मॉडल में हल्के, मध्यम और गंभीर मोटर हानि के बीच भेदभाव के लिए दो संवेदनशील assays का वर्णन करता है, जिसमें C. elegans उपभेदों के लिए सामान्य उपयोगिता के साथ, परिवर्तित गतिशीलता के साथ।
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