Name: high-pressure nmr experiments for detecting protein low-lying conformational states
Uploaded: 2021-06-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Pressure NMR Experiments for Detecting Protein Low-Lying Conformational States at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי כספים מקרן הצדקה רוי ג'יי קארבר לג'וליאן רוש. אנו מודים לג'יי.די. לבנגוד ו-ב.ס. טולברט על שסיפקו בחביבות את דגימת RRM2.

הערה: הפרוטוקול המתואר כאן דורש (i) משאבה בלחץ גבוה ותא עם צינור זירקוניהאלומיניום 18בדירוג אלומיניום 2.5, (ii) התוכנה SPARKY19 לניתוח ספקטרום NMR, ו - (iii) תוכנה להתאמת עקומה.
1. הכנה לדוגמה, הרכבה של התא בלחץ גבוה, והקמת הניסויים.
<ol><li>בחירת חוצץ: השתמש בתערובת ?...

<ol>
	<li>Alderson, R. T., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+invisible+protein+states+with+NMR+spectroscopy.">Unveiling invisible protein states with NMR spectroscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 60, 39-49 (2020).</li><li>Korzhnev, D. M., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=probing+invisible,+low-populated+states+of+protein+molecules+by+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy:+An+application+to+protein+folding.">probing invisible, low-populated states of protein molecules by relaxation dispersion NMR spectroscopy: An application to protein folding.</a> Accounts of Chemical Research. 41, 442-451 (2008).</li><li>Loria, P. J., Berlow, R. B., Watt, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+enzyme+motions+by+solution+NMR+relaxation+dispersion.">Characterization of enzyme motions by solution NMR relaxation dispersion.</a> Accounts of Chemical Research. 41, 214-221 (2008).</li><li>Ishima, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CPMG+relaxation+dispersion.">CPMG relaxation dispersion.</a> Methods in Molecular Biology. 1084, 29-49 (2014).</li><li>Longo, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+exchange+saturation+transfer+(CEST):+an+efficient+tool+for+detecting+molecular+information+on+proteins'+behaviour.">Chemical exchange saturation transfer (CEST): an efficient tool for detecting molecular information on proteins' behaviour.</a> Analyst. 39, 2687-2690 (2014).</li><li>Fawzi, N. L., Ying, J., Torchia, D. A., Clore, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+exchange+kinetics+and+atomic+resolution+dynamics+in+high-molecular-weight+complexes+using+dark-state+exchange+saturation+transfer+NMR+spectroscopy.">Probing exchange kinetics and atomic resolution dynamics in high-molecular-weight complexes using dark-state exchange saturation transfer NMR spectroscopy.</a> Nature Protocols. 7, 1523-1533 (2012).</li><li>Anthis, N. J., Clore, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+transient+dark+states+by+NMR+spectroscopy.">Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48, 35-116 (2015).</li><li>Roche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavities+determine+the+pressure+unfolding+of+proteins.">Cavities determine the pressure unfolding of proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 6945-6950 (2012).</li><li>Chen, C. R., Makhatadze, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinant+of+the+effects+of+hydrostatic+pressure+on+protein+folding+stability.">Molecular determinant of the effects of hydrostatic pressure on protein folding stability.</a> Nature Communications. 8, 14561 (2017).</li><li>Roche, J., Royer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+pressure+denaturation+of+proteins.">Lessons from pressure denaturation of proteins.</a> Journal of the Royal Society Interface. 15, 20180244 (2018).</li><li>Xu, X., Gagn&#233;, D., Aramini, J. M., Gardner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+and+compressibility+differences+between+protein+conformations+revealed+by+high-pressure+NMR.">Volume and compressibility differences between protein conformations revealed by high-pressure NMR.</a> Biophysical Journal. 120, 924-935 (2021).</li><li>Akasaka, K., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-lying+excited+states+of+proteins+revealed+from+non-linear+pressure+shifts+in+1H+and+15N+NMR.">Low-lying excited states of proteins revealed from non-linear pressure shifts in 1H and 15N NMR.</a> Biochemistry. 40, 8665-8671 (2001).</li><li>Akasaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+conformational+fluctuation+of+proteins+by+pressure+perturbation.">Probing conformational fluctuation of proteins by pressure perturbation.</a> Chemical Reviews. 106, 1814-1835 (2006).</li><li>Kitahara, R., Yokoyama, S., Akasaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+snapshots+of+a+fluctuating+protein+structure:+ubiquitin+at+30+bar-3+kbar.">NMR snapshots of a fluctuating protein structure: ubiquitin at 30 bar-3 kbar.</a> Journal of Molecular Biology. 347, 277-285 (2005).</li><li>Roche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=remodeling+of+the+folding+free+energy+landscape+of+Staphylococcal+nuclease+by+cavity-creating+mutations.">remodeling of the folding free energy landscape of Staphylococcal nuclease by cavity-creating mutations.</a> Biochemistry. 51, 9535-9546 (2012).</li><li>Nucci, N. V., Fuglestad, B., Athanasoula, E. A., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cavities+and+hydration+in+the+pressure+unfolding+of+T4+lysozyme.">Role of cavities and hydration in the pressure unfolding of T4 lysozyme.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13846-13851 (2014).</li><li>Maeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavity+as+a+source+of+conformational+fluctuation+and+high-energy+state:+High-pressure+NMR+study+of+a+cavity-enlarged+mutant+of+T4+lysozyme.">Cavity as a source of conformational fluctuation and high-energy state: High-pressure NMR study of a cavity-enlarged mutant of T4 lysozyme.</a> Biophysical Journal. 108, 133-145 (2015).</li><li>Peterson, R. W., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-contained+high-pressure+cell,+apparatus,+and+procedure+for+the+preparation+of+encapsulated+proteins+dissolved+in+low+viscosity+fluids+for+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy.">Self-contained high-pressure cell, apparatus, and procedure for the preparation of encapsulated proteins dissolved in low viscosity fluids for nuclear magnetic resonance spectroscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 76, 094101 (2005).</li><li>Goddard, T. D., Kneller, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sparky 3. , (2010).</li><li>Caro, J. A., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+aspects+of+high-pressure+NMR+spectroscopy+and+its+applications+in+protein+biophysics+and+structural+biology.">Practical aspects of high-pressure NMR spectroscopy and its applications in protein biophysics and structural biology.</a> Methods. 148, 67-80 (2018).</li><li>Kitamura, T., Itoh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+volume+of+protonic+ionization+for+buffering+agents.+Prediction+of+pressure+dependence+of+pH+and+pOH.">Reaction volume of protonic ionization for buffering agents. Prediction of pressure dependence of pH and pOH.</a> Journal of Solution Chemistry. 16, 715-725 (1987).</li><li>Royer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+volume+changes+in+pressure-induced+protein+unfolding.">Revisiting volume changes in pressure-induced protein unfolding.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1595, 201-209 (2002).</li><li>Erlach, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+nonliner+pressure-induced+chemical+shift+changes+and+thermodynamic+parameters.">Relationship between nonliner pressure-induced chemical shift changes and thermodynamic parameters.</a> Journal of Physical Chemistry B. 118, 5681-5690 (2014).</li><li>de Oliveira, G. A. P., Silva, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hypothesis+to+reconcile+the+physical+and+chemical+unfolding+of+proteins.">A hypothesis to reconcile the physical and chemical unfolding of proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States of America. 112, 2775-2784 (2015).</li><li>Nguyen, L. M., Roche, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pressure+NMR+techniques+for+the+study+of+protein+dynamics,+folding+and+aggregation.">High-pressure NMR techniques for the study of protein dynamics, folding and aggregation.</a> Journal of Magnetic Resonance. 277, 179-185 (2017).</li></ol>

מחקר זה מפרט פרוטוקול המיושם לבדיקת תגובות מבניות ותרמודינמיקה של חלבון ללחץ. הניסויים בלחץ גבוה שנרשמו כאן ב- RRM2 מראים כי וריאציות גדולות בערכי ΔVU, המעידות על שיתוף פעולה לא מלא, ניתן למצוא בחלבון תחום יחיד קטן יחסית. תמונה דומה עולה מניתוח שינויים בשינויים כימיים של 1H תחת לחץ....

זה זמן רב מוכר כי אנרגיה גבוהה יותר, מאוכלס בדלילות מצבים קונפורמציה של חלבונים ומתחמי חלבון לשחק תפקיד מפתח במסלולים ביולוגיים רבים1,2,3. הודות לניסויים המבוססים על קאר-פרסל-מייבום-גיל (CPMG)4, העברת רוויית חילופי כימיקלים (CEST)5,והעברת רוויית חילופי מצב כהה (DEST)6 רצפי פעימה (בין היתר), ספקטרוסקופיית NMR פתרון התגלתה כשיטת בחירה לאפיון מצבי קונפורמציה ארעיים7. יחד עם ניסויים אלה, perturbations כגון טמפרטורה, pH, או denaturants כימי ניתן להציג כדי להגדיל את האוכלוסייה היחסית של תת-מצבים קונפורמציה אנרגיה גבוהה יותר. באופן דומה, חלבון שיווי משקל יכול גם להיות מוטרד על ידי הפעלת לחץ הידרוסטטי גבוה. בהתאם לעוצמת השינוי בנפח הקשור לשינויים הקונפורמציה המתאימים, עלייה בלחץ בכמה מאות עד כמה אלפי ברים יכולה לייצב באופן משמעותי מצבאנרגיהגבוה יותר או לגרום לחלבון להתפתח לחלוטין 8,9,10. ספקטרום NMR חלבון מציג בדרך כלל שני סוגים של שינויים עם לחץ הידרוסטטי: (i) שינויים בשינויים כימיים ו-(ii) שינויים בעוצמת השיא. שינויים בהזזה כימית משקפים שינויים בממשק מי פני השטח של החלבון ו/או דחיסה מקומית של מבנה החלבון בסולם זמן מהיר (יחסית לסולם הזמן של NMR)11. הצלבות המציגות משמרות כימיות גדולות שאינן ליניאריות תלות בלחץ יכולות להצביע על נוכחות של מצבים קונפורמציה באנרגיה גבוהה יותר12,13. מצד שני, שינויי עוצמת שיא מצביעים על מעברים קונפורמיים משמעותיים בסולם זמן איטי, כגון שינויים באוכלוסיות המצב המקופלות/נפרשות. נוכחות של ביניים מתקפלים או מצבי אנרגיה גבוהים יותר ניתן לזהות מ וריאציות גדולות בסדר הגודל של שינוי נפח על התגלגלות נמדד עבור שאריות שונות של חלבון נתון14,15,16,17. בהתבסס על הניסיון שלנו, אפילו חלבונים קטנים המסווגים בדרך כלל כתיקיות של שתי מדינות מציגים תגובות לא אחידות ללחץ, המספק מידע שימושי על היציבות המתקפלת המקומית שלהם. מתואר כאן פרוטוקול לרכישה וניתוח של עוצמת שיא amide 1H כימי מעביר תלות בלחץ, באמצעות חלבון מודל מוטיב זיהוי RNA מבודד 2 (RRM2) של ribonucleoprotein גרעיני הטרוגניים A1 (hnRNPA1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar</td>
			<td>Daedalus Innovations LLC</td>
			<td>NMRCELL-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparky3</td>
			<td>University of California San Francisco, CA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xtreme-60 Syringe pump</td>
			<td>Daedalus Innovations LLC</td>
			<td>XTREME-60</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-pressure nmr experiments for detecting protein low-lying conformational states

לחץ גבוה הוא שיטת סוטה ידועה שניתן להשתמש בה כדי לערער חלבונים כדוריים ולנתק מתחמי חלבון באופן הפיך. לחץ הידרוסטטי מניע שיווי משקל תרמודינמי לכיוון המדינה(ים) עם נפח הטוחנת התחתונה. לחץ גובר מציע, אם כן, את ההזדמנויות לכוונן היטב את היציבות של חלבונים כדוריים ואת שיווי המשקל אוליגומריזציה של מתחמי חלבון. ניסויי NMR בלחץ גבוה מאפשרים אפיון מפורט של הגורמים המסדירים את היציבות של חלבונים כדוריים, מנגנוני הקיפול שלהם ומנגנוני האוליגומריזציה על ידי שילוב יכולת כוונון היציבות העדינה של סטיית לחץ ורזולוציית האתר המוצעת על ידי ספקטרוסקופיית NMR פתרון. כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לחקור את היציבות המתקפלת המקומית של חלבון באמצעות קבוצה של ניסויי 2D 1H-15N שנרשמו מ 1 בר ל 2.5 kbar. השלבים הנדרשים לרכישה וניתוח של ניסויים כאלה מודגמים בנתונים שנרכשו בתחום RRM2 של hnRNPA1.

הפרוטוקול המתואר כאן שימש כדי לחקור את התלות בלחץ של RRM2, מוטיב זיהוי הרנ"א השני של hnRNPA1 (שאריות 95-106), אשר נפרש כמעט לחלוטין בטווח 2.5 kbar (>90%). 1 ספקטרוםH-15N נאספו בבר אחד, 500 בר, 750 בר, 1 kbar, 1.5 kbar, 2 kbar ו 2.5 kbar(איור 2). מכיוון שאף אחד מהצלבים המקוריים לא נראה מעל רמת הרעש ב-2.5 ק"מ,...

Watch this Scientific Journal Video about High-Pressure NMR Experiments for Detecting Protein Low-Lying Conformational States at JoVE.com

High-Pressure NMR Experiments for Detecting Protein Low-Lying Conformational States

אנו מספקים תיאור מפורט של השלבים הנדרשים כדי להרכיב תא בלחץ גבוה, להגדיר ולתעד ניסויי NMR בלחץ גבוה, ולבסוף לנתח הן את עוצמת השיא והן שינויים במשמרות כימיות תחת לחץ. ניסויים אלה יכולים לספק תובנות חשובות על המסלולים המתקפלים והיציבות המבנית של חלבונים.

ניסויי NMR בלחץ גבוה לאיתור מצבים קונפורמציה נמוכים של חלבון

High-pressure is a well-known perturbation method that can be used to destabilize globular proteins and dissociate protein complexes in a reversible ...

לחץ גבוה הוא שיטת הבחירה לשינוי האוכלוסייה היחסית של מדגם קונפורמציה חלבון. זה מאוד שימושי לבידוד ואפיון מצבים קונפורמציה אנרגיה גבוהה. בהשוואה לכל שיטות ההסתעפות, כמו pH או טמפרטורה, הלחץ של perturbation קל ליישם והפכה לחלוטין.זהו גם הפרעה מקומית, המשפיעה בעיקר על אזורים עם חללי זכוכית או נפחים ריקים. כדי להתחיל, להציג את מדגם חנקן-15-תווית לתוך צינור זירקוניה באמצעות pipette זכוכית, ולהבטיח את המושבים מדגם בתחתית הצינור. כדי למנוע את המדגם מערבוב עם נוזל השידור, לכסות את המדגם עם 200 microliters של שמן מינרלי, ולאחר מכן למלא את שאר הצינור עם נוזל שידור.שים טבעת O חד פעמית על גבי צינור הזירקוניה ולהחליק את הצינור לתוך הבסיס. לאחר מכן חברו את הצינור לקו הרצועה בלחץ גבוה והידקו את הבסיס לתא ביד. לאחר מכן להחיל 14.7 ניוטון מטר המומנט כדי למנוע דליפות בלחץ נמוך יותר.כדי לבדוק את שלמות הרכבת תאי הלחץ, לחץ על הצינור עד 300 פסים מחוץ לספקטרומטר באמצעות תמיכה בתא וכלי בלימה. לאחר 15 דקות, לאפס את הלחץ לבר אחד ולבדוק דליפות עם ניגוב נקי ללא מוך. הכנס את הצינור הלא בלחץ לספקטרומטר על-ידי הנחיית קו הרצועה בזהירות.החלק את הצינור לתוך הספקטרומטר עד שהצינור מגיע לתנוחת ישיבה לדוגמה. נעל, שים, התאם וכוון את ערוצי הפרוטיום והחנקן ושמור את ה- shims הממוטב לעתיד. הגדירו ספקטרוסקופיה ממוטבת להרפיה רוחבית עם ספקטרוסקופיה קוהרנטית חד-קוונטית הטרו והמשיכו בהקלטת ניסוי ייחוס בתנאים האטמוספריים.הקלט סדרה של ניסויים 2D מבר אחד כדי 2.5 קילובר עבור כל 500 ברים. אם ידועים שיעורי הקיפול או ההתקפה המדויקים, לאחר כל תוספת של 500 עמודות, אפשרו לדגימה להתפרק במשך 15 עד 20 דקות. כאשר נקודת ההטיה של המעבר המתקפל או המתפתח מגיעה, תעד ניסויים נוספים כדי לשפר את דיוק ההתאמה.פרוטוקול זה שימש כדי לחקור את תלות הלחץ של RRM2, מוטיב זיהוי הרנ"א השני ריבונוקליאופרוטאין גרעיני A1. ספקטרוסקופיה מותאמת להרפיה רוחבית עם ספקטרוסקופיית קוהרנטיות חד-קוונטית הטרוסקסואלית נאספה בבר אחד, 1.5 קילובר, שני קילובר ו-2.5 קילובר. ה- RRM2 נפתח כמעט לחלוטין בטווח של 2.5 קילו-ביבר. פרופילי עוצמת לחץ בודדים הותקנו על פי המשוואה המוצגת כאן, כדי להשיג את השינויים המתאימים באנרגיה החופשית והנפח הרגילים של גיבס הקשורים לתגובה המתפתחת.כאשר מופה על מבנה הדומיין, שאריות עם הגודל הגדול ביותר של שינוי נפח נמצאו בתוך הליבה המבנית של הדומיין, בעוד אלה עם הגודל הקטן ביותר של שינוי נפח היו ממוקמים בעיקר בלולאות החיבור בין גדילי ביתא ו גדיל בטא לסליל מסוף C. כדי לחקור את מידת הדחיסה וההטרוגניות הקונפורמציה של הרכב המצב המקופל, נותחו השינויים הכימיים של הפרוטיום. פרופילים בודדים של משמרות כימיות פרוטיום כפונקציה של לחץ הותקנו באמצעות המשוואה המוצגת, כדי לחלץ את מקדמים ליניאריים ולא ליניאריים ספציפיים לאתר.השאריות עם הקדם הלא ליניארי הגדול ביותר נמצאו בעיקר בליבה המבנית של התחום, בעוד שאריות עם מקדמים לא ליניאריים הקטנים ביותר היו ממוקמים בעיקר בתוך לולאות המחברות את המוטיבים המבניים השונים. חשוב להגדיר את הצינור כמו לחץ להגדיר כראוי, כדי למנוע דליפות. אם תתרחש דליפה, הגשוש כנראה יצטרך להיות מוסר כדי לנקות כל זכר של שמן מינרלי.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

התאמת ניגודיות דטרגנט בניסויים פיזור ניוטרון זווית קטנה עבור ניתוח מבנה של חלבון ממברנה ומודלים Initio אלב

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

רגישות גבוהה מדידה של שעתוק הזיקות איגוד מקדם-DNA על ידי טיטור תחרותי באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

זיהוי של חלבון פונקציונלי אזורים באמצעות חלבון Chimeric בנייה

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

מיקרוסקופ מעקב חד-מולקולה-כלי לקביעת המדינות התפוצבניות של מולקולות ציטוסולג

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

יצירת חלבון מאוד ספציפי הנגרמת כימית מערכות דימריזציה על ידי בחירת בחירה באמצעות מבחר של קומבינטורית מתחם יחיד בספריית הנוגדן

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

מערכת חלקיקי קרום התא המקורי לניתוח אינטראקציה של חלבון-חלבון קרום

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

אופטימיזציה של הצמיחה של גבישי אנדותיאפפסין לניסויי קריסטלוגרפיה סדרתיים

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

סינון מקטעים מבוסס NMR במדגם מינימלי אך במצב אוטומציה מקסימלי

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...