Name: high-pressure nmr experiments for detecting protein low-lying conformational states
Uploaded: 2021-06-29T14:30:00
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Questo lavoro è stato sostenuto da fondi dal Roy J. Carver Charitable Trust a Julien Roche. Ringraziamo J. D. Levengood e B. S. Tolbert per aver gentilmente fornito il campione RRM2.

NOTA: Il protocollo qui descritto richiede (i) una pompa e una cella ad alta pressione con un tubo di zirconia in alluminio resistente da 2,5 kbar18,(ii) il software SPARKY19 per l'analisi degli spettri NMR e (iii) un software di raccordo a curva.
1. Preparazione del campione, assemblaggio della cella ad alta pressione e impostazione degli esperimenti.
<ol><li>Scelta del tampone: Utilizzare una miscela uguale di tamponi anionici e cationici, co...

<ol>
	<li>Alderson, R. T., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+invisible+protein+states+with+NMR+spectroscopy.">Unveiling invisible protein states with NMR spectroscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 60, 39-49 (2020).</li><li>Korzhnev, D. M., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=probing+invisible,+low-populated+states+of+protein+molecules+by+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy:+An+application+to+protein+folding.">probing invisible, low-populated states of protein molecules by relaxation dispersion NMR spectroscopy: An application to protein folding.</a> Accounts of Chemical Research. 41, 442-451 (2008).</li><li>Loria, P. J., Berlow, R. B., Watt, E. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hypothesis+to+reconcile+the+physical+and+chemical+unfolding+of+proteins.">A hypothesis to reconcile the physical and chemical unfolding of proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States of America. 112, 2775-2784 (2015).</li><li>Nguyen, L. M., Roche, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pressure+NMR+techniques+for+the+study+of+protein+dynamics,+folding+and+aggregation.">High-pressure NMR techniques for the study of protein dynamics, folding and aggregation.</a> Journal of Magnetic Resonance. 277, 179-185 (2017).</li></ol>

Questo studio descrive in dettaglio un protocollo implementato per sondare le risposte strutturali e termodinamiche delle proteine alla perturbazione della pressione. Gli esperimenti ad alta pressione registrati qui su RRM2 dimostrano che grandi variazioni nei valori di ΔVU, indicative di uno sviluppo non completamente cooperativo, possono essere trovate in una proteina a dominio singolo relativamente piccola. Un quadro simile emerge dall'analisi dei cambiamenti di spostamento chimico di 1H sotto p...

È stato a lungo riconosciuto che gli stati conformazionali a più alta energia e scarsamente popolati di proteine e complessi proteici svolgono un ruolo chiave in molte vie biologiche1,2,3. Grazie a esperimenti basati su Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)4,Chemical Exchange Saturation Transfer (CEST)5e dark-state exchange saturation transfer (DEST) 6 sequenze di impulsi (tra gli altri), la spettroscopia NMR insoluzione è emersa come metodo di scelta per caratterizzare gli stati conformazionali transitori7. Insieme a questi esperimenti, possono essere introdotte perturbazioni come temperatura, pH o denaturanti chimici per aumentare la popolazione relativa di sottostati conformazionali a energia più elevata. Allo stesso modo, gli equilibri proteici possono anche essere perturbati applicando un'alta pressione idrostatica. A seconda dell'entità della variazione di volume associata ai corrispondenti cambiamenti conformazionali, un aumento della pressione da poche centinaia a poche migliaia di bar può stabilizzare significativamente uno stato energetico più elevato o causare il completo dispiegamento di una proteina8,9,10. Gli spettri NMR delle proteine mostrano tipicamente due tipi di cambiamenti con la pressione idrostatica: (i) cambiamenti di spostamento chimico e (ii) cambiamenti di intensità di picco. I cambiamenti di spostamento chimico riflettono i cambiamenti nell'interfaccia proteina superficie-acqua e/o la compressione locale della struttura proteica su una scala temporale rapida (rispetto alla scala temporale NMR)11. Crosspeaks che esibisce grandi spostamenti chimici non lineari la dipendenza dalla pressione può indicare la presenza di stati conformazionali di energia superiore12,13. D'altra parte, i cambiamenti di intensità di picco indicano importanti transizioni conformazionali su una scala temporale lenta, come i cambiamenti nelle popolazioni statali piegate / dispiegate. La presenza di intermedi ripieganti o stati energetici superiori può essere rilevata da grandi variazioni nell'entità della variazione di volume allo spiegamento misurata per diversi residui di una data proteina14,15,16,17. Sulla base della nostra esperienza, anche le piccole proteine che sono tipicamente classificate come cartelle a due stati mostrano risposte non uniformi alla pressione, il che fornisce informazioni utili sulla loro stabilità di ripiegamento locale. Qui è descritto un protocollo per l'acquisizione e l'analisi dell'intensità di picco dell'ammide e della dipendenza dalla pressione degli spostamenti chimici di 1H, utilizzando come proteina modello il motivo di riconoscimento dell'RNA isolato 2 (RRM2) della ribonucleoproteina nucleare eterogenea A1 (hnRNPA1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar</td>
			<td>Daedalus Innovations LLC</td>
			<td>NMRCELL-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparky3</td>
			<td>University of California San Francisco, CA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xtreme-60 Syringe pump</td>
			<td>Daedalus Innovations LLC</td>
			<td>XTREME-60</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-pressure nmr experiments for detecting protein low-lying conformational states

L'alta pressione è un metodo di perturbazione ben noto che può essere utilizzato per destabilizzare le proteine globulari e dissociare i complessi proteici in modo reversibile. La pressione idrostatica guida gli equilibri termodinamici verso lo stato o gli stati con il volume molare inferiore. L'aumento della pressione offre, quindi, l'opportunità di sintonizzare finemente la stabilità delle proteine globulari e gli equilibri di oligomerizzazione dei complessi proteici. Gli esperimenti NMR ad alta pressione consentono una caratterizzazione dettagliata dei fattori che governano la stabilità delle proteine globulari, i loro meccanismi di ripiegamento e i meccanismi di oligomerizzazione combinando la capacità di sintonizzazione della stabilità fine della perturbazione della pressione e la risoluzione del sito offerta dalla spettroscopia NMR della soluzione. Qui presentiamo un protocollo per sondare la stabilità di ripiegamento locale di una proteina tramite una serie di esperimenti 2D 1H-15N registrati da 1 bar a 2,5 kbar. I passaggi necessari per l'acquisizione e l'analisi di tali esperimenti sono illustrati con i dati acquisiti sul dominio RRM2 di hnRNPA1.

Il protocollo qui descritto è stato utilizzato per sondare la dipendenza dalla pressione di RRM2, il secondo motivo di riconoscimento dell'RNA di hnRNPA1 (residui 95-106), che è quasi completamente dispiegato all'interno dell'intervallo di 2,5 kbar (>90%). 1 Gli spettriH-15N sono stati raccolti a 1 bar, 500 bar, 750 bar, 1 kbar, 1,5 kbar, 2 kbar e 2,5 kbar (Figura 2). Poiché nessuno dei crosspeak nativi era visibile al di sopra del livello di rumore a 2,5 kbar, a tut...

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High-Pressure NMR Experiments for Detecting Protein Low-Lying Conformational States

Forniamo una descrizione dettagliata dei passaggi necessari per assemblare una cella ad alta pressione, impostare e registrare esperimenti NMR ad alta pressione e infine analizzare sia l'intensità di picco che i cambiamenti di spostamento chimico sotto pressione. Questi esperimenti possono fornire preziose informazioni sui percorsi di ripiegamento e sulla stabilità strutturale delle proteine.

Esperimenti NMR ad alta pressione per il rilevamento di stati conformazionali a bassa pressione delle proteine

High-pressure is a well-known perturbation method that can be used to destabilize globular proteins and dissociate protein complexes in a reversible ...

L'alta pressione è il metodo di scelta per modificare la popolazione relativa di un campione conformazionale proteico. È estremamente utile per isolare e caratterizzare stati conformazionali ad alta energia. Rispetto a tutti i metodi di perturbazione, come pH o temperatura, la perturbazione a pressione è facile da applicare e completamente reversibile.È anche una perturbazione locale, che colpisce principalmente le regioni con cavità di vetro o volumi vuoti. Per iniziare, introdurre il campione etichettato con azoto-15 nella provetta di zirconia usando una pipetta di vetro e assicurarsi che il campione si sieda nella parte inferiore del tubo. Per evitare che il campione si mescoli con il liquido di trasmissione, sovrapporre il campione con 200 microlitri di olio minerale e quindi riempire il resto del tubo con liquido di trasmissione.Mettere un O-ring monouso sopra il tubo di zirconia e far scorrere il tubo nella base. Quindi collegare il tubo alla linea di collegamento ad alta pressione e stringere la base alla cella a mano. Quindi applicare una coppia di 14,7 newton metri per evitare perdite a pressione inferiore.Per verificare l'integrità del gruppo cella di pressione, pressurizzare il tubo fino a 300 bar all'esterno dello spettrometro utilizzando il supporto della cella e il contenitore di contenimento. Dopo 15 minuti, ripristinare la pressione a una barra e verificare la disponibilità di perdite con una salvietta pulita senza lanugine. Inserire il tubo non pressurizzato nello spettrometro guidando attentamente la linea di legame.Far scorrere il tubo nello spettrometro fino a quando il tubo raggiunge la posizione seduta del campione. Blocca, shim, abbina e sintonizza i canali del prozio e dell'azoto e salva gli spessori ottimizzati per il futuro. Impostare la spettroscopia ottimizzata per il rilassamento trasversale con spettroscopia coerente etero-singolo-quantistica e procedere con la registrazione di un esperimento di riferimento alle condizioni atmosferiche.Registra una serie di esperimenti 2D da una barra a 2,5 kilobar per ogni 500 bar. Se sono note le velocità precise di piegatura o di dispiegamento, dopo ogni incremento di 500 bar, lasciare che il campione si equilibri per 15-20 minuti. Quando il punto di flessione della transizione di piegatura o dispiegamento raggiunge, registrare ulteriori esperimenti per migliorare la precisione della vestibilità.Questo protocollo è stato utilizzato per sondare la dipendenza dalla pressione di RRM2, il secondo motivo di riconoscimento dell'RNA eterogeneo ribonucleoproteina nucleare A1. La spettroscopia ottimizzata per il rilassamento trasversale con spettri di spettroscopia a coerenza quantistica singola etero è stata raccolta a una barra, 1,5 kilobar, due kilobar e 2,5 kilobar. L'RRM2 è quasi completamente aperto all'interno della gamma di 2,5 kilobar. I singoli profili di intensità di pressione sono stati montati secondo l'equazione mostrata qui, per ottenere le corrispondenti variazioni dell'energia libera di Gibbs standard e del volume associati alla reazione di dispiegamento.Quando mappati sulla struttura del dominio, i residui con la più grande grandezza di variazione di volume sono stati trovati all'interno del nucleo strutturale del dominio, mentre quelli con la più piccola grandezza della variazione di volume si trovavano principalmente negli anelli di collegamento tra i filamenti beta e il filamento beta all'elica terminale C. Per sondare il grado di comprimibilità e l'eterogeneità conformazionale dell'insieme di stati piegati, sono stati analizzati gli spostamenti chimici del prozio. I profili individuali degli spostamenti chimici del prozio in funzione della pressione sono stati montati utilizzando l'equazione mostrata, per estrarre i coefficienti lineari e non lineari specifici del sito.I residui con i più grandi coefficienti non lineari sono stati per lo più trovati nel nucleo strutturale del dominio, mentre i residui con i più piccoli coefficienti non lineari sono stati per lo più situati all'interno di anelli che collegano i diversi motivi strutturali. È importante impostare il tubo come una pressione impostata correttamente, per evitare perdite. Se si verifica una perdita, la sonda dovrebbe probabilmente essere rimossa per ripulire qualsiasi traccia di olio minerale.

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