Name: high-pressure nmr experiments for detecting protein low-lying conformational states
Uploaded: 2021-06-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Pressure NMR Experiments for Detecting Protein Low-Lying Conformational States at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Mittel des Roy J. Carver Charitable Trust an Julien Roche unterstützt. Wir danken J. D. Levengood und B. S. Tolbert für die freundliche Bereitstellung der RRM2-Probe.

HINWEIS: Das hier beschriebene Protokoll erfordert (i) eine Hochdruckpumpe und -zelle mit einem 2,5 kbar aluminiumgespannten Zirkonoxidrohr18,(ii) die Software SPARKY19 zur Analyse der NMR-Spektren und (iii) eine Kurvenanpassungssoftware.
1. Probenvorbereitung, Montage der Hochdruckzelle und Aufbau der Experimente.
<ol><li>Wahl des Puffers: Verwenden Sie eine gleiche Mischung aus anionischen und kationischen Puffern wie Phosphat und Tris<sup cl...

<ol>
	<li>Alderson, R. T., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+invisible+protein+states+with+NMR+spectroscopy.">Unveiling invisible protein states with NMR spectroscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 60, 39-49 (2020).</li><li>Korzhnev, D. M., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=probing+invisible,+low-populated+states+of+protein+molecules+by+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy:+An+application+to+protein+folding.">probing invisible, low-populated states of protein molecules by relaxation dispersion NMR spectroscopy: An application to protein folding.</a> Accounts of Chemical Research. 41, 442-451 (2008).</li><li>Loria, P. J., Berlow, R. B., Watt, E. 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V., Fuglestad, B., Athanasoula, E. A., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cavities+and+hydration+in+the+pressure+unfolding+of+T4+lysozyme.">Role of cavities and hydration in the pressure unfolding of T4 lysozyme.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13846-13851 (2014).</li><li>Maeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavity+as+a+source+of+conformational+fluctuation+and+high-energy+state:+High-pressure+NMR+study+of+a+cavity-enlarged+mutant+of+T4+lysozyme.">Cavity as a source of conformational fluctuation and high-energy state: High-pressure NMR study of a cavity-enlarged mutant of T4 lysozyme.</a> Biophysical Journal. 108, 133-145 (2015).</li><li>Peterson, R. W., Wand, J. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+aspects+of+high-pressure+NMR+spectroscopy+and+its+applications+in+protein+biophysics+and+structural+biology.">Practical aspects of high-pressure NMR spectroscopy and its applications in protein biophysics and structural biology.</a> Methods. 148, 67-80 (2018).</li><li>Kitamura, T., Itoh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+volume+of+protonic+ionization+for+buffering+agents.+Prediction+of+pressure+dependence+of+pH+and+pOH.">Reaction volume of protonic ionization for buffering agents. Prediction of pressure dependence of pH and pOH.</a> Journal of Solution Chemistry. 16, 715-725 (1987).</li><li>Royer, C. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hypothesis+to+reconcile+the+physical+and+chemical+unfolding+of+proteins.">A hypothesis to reconcile the physical and chemical unfolding of proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States of America. 112, 2775-2784 (2015).</li><li>Nguyen, L. M., Roche, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pressure+NMR+techniques+for+the+study+of+protein+dynamics,+folding+and+aggregation.">High-pressure NMR techniques for the study of protein dynamics, folding and aggregation.</a> Journal of Magnetic Resonance. 277, 179-185 (2017).</li></ol>

Diese Studie beschreibt ein Protokoll, das implementiert wurde, um die strukturellen und thermodynamischen Reaktionen von Proteinen auf Druckstörungen zu untersuchen. Die hier auf RRM2 aufgezeichneten Hochdruckexperimente zeigen, dass große Variationen derΔV-U-Werte, die auf eine nicht vollständig kooperative Entfaltung hinweisen, in einem relativ kleinen Einzeldomänenprotein gefunden werden können. Ein ähnliches Bild ergibt sich aus der Analyse von 1H chemischen Verschiebungsänderungen unte...

Es ist seit langem bekannt, dass energiereichere, dünn besiedelte Konformationszustände von Proteinen und Proteinkomplexen eine Schlüsselrolle in vielen biologischen Signalwegen spielen1,2,3. Dank Experimenten, die unter anderem auf Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)4, Chemical Exchange Saturation Transfer (CEST)5und Dark-State Exchange Saturation Transfer (DEST)6 Pulssequenzen basieren, hat sich die Lösungs-NMR-Spektroskopie als Methode der Wahl zur Charakterisierung transienter Konformationszustände7herauskristallisiert. Zusammen mit diesen Experimenten können Störungen wie Temperatur, pH-Wert oder chemische Denaturierungsmittel eingeführt werden, um die relative Population von konformationsreicheren Substaten zu erhöhen. In ähnlicher Weise können Proteingleichgewichte auch durch Anwendung eines hohen hydrostatischen Drucks gestört werden. Abhängig von der Größenordnung der Volumenänderung, die mit den entsprechenden Konformationsänderungen verbunden ist, kann ein Druckanstieg um einige hundert bis einige tausend bar einen höheren Energiezustand signifikant stabilisieren oder dazu führen, dass sich ein Protein vollständig entfaltet8,9,10. Protein-NMR-Spektren zeigen typischerweise zwei Arten von Veränderungen mit hydrostatischem Druck: (i) chemische Verschiebungsänderungen und (ii) Änderungen der Spitzenintensität. Chemische Verschiebungsänderungen spiegeln Veränderungen an der Proteinoberflächen-Wasser-Grenzfläche und/oder lokale Kompression der Proteinstruktur auf einer schnellen Zeitskala (relativ zur NMR-Zeitskala)wider 11. Crosspeaks, die große nichtlineare chemische Verschiebungen aufweisen, können auf das Vorhandensein von konformationsreicheren Zuständen hinweisen12,13. Auf der anderen Seite deuten Änderungen der Spitzenintensität auf große Konformationsübergänge auf einer langsamen Zeitskala hin, wie z. B. Veränderungen in gefalteten / entfalteten Zustandspopulationen. Das Vorhandensein von Faltungszwischenprodukten oder höheren Energiezuständen kann aus großen Variationen in der Größe der Volumenänderung bei der Entfaltung nachgewiesen werden, gemessen für verschiedene Rückstände eines bestimmten Proteins14,15,16,17. Basierend auf unserer Erfahrung zeigen selbst kleine Proteine, die typischerweise als Zwei-Zustands-Ordner klassifiziert werden, ungleichmäßige Reaktionen auf Druck, was nützliche Informationen über ihre lokale Faltungsstabilität liefert. Hier wird ein Protokoll zur Erfassung und Analyse der Amid-Spitzenintensität und der 1H chemischen Verschiebungen der Druckabhängigkeit beschrieben, wobei als Modellprotein das isolierte RNA-Erkennungsmotiv 2 (RRM2) des heterogenen kernen Ribonukleoproteins A1 (hnRNPA1) verwendet wird.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar</td>
			<td>Daedalus Innovations LLC</td>
			<td>NMRCELL-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparky3</td>
			<td>University of California San Francisco, CA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xtreme-60 Syringe pump</td>
			<td>Daedalus Innovations LLC</td>
			<td>XTREME-60</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-pressure nmr experiments for detecting protein low-lying conformational states

Hochdruck ist eine bekannte Störungsmethode, mit der globuläre Proteine destabilisiert und Proteinkomplexe reversibel dissoziiert werden können. Hydrostatischer Druck treibt thermodynamische Gleichgewichte in Richtung des/der Zustand(e) mit dem unteren molaren Volumen. Steigender Druck bietet daher die Möglichkeit, die Stabilität von kugelförmigen Proteinen und die Oligomerisierungsgleichgewichte von Proteinkomplexen fein abzustimmen. Hochdruck-NMR-Experimente ermöglichen eine detaillierte Charakterisierung der Faktoren, die die Stabilität von kugelförmigen Proteinen, ihre Faltungsmechanismen und Oligomerisierungsmechanismen steuern, indem die Feinstabilitätsabstimmungsfähigkeit der Druckstörung und die Standortauflösung der Lösungs-NMR-Spektroskopie kombiniert werden. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Untersuchung der lokalen Faltungsstabilität eines Proteins über eine Reihe von 2D-1H-15N-Experimenten, die von 1 bar bis 2,5 kbar aufgezeichnet wurden. Die für die Erfassung und Analyse solcher Experimente erforderlichen Schritte werden anhand von Daten veranschaulicht, die auf der RRM2-Domäne von hnRNPA1 erfasst wurden.

Mit dem hier beschriebenen Protokoll wurde die Druckabhängigkeit von RRM2, dem zweiten RNA-Erkennungsmotiv von hnRNPA1 (Rückstände 95-106), untersucht, das sich im 2,5 kbar-Bereich (>90%) nahezu vollständig entfaltet. 1 H-15N-Spektren wurden bei 1 bar, 500 bar, 750 bar, 1 kbar, 1,5 kbar, 2 kbar und 2,5 kbar gesammelt (Abbildung 2). Da keine der nativen Quersprechen oberhalb des Geräuschpegels bei 2,5 kbar sichtbar war, wurde allen entsprechenden Rückständen bei d...

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High-Pressure NMR Experiments for Detecting Protein Low-Lying Conformational States

Wir bieten eine detaillierte Beschreibung der Schritte, die erforderlich sind, um eine Hochdruckzelle zusammenzubauen, Hochdruck-NMR-Experimente einzurichten und aufzuzeichnen und schließlich sowohl die Spitzenintensität als auch chemische Verschiebungsänderungen unter Druck zu analysieren. Diese Experimente können wertvolle Einblicke in die Faltungswege und die strukturelle Stabilität von Proteinen liefern.

Hochdruck-NMR-Experimente zum Nachweis von proteinarmen Konformationszuständen

High-pressure is a well-known perturbation method that can be used to destabilize globular proteins and dissociate protein complexes in a reversible ...

Hochdruck ist die Methode der Wahl, um die relative Population einer Proteinkonformationsprobe zu verändern. Es ist äußerst nützlich für die Isolierung und Charakterisierung hochenergetischer Konformationszustände. Im Vergleich zu allen Störungsmethoden, wie pH-Wert oder Temperatur, ist die Druckstörungen einfach anzuwenden und vollständig reversibel.Es ist auch eine lokale Störung, die hauptsächlich Regionen mit Glashohlräumen oder Hohlraumvolumina betrifft. Führen Sie zunächst die mit Stickstoff 15 markierte Probe mit einer Glaspipette in das Zirkonoxidröhrchen ein und stellen Sie sicher, dass die Probe am Boden des Röhrchens sitzt. Um zu verhindern, dass sich die Probe mit der Transmissionsflüssigkeit vermischt, überlagern Sie die Probe mit 200 Mikrolitern Mineralöl und füllen Sie dann den Rest des Röhrchens mit Transmissionsflüssigkeit.Legen Sie einen Einweg-O-Ring auf das Zirkonoxidrohr und schieben Sie das Rohr in die Basis. Verbinden Sie dann das Rohr mit der Hochdruck-Haltelinie und ziehen Sie die Basis von Hand an der Zelle fest. Wenden Sie dann ein Drehmoment von 14,7 Newtonmetern an, um Leckagen bei niedrigerem Druck zu vermeiden.Um die Integrität der Druckzellenanordnung zu überprüfen, drücken Sie das Rohr bis zu 300 bar außerhalb des Spektrometers mit Zellunterstützung und Containment-Gefäß unter Druck. Setzen Sie den Druck nach 15 Minuten auf einen Bar zurück und überprüfen Sie mit einem sauberen, fusselfreien Tuch auf Lecks. Setzen Sie das drucklose Rohr in das Spektrometer ein, indem Sie die Seillinie vorsichtig führen.Schieben Sie das Röhrchen in das Spektrometer, bis das Röhrchen die Sitzposition der Probe erreicht. Sperren, shimen, passen und stimmen Sie die Protium- und Stickstoffkanäle ab und speichern Sie die optimierten Shims für die Zukunft. Richten Sie eine transversale Relaxationsoptimierte Spektroskopie mit Hetero-Einzelquantums-kohärenter Spektroskopie ein und fahren Sie mit der Aufzeichnung eines Referenzexperiments unter atmosphärischen Bedingungen fort.Zeichnen Sie eine Reihe von 2D-Experimenten von einem Balken bis zu 2,5 Kilobar pro 500 Balken auf. Wenn die genauen Falt- oder Entfaltungsraten bekannt sind, lassen Sie die Probe nach jedem 500-bar-Inkrement für 15 bis 20 Minuten ausgleichen. Wenn der Wendepunkt des Falt- oder Entfaltungsübergangs erreicht ist, zeichnen Sie zusätzliche Experimente auf, um die Präzision der Passform zu verbessern.Mit diesem Protokoll wurde die Druckabhängigkeit von RRM2, dem zweiten RNA-Erkennungsmotiv des heterogenen kernen Ribonukleoproteins A1, untersucht. Die transversale Relaxationsoptimierte Spektroskopie mit Hetero-Einzelquantenkohärenzspektroskopiespektren wurde an einem Bar, 1,5 Kilobar, zwei Kilobar und 2,5 Kilobar gesammelt. Der RRM2 ist im 2,5-Kilobar-Bereich nahezu vollständig entfaltet. Individuelle Druckintensitätsprofile wurden nach der hier gezeigten Gleichung angepasst, um die entsprechenden Änderungen der freien Energie und des Volumens der Gibbs-Standardgibs zu erhalten, die mit der Entfaltungsreaktion verbunden sind.Bei der Kartierung auf die Domänenstruktur wurden die Rückstände mit der größten Größe der Volumenänderung innerhalb des Domänenstrukturkerns gefunden, während sich diejenigen mit der geringsten Volumenänderung hauptsächlich in den Verbindungsschleifen zwischen den Beta-Strängen und dem Beta-Strang zur C-Terminal-Helix befanden. Um den Grad der Kompressibilität und Konformationsheterogenität des gefalteten Zustandsensembles zu untersuchen, wurden die protiumchemischen Verschiebungen analysiert. Individuelle Profile von protiumchemischen Verschiebungen in Abhängigkeit vom Druck wurden mit der gezeigten Gleichung angepasst, um die ortsspezifischen linearen und nichtlinearen Koeffizienten zu extrahieren.Die Rückstände mit den größten nichtlinearen Koeffizienten befanden sich meist im strukturellen Kern der Domäne, während Rückstände mit den kleinsten nichtlinearen Koeffizienten meist in Schleifen lagen, die die verschiedenen Strukturmotive miteinander verbanden. Es ist wichtig, das Rohr korrekt als Druck einzustellen, um Leckagen zu vermeiden. Wenn ein Leck auftritt, müsste die Sonde wahrscheinlich entfernt werden, um jede Spur von Mineralöl zu entfernen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Forschung

Biochemie

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Kontrast-passende Reinigungsmittel im Small-Angle Neutron Streuexperimente für Membrane Protein strukturelle Analyse und Modellierung von Ab Initio

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hohe Empfindlichkeit Messung der Transkription Faktor-DNA verbindlichen Affinitäten durch wettbewerbsfähige Titration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Festlegung der funktionellen Protein Regionen durch chimäres Protein Aufbau

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-Molecule Tracking-Mikroskopie - Ein Werkzeug zur Bestimmung der diffusiven Zustände von zytosolischen Molekülen

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Erstellen hochspezifischer chemisch induzierter Proteindimerisierungssysteme durch schrittweise Phage-Auswahl einer kombinatorischen Single-Domain-Antikörperbibliothek

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Native Cell Membrane Nanoparticles System für Membran-Protein-Protein-Interaktionsanalyse

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Optimierung des Wachstums von Endothiapepsin-Kristallen für serielle Kristallographie-Experimente

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

NMR-basiertes Fragment-Screening mit minimaler Probe, aber maximalem Automatisierungsmodus

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...