3.3K Views
•
08:27 min
•
September 2nd, 2021
DOI :
September 2nd, 2021
•0:04
Introduction
0:45
Radial Locomotion Assay
2:10
Computer-Analyzed Swimming Assay
5:51
Data Analysis
6:19
Results: Analysis of the Crawling Speeds in Radial Locomotion and Thrashing in the Swimming Assay
7:48
Conclusion
Transcript
Vårt protokoll presenterar två analyser som kvantifierar C.elegans rörelse. Dessa metoder utvärdera motility fenotyper såsom de som visas av modeller av Amyotrofisk lateral skleros, eller ALS. Radial Locomotion Assay är en kostnadseffektiv och enkel metod för att upptäcka krypning på en fast yta.
Simanalysen använder datorbaserad spårning för opartisk detektering av thrashing rörelser i vätska. Dessa metoder är användbara för att kvantifiera rörelseskillnader i C.elegans. Även om vi studerar ALS, kan de användas för alla stammar med förändrad motilitet.
Vänd NGM-analysplattorna upp och ner. Och märk botten med en identifierare för C.elegans stammar som ska analyseras. Gör en liten punkt med markören i mitten av den uppochnedvända plattan.
När du arbetar med ett dissekerande mikroskop, överför maskar till mitten av analysplattan. Och ställ in en timer på 30 minuter. Lägg tillbaka locket på tallriken och lägg det åt sidan.
Fortsätt att överföra maskar tills alla stammar är på de utsedda analysplattorna. Efter 30 minuter, börja göra poäng på den första plattan genom att ta bort locket och placera plattan med framsidan nedåt under det dissekerande mikroskopet. Justera mikroskopfokuset tills alla maskar är synliga genom skruven.
Använd en annan färgad filtspetspenna från mittpunkten och placera en liten punkt på platsen för varje mask. Kontrollera kanten på plattan eftersom vissa maskar kan hamna där. Räkna också och registrera hur många maskar som inte rörde sig från mittpunkten.
Mät avståndet från mittpunkten till de slutliga platsmarkeringarna för varje mask och registrera avståndet med hjälp av en linjal. Den första maskpunkten är markerad med ett bindestreck. Registrera längddata för varje prick i följd genom att rotera plattan medurs.
Öppna den associerade programvaran för att konfigurera och spela in videorna. Klicka på videoinspelningsikonen. Tryck ner dimmervredet och vrid det medurs för att justera ljuset.
I videoinspelningsfönstret klickar du på inställningsfliken och justerar videoläget till 2456x2052_Mono8, bildhastighet till 14, utgång som monokrom. Exponering på 0,00300 sekunder. Gå upp till 1 dB.
Gamma till ett. Och rotera till 180. Gå tillbaka till inspelningsfliken, markera inspelningsmappen och tilldela ett filnamn genom att ange det i textrutan för filprefix.
Ange andra inspelningsinställningar som buffert, till 128 bildrutor och varaktighet till en minut. Placera analysplattan tänd på enhetens scen och centrera den i videoinspelningsskärmen och ta sedan bort locket. Använd en mikropipette för att tvätta cirka 50 maskar i 1 ml M9 på analysplattan.
Virvla försiktigt plattan för att ta djuren till mitten, eller använd en mikropipette för att lägga till några droppar M9 för att separera djuren. Ställ in en timer i 60 sekunder så att maskar kan acklimatisera sig till simning. Justera ljusratten så att displayen är så ljus som möjligt utan överexponering.
Justera kamerans fokus manuellt genom att vrida fokuseringsringen på kamerans linskropp medan du tittar på skärmen. Efter 60 sekunder trycker du på inspelningsknappen, väljer den första knappen på arbetsflödesmenyn Importera bildsekvens"och hittar och dubbelklickar på en video. På arbetsflödesmenyn väljer du Ange sekvensinformation"I det nya menyfönstret kontrollerar du namnschemat, lägger till anteckningar och validerar metadata.
Välj Justera bild", öppnas en ny popup-meny med namn Bildjusteringar. Justera bildbehandlingsinställningarna genom att ställa in bakgrundsutjämningen till 10, Gaussian-utjämning till fem, Fyll hål till två, Litet objektfilter till noll och hoppa över integralderivatsegmentering. Justera tröskelnivån så att djuren är helt fyllda med grönt, men fortfarande skilt från bakgrunden.
Klicka sedan på Använd "På arbetsflödesmenyn väljer du Identifiera och spåra", välj tre till sju maskar och klicka på knappen Identifiera maskar på fliken Identifiering. Flytta till spårningsfliken. Kontrollera Använd bakåtspårning i spårningsparametrarna och avmarkera Spåra maskar i bildens kant.
Ställ in den maxspårade hypotesen till fem. Ställ in spårningsläget på simning. Flytta till avsnittet avancerade inställningar och ange att rammaskarna kan röra gränsen till 50.
Ramar maskar kan överlappa till 500. Positionstolerans mot 0,50. Och forma toleransen till 0,50.
Spara dessa inställningar och distribuera dem för alla videor i ett experiment genom att spara dem som en konfiguration. Navigera till konfigurationshanteraren längst upp till vänster ikonmenyn och klicka på ikonen Spara. Ge den här konfigurationen ett namn och en beskrivning.
Och klicka på Okej"Klicka på Spara projekt på arbetsflödesmenyn"Spåra videorna genom att gå till arbetsflödesmenyn och klicka på ikonen Batch". Klicka på knappen Lägg till under filmarkeringsavsnittet på den här batchbearbetningsmenyn. navigera till och markera alla projektfiler som ska bearbetas.
Klicka sedan på Öppna "Klicka på Start"-knappen och notera indikatorn för gröna framsteg i den första filen. Tillåt att alla filer bearbetas. Stäng programvaran när alla lästa filer är klara.
Välj Analysera data"Navigera till spårsammanfattningen. Och använd knappen Exportera längst ned till höger för att exportera data i ett läsbart kalkylbladsformat. Använd turn count"och Spåra varaktighet"för att beräkna varv per minut för varje spår med hjälp av spridningsarkfunktioner.
Ostimulerad spridning av utvecklings-iscensatt L4 larva av fem olika stammar, mättes med hjälp av Radial Locomotion Assay. Och graferade som mikromätare per minut reste. De data som visas som stapeldiagram gör relativa skillnader mellan stammar tydligare.
Medan den slutliga förskjutningen av varje mask som ritas i diagrammet, gör det möjligt att bättre visualisera variationen inom befolkningen. Simhastigheter när det gäller thrashing eller böljande frekvens i vätskan, mättes med hjälp av opartisk datorstödd poängsättning och analys. Och graferade som thrashes per minut.
Stapeldiagramdata gör relativa skillnader mellan stammar lättare att se. Medan data från varje enskild mask som poängsatts ritas i diagrammet, vilket gör att variationen inom populationen kan visualiseras bättre. I radiell locomotion assay var mild TDP-43 stam inte signifikant annorlunda än vilda-typ N2 stam.
Men i simanalysen var både de milda och starka TDP-43-stammarna inte bara signifikant annorlunda än den vilda typen N2, men också från varandra. ALS mutant TDP-43 stam har allvarliga krypning nedskrivningar av Radial Locomotion, och de inte thrash i vätska. Den tau-uttryckande stammen har allvarliga försämringar i Radial Locomotion, men kan slå i simning assay.
Den viktigaste aspekten att tänka på med dessa metoder är att upprätthålla konsekventa kontroller mellan replikat. Detta säkerställer att variationer i motilitet orsakas av fenotypiska skillnader och inte miljöförhållanden. Dessa metoder ger en omfattande bedömning av två stora C.elegans motility paradigms.
Uppföljningsmetoder kan inkludera ytterligare beteendemässiga karakterisering, biokemisk analys eller undersökning av muskel- eller neuronfunktion.
Detta protokoll beskriver två känsliga analyser för diskriminering bland mild, måttlig och allvarliga motor nedskrivningar i C. elegans modeller av amyotrofisk lateral skleros, med allmän nytta för C. elegans stammar, med förändrad motility.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved