Name: high-pressure nmr experiments for detecting protein low-lying conformational states
Uploaded: 2021-06-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Pressure NMR Experiments for Detecting Protein Low-Lying Conformational States at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af midler fra Roy J. Carver Charitable Trust til Julien Roche. Vi takker JD Levengood og B. S. Tolbert for venligt at give RRM2 prøve.

BEMÆRK: Den protokol, der er beskrevet her, kræver (i) en højtrykspumpe og celle med en 2,5 kbar bedømt aluminiumshærdet zirconiarør18, (ii) softwaren SPARKY19 til analyse af NMR-spektret og (iii) en kurvemonteringssoftware.
1. Prøveforberedelse, samling af højtrykscellen og opsætning af forsøgene.
<ol><li>Valg af buffer: Brug lige blanding af anioniske og kationiske buffere, såsom fosfat og Tris20,...

<ol>
	<li>Alderson, R. T., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+invisible+protein+states+with+NMR+spectroscopy.">Unveiling invisible protein states with NMR spectroscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 60, 39-49 (2020).</li><li>Korzhnev, D. M., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=probing+invisible,+low-populated+states+of+protein+molecules+by+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy:+An+application+to+protein+folding.">probing invisible, low-populated states of protein molecules by relaxation dispersion NMR spectroscopy: An application to protein folding.</a> Accounts of Chemical Research. 41, 442-451 (2008).</li><li>Loria, P. J., Berlow, R. B., Watt, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+enzyme+motions+by+solution+NMR+relaxation+dispersion.">Characterization of enzyme motions by solution NMR relaxation dispersion.</a> Accounts of Chemical Research. 41, 214-221 (2008).</li><li>Ishima, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CPMG+relaxation+dispersion.">CPMG relaxation dispersion.</a> Methods in Molecular Biology. 1084, 29-49 (2014).</li><li>Longo, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+exchange+saturation+transfer+(CEST):+an+efficient+tool+for+detecting+molecular+information+on+proteins'+behaviour.">Chemical exchange saturation transfer (CEST): an efficient tool for detecting molecular information on proteins' behaviour.</a> Analyst. 39, 2687-2690 (2014).</li><li>Fawzi, N. L., Ying, J., Torchia, D. A., Clore, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+exchange+kinetics+and+atomic+resolution+dynamics+in+high-molecular-weight+complexes+using+dark-state+exchange+saturation+transfer+NMR+spectroscopy.">Probing exchange kinetics and atomic resolution dynamics in high-molecular-weight complexes using dark-state exchange saturation transfer NMR spectroscopy.</a> Nature Protocols. 7, 1523-1533 (2012).</li><li>Anthis, N. J., Clore, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+transient+dark+states+by+NMR+spectroscopy.">Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48, 35-116 (2015).</li><li>Roche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavities+determine+the+pressure+unfolding+of+proteins.">Cavities determine the pressure unfolding of proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 6945-6950 (2012).</li><li>Chen, C. R., Makhatadze, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinant+of+the+effects+of+hydrostatic+pressure+on+protein+folding+stability.">Molecular determinant of the effects of hydrostatic pressure on protein folding stability.</a> Nature Communications. 8, 14561 (2017).</li><li>Roche, J., Royer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+pressure+denaturation+of+proteins.">Lessons from pressure denaturation of proteins.</a> Journal of the Royal Society Interface. 15, 20180244 (2018).</li><li>Xu, X., Gagn&#233;, D., Aramini, J. M., Gardner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+and+compressibility+differences+between+protein+conformations+revealed+by+high-pressure+NMR.">Volume and compressibility differences between protein conformations revealed by high-pressure NMR.</a> Biophysical Journal. 120, 924-935 (2021).</li><li>Akasaka, K., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-lying+excited+states+of+proteins+revealed+from+non-linear+pressure+shifts+in+1H+and+15N+NMR.">Low-lying excited states of proteins revealed from non-linear pressure shifts in 1H and 15N NMR.</a> Biochemistry. 40, 8665-8671 (2001).</li><li>Akasaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+conformational+fluctuation+of+proteins+by+pressure+perturbation.">Probing conformational fluctuation of proteins by pressure perturbation.</a> Chemical Reviews. 106, 1814-1835 (2006).</li><li>Kitahara, R., Yokoyama, S., Akasaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+snapshots+of+a+fluctuating+protein+structure:+ubiquitin+at+30+bar-3+kbar.">NMR snapshots of a fluctuating protein structure: ubiquitin at 30 bar-3 kbar.</a> Journal of Molecular Biology. 347, 277-285 (2005).</li><li>Roche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=remodeling+of+the+folding+free+energy+landscape+of+Staphylococcal+nuclease+by+cavity-creating+mutations.">remodeling of the folding free energy landscape of Staphylococcal nuclease by cavity-creating mutations.</a> Biochemistry. 51, 9535-9546 (2012).</li><li>Nucci, N. V., Fuglestad, B., Athanasoula, E. A., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cavities+and+hydration+in+the+pressure+unfolding+of+T4+lysozyme.">Role of cavities and hydration in the pressure unfolding of T4 lysozyme.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13846-13851 (2014).</li><li>Maeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavity+as+a+source+of+conformational+fluctuation+and+high-energy+state:+High-pressure+NMR+study+of+a+cavity-enlarged+mutant+of+T4+lysozyme.">Cavity as a source of conformational fluctuation and high-energy state: High-pressure NMR study of a cavity-enlarged mutant of T4 lysozyme.</a> Biophysical Journal. 108, 133-145 (2015).</li><li>Peterson, R. W., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-contained+high-pressure+cell,+apparatus,+and+procedure+for+the+preparation+of+encapsulated+proteins+dissolved+in+low+viscosity+fluids+for+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy.">Self-contained high-pressure cell, apparatus, and procedure for the preparation of encapsulated proteins dissolved in low viscosity fluids for nuclear magnetic resonance spectroscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 76, 094101 (2005).</li><li>Goddard, T. D., Kneller, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sparky 3. , (2010).</li><li>Caro, J. A., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+aspects+of+high-pressure+NMR+spectroscopy+and+its+applications+in+protein+biophysics+and+structural+biology.">Practical aspects of high-pressure NMR spectroscopy and its applications in protein biophysics and structural biology.</a> Methods. 148, 67-80 (2018).</li><li>Kitamura, T., Itoh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+volume+of+protonic+ionization+for+buffering+agents.+Prediction+of+pressure+dependence+of+pH+and+pOH.">Reaction volume of protonic ionization for buffering agents. Prediction of pressure dependence of pH and pOH.</a> Journal of Solution Chemistry. 16, 715-725 (1987).</li><li>Royer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+volume+changes+in+pressure-induced+protein+unfolding.">Revisiting volume changes in pressure-induced protein unfolding.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1595, 201-209 (2002).</li><li>Erlach, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+nonliner+pressure-induced+chemical+shift+changes+and+thermodynamic+parameters.">Relationship between nonliner pressure-induced chemical shift changes and thermodynamic parameters.</a> Journal of Physical Chemistry B. 118, 5681-5690 (2014).</li><li>de Oliveira, G. A. P., Silva, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hypothesis+to+reconcile+the+physical+and+chemical+unfolding+of+proteins.">A hypothesis to reconcile the physical and chemical unfolding of proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States of America. 112, 2775-2784 (2015).</li><li>Nguyen, L. M., Roche, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pressure+NMR+techniques+for+the+study+of+protein+dynamics,+folding+and+aggregation.">High-pressure NMR techniques for the study of protein dynamics, folding and aggregation.</a> Journal of Magnetic Resonance. 277, 179-185 (2017).</li></ol>

Denne undersøgelse beskriver en protokol implementeret til sonde protein strukturelle og termodynamik reaktioner på trykforstyrrelse. De højtryksforsøg, der er registreret her på RRM2, viser, at store variationer i ΔVU-værdier, der indikerer ikke-fuldt samarbejdsvillig udfoldning, kan findes i et relativt lille enkelt domæneprotein. Et lignende billede fremgår af analysen af 1H kemiske skift ændringer under pres. Det skal bemærkes, at Kalbitzer og kolleger har påvist, at der kan foretage...

Det har længe været anerkendt, at højere energi, tyndt befolkede kropsbygningstilstande af proteiner og proteinkomplekser spiller en central rolle i mange biologiske veje1,2,3. Takket være eksperimenter baseret på Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)4, Chemical Exchange Saturation Transfer (CEST)5og dark-state exchange saturation transfer (DEST)6 pulssekvenser (blandt andre) er løsning NMR-spektroskopi opstået som en valgfri metode til karakterisering af forbigående kropsbygningstilstande7. Sammen med disse eksperimenter, forstyrrelser såsom temperatur, pH, eller kemiske denaturanter kan indføres for at øge den relative befolkning af højere energi kropsbygning substates. Tilsvarende kan protein ekvilibri også forstyrres ved at anvende højt hydrostatisk tryk. Afhængigt af størrelsen af volumenændringen i forbindelse med de tilsvarende kropslige ændringer kan en stigning i trykket med et par hundrede til et par tusinde barer betydeligt stabilisere en højere energitilstand eller få et protein til helt at udfolde sig8,9,10. Protein NMR-spektre udviser typisk to typer ændringer med hydrostatisk tryk: (i) ændringer i kemisk skift og (ii) ændringer i spidsbelastningsintensiteten. Ændringer i kemiske skift afspejler ændringer i proteinoverfladen-vand-grænsefladen og/eller den lokale kompression af proteinstrukturen på en hurtig tidsskala (i forhold til NMR-tidsskalaen)11. Krydsfarver , der udviser store ikke-lineære kemiske skift trykafhængighed, kan indikere tilstedeværelsen af højere energikonformationstilstande12,13. På den anden side peger ændringer i spids intensitet på større kropslige overgange på en langsom tidsskala, såsom ændringer i foldede / udfoldede tilstandspopulationer. Tilstedeværelsen af sammenklappelige mellemprodukter eller højere energitilstande kan påvises fra store variationer i volumenændringens størrelse ved udfoldning målt for forskellige restkoncentrationer af et givet protein14,15,16,17. Baseret på vores erfaring udviser selv små proteiner, der typisk er klassificeret som tostatsmapper, ikke-ensartede reaktioner på tryk, hvilket giver nyttige oplysninger om deres lokale foldestabilitet. Beskrevet her er en protokol for erhvervelse og analyse af amide peak intensitet og 1H kemiske skift trykafhængighed, ved hjælp af som model protein den isolerede RNA anerkendelse motiv 2 (RRM2) af heterogene nukleare ribonucleoprotein A1 (hnRNPA1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar</td>
			<td>Daedalus Innovations LLC</td>
			<td>NMRCELL-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparky3</td>
			<td>University of California San Francisco, CA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xtreme-60 Syringe pump</td>
			<td>Daedalus Innovations LLC</td>
			<td>XTREME-60</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-pressure nmr experiments for detecting protein low-lying conformational states

Højtryk er en velkendt forstyrrelsesmetode, der kan bruges til at destabilisere kugleformede proteiner og adskille proteinkomplekser på en reversibel måde. Hydrostatisk tryk driver termodynamisk ligevægt mod staten (r) med den lavere molar volumen. Stigende tryk giver derfor mulighed for at finjustere stabiliteten af kugleformede proteiner og oligomeriseringsekvilibri af proteinkomplekser. Nmr-eksperimenter med højt tryk giver mulighed for en detaljeret karakterisering af de faktorer, der styrer stabiliteten af kugleproteiner, deres foldemekanismer og oligomeriseringsmekanismer ved at kombinere trykforstyrrelsens finstabilitetsevne og den stedopløsning, der tilbydes ved løsning NMR-spektroskopi. Her præsenterer vi en protokol til sonde den lokale folde stabilitet af et protein via et sæt af 2D 1H-15N eksperimenter registreret fra 1 bar til 2,5 kbar. De trin, der kræves til erhvervelse og analyse af sådanne eksperimenter, illustreres med data, der er erhvervet på RRM2-domænet for hnRNPA1.

Protokollen beskrevet her blev brugt til at sondere trykafhængigheden af RRM2, det andet RNA-anerkendelsesmotiv af hnRNPA1 (rester 95-106), som næsten helt udfoldes inden for 2,5 kbar-området (>90%). 1 H-15N spektre blev indsamlet på 1 bar, 500 bar, 750 bar, 1 kbar, 1,5 kbar, 2 kbar, og 2,5 kbar (Figur 2). Da ingen af de indfødte tværpeakker var synlige over støjniveauet ved 2,5 kbar, blev alle tilsvarende rester tilskrevet en intensitetsværdi på 0 ved dette tr...

Watch this Scientific Journal Video about High-Pressure NMR Experiments for Detecting Protein Low-Lying Conformational States at JoVE.com

High-Pressure NMR Experiments for Detecting Protein Low-Lying Conformational States

Vi giver en detaljeret beskrivelse af de trin, der kræves for at samle en højtrykscelle, oprette og registrere NMR-eksperimenter med højtryk og endelig analysere både topintensitets- og kemikalieskift under tryk. Disse eksperimenter kan give værdifuld indsigt i foldeveje og strukturel stabilitet af proteiner.

Højtryks NMR-eksperimenter til påvisning af protein lavtliggende kropsbygningstilstande

High-pressure is a well-known perturbation method that can be used to destabilize globular proteins and dissociate protein complexes in a reversible ...

Højt tryk er den valgte metode til at ændre den relative population af en proteinkonformationsprøve. Det er yderst nyttigt til isolering og karakterisering af højenergikonformationstilstande. Sammenlignet med alle de forstyrrelser metoder, som pH eller temperatur, trykforstyrrelse er let at anvende og fuldt reversibel.Det er også en lokal forstyrrelse, der primært påvirker regioner med glashulrum eller ugyldige mængder. Til at begynde med skal du indføre den nitrogen-15-mærkede prøve i zirconiarøret ved hjælp af en glaspipette og sikre prøvesæderne i bunden af røret. For at forhindre prøven i at blande sig med transmissionsvæsken skal prøven overlejres med 200 mikroliter mineralolie og derefter fylde resten af røret med transmissionsvæske.Sæt en engangs-O-ring oven på zirconiarøret og skub røret ind i bunden. Tilslut derefter røret til højtryksbåndslinjen og stram bunden til cellen med hånden. Derefter anvendes 14,7 newton meter drejningsmoment for at forhindre lækager ved lavere tryk.For at kontrollere trykcellesamlingens integritet skal du trykke på røret op til 300 bjælker uden for spektrometeret ved hjælp af cellestøtte og indeslutningsbeholder. Efter 15 minutter skal du nulstille trykket til en stang og kontrollere, om der er lækager med en ren fnugfri aftørring. Sæt det trykrør ind i spektrometeret ved forsigtigt at styre tetherlinjen.Skub røret ind i spektrometeret, indtil røret når prøve siddestillingen. Lås, shim, match og tune protium og kvælstof kanaler og gemme de optimerede shims for fremtiden. Konfigurer tværgående afslapningsoptimeret spektroskopi med hetero-sammenhængende spektroskopi med enkelt kvante, og fortsæt med at optage et referenceeksperiment under de atmosfæriske forhold.Optag en række 2D-eksperimenter fra en bar til 2,5 kilobarer for hver 500 barer. Hvis de præcise folde- eller foldehastigheder er kendt, skal prøven ekvilibrere prøven i 15 til 20 minutter efter hver 500 bjælkes stigning. Når bøjningspunktet for den foldende eller udfoldende overgang når, skal du registrere yderligere eksperimenter for at forbedre pasformens præcision.Denne protokol blev brugt til at sondere trykafhængigheden af RRM2, det andet RNA-anerkendelsesmotiv heterogene nukleare ribonucleoprotein A1. Tværgående afslapningsoptimeret spektroskopi med hetero-enkelt-kvante sammenhæng spektroskopi spektre blev indsamlet på en bar, 1,5 kilobarer, to kilobarer, og 2,5 kilobarer. RRM2 er næsten helt udfoldet inden for 2,5 kilobar rækkevidde. Individuelle trykintensitet profiler blev monteret i henhold til ligningen vist her, for at opnå de tilsvarende ændringer i standard Gibbs fri energi og volumen forbundet med udfolde reaktion.Når de blev kortlagt på domænestrukturen, blev resterne med den største mængdeændring fundet inden for domænets strukturelle kerne, mens de med den mindste mængdeændring hovedsagelig var placeret i forbindelsesløkkerne mellem betastrengene og betastrengen til C-terminalhelixen. For at sondere graden af kompressibilitet og kropslig heterogenitet af den foldede tilstand ensemble, protium kemiske skift blev analyseret. Individuelle profiler af protium kemiske skift som en funktion af trykket blev monteret ved hjælp af den viste ligning, at udtrække de stedspecifikke lineære og ikke-lineære koefficienter.Resterne med de største ikke-lineære koefficienter blev for det meste fundet i domænets strukturelle kerne, mens rester med de mindste ikke-lineære koefficienter for det meste var placeret inden for sløjfer, der forbinder de forskellige strukturelle motiver. Det er vigtigt at sætte røret op som et tryksæt korrekt for at forhindre lækager. Hvis der sker en lækage, skal sonden sandsynligvis fjernes for at rydde op i spor af mineralsk olie.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Kontrast-matche vaskemiddel i små-Angle Neutron Scattering eksperimenter for membran Protein strukturel analyse og Ab Initio modellering

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Et fluorescens udsving spektroskopi Assay af Protein-Protein interaktioner på celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høj følsomhed måling af transskription faktor-DNA bindende tilhørsforhold ved konkurrencedygtige titrering med Fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Identifikation af funktionelle Protein regioner gennem kimære Protein konstruktion

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Enkelt-molekyle tracking mikroskopi-et værktøj til bestemmelse af Difvøse tilstande af Cytosolic molekyler

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Oprettelse af meget specifikke kemisk induceret protein Dimerization systemer ved trinvis Phage udvælgelse af en kombinatorisk enkelt domæne antistof bibliotek

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Native Cell Membrane Nanopartikler System for Membran Protein-Protein Interaktion Analyse

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Optimering af væksten af endothiapepsinkrystaller til serielle krystallografieksperimenter

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

NMR-baseret fragmentscreening i en minimumsprøve, men maksimal automatiseringstilstand

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...