Name: high-pressure nmr experiments for detecting protein low-lying conformational states
Uploaded: 2021-06-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Pressure NMR Experiments for Detecting Protein Low-Lying Conformational States at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door fondsen van de Roy J. Carver Charitable Trust aan Julien Roche. Wij danken J. D. Levengood en B. S. Tolbert voor het verzorgen van het RRM2-monster.

OPMERKING: Het hier beschreven protocol vereist (i) een hogedrukpomp en -cel met een 2,5 kbar geharde aluminium-geharde zirkoniabuis18,(ii) de software SPARKY19 voor analyse van de NMR-spectra en (iii) een curve-fittingsoftware.
1. Monstervoorbereiding, assemblage van de hogedrukcel en opzetten van de experimenten.
<ol><li>Keuze van buffer: Gebruik een gelijk mengsel van anionische en kationische buffers, zoals fosfaat en Tris...

<ol>
	<li>Alderson, R. T., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+invisible+protein+states+with+NMR+spectroscopy.">Unveiling invisible protein states with NMR spectroscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 60, 39-49 (2020).</li><li>Korzhnev, D. M., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=probing+invisible,+low-populated+states+of+protein+molecules+by+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy:+An+application+to+protein+folding.">probing invisible, low-populated states of protein molecules by relaxation dispersion NMR spectroscopy: An application to protein folding.</a> Accounts of Chemical Research. 41, 442-451 (2008).</li><li>Loria, P. J., Berlow, R. B., Watt, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+enzyme+motions+by+solution+NMR+relaxation+dispersion.">Characterization of enzyme motions by solution NMR relaxation dispersion.</a> Accounts of Chemical Research. 41, 214-221 (2008).</li><li>Ishima, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CPMG+relaxation+dispersion.">CPMG relaxation dispersion.</a> Methods in Molecular Biology. 1084, 29-49 (2014).</li><li>Longo, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+exchange+saturation+transfer+(CEST):+an+efficient+tool+for+detecting+molecular+information+on+proteins'+behaviour.">Chemical exchange saturation transfer (CEST): an efficient tool for detecting molecular information on proteins' behaviour.</a> Analyst. 39, 2687-2690 (2014).</li><li>Fawzi, N. L., Ying, J., Torchia, D. A., Clore, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+exchange+kinetics+and+atomic+resolution+dynamics+in+high-molecular-weight+complexes+using+dark-state+exchange+saturation+transfer+NMR+spectroscopy.">Probing exchange kinetics and atomic resolution dynamics in high-molecular-weight complexes using dark-state exchange saturation transfer NMR spectroscopy.</a> Nature Protocols. 7, 1523-1533 (2012).</li><li>Anthis, N. J., Clore, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+transient+dark+states+by+NMR+spectroscopy.">Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48, 35-116 (2015).</li><li>Roche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavities+determine+the+pressure+unfolding+of+proteins.">Cavities determine the pressure unfolding of proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 6945-6950 (2012).</li><li>Chen, C. R., Makhatadze, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinant+of+the+effects+of+hydrostatic+pressure+on+protein+folding+stability.">Molecular determinant of the effects of hydrostatic pressure on protein folding stability.</a> Nature Communications. 8, 14561 (2017).</li><li>Roche, J., Royer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+pressure+denaturation+of+proteins.">Lessons from pressure denaturation of proteins.</a> Journal of the Royal Society Interface. 15, 20180244 (2018).</li><li>Xu, X., Gagn&#233;, D., Aramini, J. M., Gardner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+and+compressibility+differences+between+protein+conformations+revealed+by+high-pressure+NMR.">Volume and compressibility differences between protein conformations revealed by high-pressure NMR.</a> Biophysical Journal. 120, 924-935 (2021).</li><li>Akasaka, K., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-lying+excited+states+of+proteins+revealed+from+non-linear+pressure+shifts+in+1H+and+15N+NMR.">Low-lying excited states of proteins revealed from non-linear pressure shifts in 1H and 15N NMR.</a> Biochemistry. 40, 8665-8671 (2001).</li><li>Akasaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+conformational+fluctuation+of+proteins+by+pressure+perturbation.">Probing conformational fluctuation of proteins by pressure perturbation.</a> Chemical Reviews. 106, 1814-1835 (2006).</li><li>Kitahara, R., Yokoyama, S., Akasaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+snapshots+of+a+fluctuating+protein+structure:+ubiquitin+at+30+bar-3+kbar.">NMR snapshots of a fluctuating protein structure: ubiquitin at 30 bar-3 kbar.</a> Journal of Molecular Biology. 347, 277-285 (2005).</li><li>Roche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=remodeling+of+the+folding+free+energy+landscape+of+Staphylococcal+nuclease+by+cavity-creating+mutations.">remodeling of the folding free energy landscape of Staphylococcal nuclease by cavity-creating mutations.</a> Biochemistry. 51, 9535-9546 (2012).</li><li>Nucci, N. V., Fuglestad, B., Athanasoula, E. A., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cavities+and+hydration+in+the+pressure+unfolding+of+T4+lysozyme.">Role of cavities and hydration in the pressure unfolding of T4 lysozyme.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13846-13851 (2014).</li><li>Maeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavity+as+a+source+of+conformational+fluctuation+and+high-energy+state:+High-pressure+NMR+study+of+a+cavity-enlarged+mutant+of+T4+lysozyme.">Cavity as a source of conformational fluctuation and high-energy state: High-pressure NMR study of a cavity-enlarged mutant of T4 lysozyme.</a> Biophysical Journal. 108, 133-145 (2015).</li><li>Peterson, R. W., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-contained+high-pressure+cell,+apparatus,+and+procedure+for+the+preparation+of+encapsulated+proteins+dissolved+in+low+viscosity+fluids+for+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy.">Self-contained high-pressure cell, apparatus, and procedure for the preparation of encapsulated proteins dissolved in low viscosity fluids for nuclear magnetic resonance spectroscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 76, 094101 (2005).</li><li>Goddard, T. D., Kneller, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sparky 3. , (2010).</li><li>Caro, J. A., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+aspects+of+high-pressure+NMR+spectroscopy+and+its+applications+in+protein+biophysics+and+structural+biology.">Practical aspects of high-pressure NMR spectroscopy and its applications in protein biophysics and structural biology.</a> Methods. 148, 67-80 (2018).</li><li>Kitamura, T., Itoh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+volume+of+protonic+ionization+for+buffering+agents.+Prediction+of+pressure+dependence+of+pH+and+pOH.">Reaction volume of protonic ionization for buffering agents. Prediction of pressure dependence of pH and pOH.</a> Journal of Solution Chemistry. 16, 715-725 (1987).</li><li>Royer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+volume+changes+in+pressure-induced+protein+unfolding.">Revisiting volume changes in pressure-induced protein unfolding.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1595, 201-209 (2002).</li><li>Erlach, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+nonliner+pressure-induced+chemical+shift+changes+and+thermodynamic+parameters.">Relationship between nonliner pressure-induced chemical shift changes and thermodynamic parameters.</a> Journal of Physical Chemistry B. 118, 5681-5690 (2014).</li><li>de Oliveira, G. A. P., Silva, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hypothesis+to+reconcile+the+physical+and+chemical+unfolding+of+proteins.">A hypothesis to reconcile the physical and chemical unfolding of proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States of America. 112, 2775-2784 (2015).</li><li>Nguyen, L. M., Roche, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pressure+NMR+techniques+for+the+study+of+protein+dynamics,+folding+and+aggregation.">High-pressure NMR techniques for the study of protein dynamics, folding and aggregation.</a> Journal of Magnetic Resonance. 277, 179-185 (2017).</li></ol>

Deze studie beschrijft een protocol dat is geïmplementeerd om eiwit structurele en thermodynamische reacties op drukperturbatie te onderzoeken. De hogedrukexperimenten die hier op RRM2 zijn geregistreerd, tonen aan dat grote variaties in ΔV U-waarden, indicatief voor niet-volledig coöperatieve ontplooiing, kunnen worden gevonden in een relatief klein enkel domein eiwit. Een vergelijkbaar beeld komt naar voren uit de analyse van 1H chemische verschuivingsveranderingen onder druk. Opgemerkt moet wo...

Het is al lang erkend dat hoger-energetische, dunbevolkte conformatietoestanden van eiwitten en eiwitcomplexen een sleutelrol spelen in veel biologische routes1,2,3. Dankzij experimenten op basis van onder andere Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)4, Chemical Exchange Saturation Transfer (CEST)5en dark-state exchange saturation transfer (DEST)6 pulssequenties , is oplossing NMR-spectroscopie naar voren gekomen als een voorkeursmethode voor het karakteriseren van voorbijgaande conformatietoestanden7. Samen met deze experimenten kunnen verstoringen zoals temperatuur, pH of chemische denaturatiemiddelen worden geïntroduceerd om de relatieve populatie van hogere energie conformatiesubstaten te vergroten. Evenzo kunnen eiwitevenwichten ook worden verstoord door hoge hydrostatische druk toe te passen. Afhankelijk van de grootte van de volumeverandering geassocieerd met de overeenkomstige conformatieveranderingen, kan een toename van de druk met een paar honderd tot een paar duizend bar een hogere energietoestand aanzienlijk stabiliseren of ervoor zorgen dat een eiwit zich volledig ontvouwt8,9,10. Eiwit NMR-spectra vertonen doorgaans twee soorten veranderingen met hydrostatische druk: (i) chemische verschuivingsveranderingen en (ii) piekintensiteitsveranderingen. Chemische verschuivingsveranderingen weerspiegelen veranderingen op het eiwitoppervlak-waterinterface en/of lokale compressie van de eiwitstructuur op een snelle tijdschaal (ten opzichte van NMR-tijdschaal)11. Crosspeaks die grote niet-lineaire chemische verschuivingen vertonen, kunnen wijzen op de aanwezigheid van hogere energieconformatietoestanden12,13. Aan de andere kant wijzen piekintensiteitsveranderingen op belangrijke conformatieovergangen op een langzame tijdschaal, zoals veranderingen in gevouwen / ongevouwen toestandspopulaties. De aanwezigheid van vouwtussenproducten of hogere energietoestanden kan worden gedetecteerd aan de hand van grote variaties in de grootte van de volumeverandering bij het uitvouwen, gemeten voor verschillende residuen van een bepaald eiwit14,15,16,17. Op basis van onze ervaring vertonen zelfs kleine eiwitten die meestal worden geclassificeerd als tweestatenmappen niet-uniforme reacties op druk, wat nuttige informatie biedt over hun lokale vouwstabiliteit. Hier wordt een protocol beschreven voor de verwerving en analyse van amidepiekintensiteit en 1H chemische verschuivingen drukafhankelijkheid, met als modeleiwit het geïsoleerde RNA-herkenningsmotief 2 (RRM2) van het heterogene nucleaire ribonucleoproteïne A1 (hnRNPA1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar</td>
			<td>Daedalus Innovations LLC</td>
			<td>NMRCELL-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparky3</td>
			<td>University of California San Francisco, CA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xtreme-60 Syringe pump</td>
			<td>Daedalus Innovations LLC</td>
			<td>XTREME-60</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-pressure nmr experiments for detecting protein low-lying conformational states

Hogedruk is een bekende perturbatiemethode die kan worden gebruikt om bolvormige eiwitten te destabiliseren en eiwitcomplexen op een omkeerbare manier te dissociëren. Hydrostatische druk drijft thermodynamische evenwichten naar de toestand (en) met het lagere molaire volume. Toenemende druk biedt daarom de mogelijkheden om de stabiliteit van bolvormige eiwitten en de oligomerisatie-evenwichten van eiwitcomplexen fijn af te stemmen. Hogedruk NMR-experimenten maken een gedetailleerde karakterisering mogelijk van de factoren die de stabiliteit van bolvormige eiwitten, hun vouwmechanismen en oligomerisatiemechanismen regelen door het fijnstabiliteitsafstemmingsvermogen van drukdoorturbatie te combineren met de locatieresolutie die wordt geboden door oplossing NMR-spectroscopie. Hier presenteren we een protocol om de lokale vouwstabiliteit van een eiwit te onderzoeken via een reeks 2D 1H-15N-experimenten geregistreerd van 1 bar tot 2,5 kbar. De stappen die nodig zijn voor de verwerving en analyse van dergelijke experimenten worden geïllustreerd met gegevens die zijn verkregen over het RRM2-domein van hnRNPA1.

Het hier beschreven protocol werd gebruikt om de drukafhankelijkheid van RRM2 te onderzoeken, het tweede RNA-herkenningsmotief van hnRNPA1 (residuen 95-106), dat bijna volledig is ontvouwd binnen het bereik van 2,5 kbar (>90%). 1 H-15N spectra werden verzameld bij 1 bar, 500 bar, 750 bar, 1 kbar, 1,5 kbar, 2 kbar en 2,5 kbar (Figuur 2). Aangezien geen van de inheemse dwarspingen zichtbaar was boven het geluidsniveau bij 2,5 kbar, werd aan alle overeenkomstige residuen e...

Watch this Scientific Journal Video about High-Pressure NMR Experiments for Detecting Protein Low-Lying Conformational States at JoVE.com

High-Pressure NMR Experiments for Detecting Protein Low-Lying Conformational States

We geven een gedetailleerde beschrijving van de stappen die nodig zijn om een hogedrukcel samen te stellen, hogedruk NMR-experimenten op te zetten en op te nemen en ten slotte zowel piekintensiteit als chemische verschuivingsveranderingen onder druk te analyseren. Deze experimenten kunnen waardevolle inzichten opleveren in de vouwroutes en structurele stabiliteit van eiwitten.

Hogedruk NMR-experimenten voor het detecteren van eiwitarme conformatietoestanden

High-pressure is a well-known perturbation method that can be used to destabilize globular proteins and dissociate protein complexes in a reversible ...

Hoge druk is de methode bij uitstek om de relatieve populatie van een eiwitconformatiemonster te veranderen. Het is uiterst nuttig voor het isoleren en karakteriseren van hoogenergetische conformatietoestanden. Vergeleken met alle perturbatiemethoden, zoals pH of temperatuur, is drukperturbatie gemakkelijk toe te passen en volledig omkeerbaar.Het is ook een lokale verstoring, die voornamelijk regio's met glazen holtes of lege volumes treft. Om te beginnen introduceert u het stikstof-15-gelabelde monster in de zirkoniabuis met behulp van een glazen pipet en zorgt u ervoor dat het monster aan de onderkant van de buis zit. Om te voorkomen dat het monster zich mengt met de transmissievloeistof, bedekt u het monster met 200 microliter minerale olie en vult u vervolgens de rest van de buis met transmissievloeistof.Plaats een O-ring voor eenmalig gebruik bovenop de zirkoniabuis en schuif de buis in de basis. Sluit vervolgens de buis aan op de hogedruk tetherlijn en draai de basis met de hand aan de cel vast. Pas vervolgens 14,7 newtonmeter koppel toe om lekken bij lagere druk te voorkomen.Om de integriteit van de drukcelassemblage te controleren, zet u de buis tot 300 bar buiten de spectrometer onder druk met behulp van celondersteuning en insluitingsvat. Zet na 15 minuten de druk terug op één bar en controleer op lekken met een schoon pluisvrij doekje. Plaats de buis zonder druk in de spectrometer door de tetherlijn voorzichtig te geleiden.Schuif de buis in de spectrometer totdat de buis de zitpositie van het monster bereikt. Vergrendel, shim, match en tune de protium- en stikstofkanalen en bewaar de geoptimaliseerde shims voor de toekomst. Stel transversale relaxatie geoptimaliseerde spectroscopie in met hetero single-quantum coherente spectroscopie en ga verder met het opnemen van een referentie-experiment onder de atmosferische omstandigheden.Neem een reeks 2D-experimenten op van één bar tot 2,5 kilobar voor elke 500 bar. Als de precieze vouw- of ontvouwingssnelheden bekend zijn, laat u het monster na elke stap van 500 bar gedurende 15 tot 20 minuten in evenwicht brengen. Wanneer het buigpunt van de vouw- of ontvouwende overgang wordt bereikt, neemt u aanvullende experimenten op om de precisie van de pasvorm te verbeteren.Dit protocol werd gebruikt om de drukafhankelijkheid van RRM2 te onderzoeken, het tweede RNA-herkenningsmotief heterogene nucleaire ribonucleoproteïne A1. Transversale relaxatie geoptimaliseerde spectroscopie met hetero single-quantum coherentiespectroscopiespectroscopiespectroscopie werd verzameld op één bar, 1,5 kilobar, twee kilobar en 2,5 kilobar. De RRM2 is bijna volledig uitgevouwen binnen het bereik van 2,5 kilobar. Individuele drukintensiteitsprofielen werden aangepast volgens de hier getoonde vergelijking, om de overeenkomstige veranderingen in de standaard Gibbs-vrije energie en volume geassocieerd met de zich ontvouwende reactie te verkrijgen.Wanneer de domeinstructuur in kaart werd gebracht, werden de residuen met de grootste omvang van volumeverandering gevonden in de structurele kern van het domein, terwijl die met de kleinste omvang van volumeverandering zich voornamelijk bevonden in de verbindingslussen tussen de bètastrengen en bètastrengen naar de C-terminale helix. Om de mate van samendrukbaarheid en conformatie heterogeniteit van het gevouwen toestandsensemble te onderzoeken, werden de protiumchemische verschuivingen geanalyseerd. Individuele profielen van protiumchemische verschuivingen als functie van de druk werden aangebracht met behulp van de getoonde vergelijking, om de plaatsspecifieke lineaire en niet-lineaire coëfficiënten te extraheren.De residuen met de grootste niet-lineaire coëfficiënten werden meestal gevonden in de structurele kern van het domein, terwijl residuen met de kleinste niet-lineaire coëfficiënten zich meestal bevonden in lussen die de verschillende structurele motieven met elkaar verbonden. Het is belangrijk om de buis correct in te stellen als een drukset, om lekken te voorkomen. Als er een lek optreedt, moet de sonde waarschijnlijk worden verwijderd om elk spoor van minerale olie op te ruimen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Contrast-Matching wasmiddel in Small-Angle Neutron Scattering experimenten voor membraan eiwit structurele analyse en modellering van de Ab Initio

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Een fluorescentie schommelingen spectroscopie Assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hoge gevoeligheid meten van transcriptie Factor-DNA-bindende affiniteiten concurrerende getitreerd wordt met behulp van fluorescentie microscopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Identificatie van functionele eiwit regio's via chimeer eiwit bouw

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-molecule tracking microscopie-een hulpmiddel voor het bepalen van de Diffusieve toestanden van cytosolische moleculen

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Het creëren van zeer specifieke chemisch geïnduceerde eiwit Dimerization systemen door stepwise Phage selectie van een Combinatoriale één-domein antilichamen bibliotheek

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Native Cell Membrane Nanodeeltjes Systeem voor Membraan Eiwit-Eiwit Interactie Analyse

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Optimaliseren van de groei van endothiapepsine kristallen voor seriële kristallografie experimenten

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

NMR-gebaseerde fragmentscreening in een minimale steekproef maar maximale automatiseringsmodus

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...