Name: high-pressure nmr experiments for detecting protein low-lying conformational states
Uploaded: 2021-06-29T14:30:00
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この作品は、ロイ・J・カーバー慈善信託からジュリアン・ロシュへの資金によって支えられました。RrM2サンプルを親切に提供してくれたJ・D・レヴェングッドとB.S.トルバートに感謝します。

注:ここで説明するプロトコルは、(i)2.5 kbarと2.5 kbarの高圧ポンプとセルを定め、(ii)NMRスペクトルの分析用のソフトウェアSPARKY19、 および(iii)曲線フィッティングソフトウェアを必要とする。
1.サンプル調製、高圧セルの組み立て、および実験を設定する。
<ol><li>バッファの選択: リン酸塩とトリス20,<sup class="x...

<ol>
	<li>Alderson, R. T., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+invisible+protein+states+with+NMR+spectroscopy.">Unveiling invisible protein states with NMR spectroscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 60, 39-49 (2020).</li><li>Korzhnev, D. M., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=probing+invisible,+low-populated+states+of+protein+molecules+by+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy:+An+application+to+protein+folding.">probing invisible, low-populated states of protein molecules by relaxation dispersion NMR spectroscopy: An application to protein folding.</a> Accounts of Chemical Research. 41, 442-451 (2008).</li><li>Loria, P. J., Berlow, R. B., Watt, E. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+transient+dark+states+by+NMR+spectroscopy.">Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48, 35-116 (2015).</li><li>Roche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavities+determine+the+pressure+unfolding+of+proteins.">Cavities determine the pressure unfolding of proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 6945-6950 (2012).</li><li>Chen, C. R., Makhatadze, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinant+of+the+effects+of+hydrostatic+pressure+on+protein+folding+stability.">Molecular determinant of the effects of hydrostatic pressure on protein folding stability.</a> Nature Communications. 8, 14561 (2017).</li><li>Roche, J., Royer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+pressure+denaturation+of+proteins.">Lessons from pressure denaturation of proteins.</a> Journal of the Royal Society Interface. 15, 20180244 (2018).</li><li>Xu, X., Gagn&#233;, D., Aramini, J. M., Gardner, K. 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V., Fuglestad, B., Athanasoula, E. A., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cavities+and+hydration+in+the+pressure+unfolding+of+T4+lysozyme.">Role of cavities and hydration in the pressure unfolding of T4 lysozyme.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13846-13851 (2014).</li><li>Maeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavity+as+a+source+of+conformational+fluctuation+and+high-energy+state:+High-pressure+NMR+study+of+a+cavity-enlarged+mutant+of+T4+lysozyme.">Cavity as a source of conformational fluctuation and high-energy state: High-pressure NMR study of a cavity-enlarged mutant of T4 lysozyme.</a> Biophysical Journal. 108, 133-145 (2015).</li><li>Peterson, R. W., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-contained+high-pressure+cell,+apparatus,+and+procedure+for+the+preparation+of+encapsulated+proteins+dissolved+in+low+viscosity+fluids+for+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy.">Self-contained high-pressure cell, apparatus, and procedure for the preparation of encapsulated proteins dissolved in low viscosity fluids for nuclear magnetic resonance spectroscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 76, 094101 (2005).</li><li>Goddard, T. D., Kneller, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sparky 3. , (2010).</li><li>Caro, J. A., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+aspects+of+high-pressure+NMR+spectroscopy+and+its+applications+in+protein+biophysics+and+structural+biology.">Practical aspects of high-pressure NMR spectroscopy and its applications in protein biophysics and structural biology.</a> Methods. 148, 67-80 (2018).</li><li>Kitamura, T., Itoh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+volume+of+protonic+ionization+for+buffering+agents.+Prediction+of+pressure+dependence+of+pH+and+pOH.">Reaction volume of protonic ionization for buffering agents. Prediction of pressure dependence of pH and pOH.</a> Journal of Solution Chemistry. 16, 715-725 (1987).</li><li>Royer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+volume+changes+in+pressure-induced+protein+unfolding.">Revisiting volume changes in pressure-induced protein unfolding.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1595, 201-209 (2002).</li><li>Erlach, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+nonliner+pressure-induced+chemical+shift+changes+and+thermodynamic+parameters.">Relationship between nonliner pressure-induced chemical shift changes and thermodynamic parameters.</a> Journal of Physical Chemistry B. 118, 5681-5690 (2014).</li><li>de Oliveira, G. A. P., Silva, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hypothesis+to+reconcile+the+physical+and+chemical+unfolding+of+proteins.">A hypothesis to reconcile the physical and chemical unfolding of proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States of America. 112, 2775-2784 (2015).</li><li>Nguyen, L. M., Roche, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pressure+NMR+techniques+for+the+study+of+protein+dynamics,+folding+and+aggregation.">High-pressure NMR techniques for the study of protein dynamics, folding and aggregation.</a> Journal of Magnetic Resonance. 277, 179-185 (2017).</li></ol>

この研究では、圧力摂動に対するタンパク質構造および熱力学応答をプローブするために実装されたプロトコルを詳述する。ここでRRM2に記録された高圧実験は、非完全に協力的な展開を示すΔVU値の大きな変動が、比較的小さな単一ドメインタンパク質に見つけることができることを示しています。同様の画像は、圧力下での1H化学シフト変化の分析から浮かび上がる。なお?...

タンパク質およびタンパク質複合体の高エネルギー、まばらな立体構造状態が、多くの生物学的経路1、2、3において重要な役割を果たすことが長い間認識されてきた。Carr-パーセル-Meiboom-Gill (CPMG)4、化学交換飽和伝達(CEST)5、および暗い状態交換飽和伝達(DEST)6パルス配列(とりわけ)に基づく実験のおかげで、溶液NMR分光法は、一過性の立体状態を特徴付けるための選択肢として出現した7。これらの実験に加えて、温度、pH、または化学変性物質などの摂動を導入して、より高いエネルギー立体構造サブステイトの相対的集団を増加させることができる。同様に、タンパク質平衡は、高い静水圧を加えることによっても摂動することができる。対応する立体構造変化に伴う体積変化の大きさに応じて、数百から数千のバーの圧力の増加は、より高いエネルギー状態を有意に安定させ、またはタンパク質が8、9、10を完全に展開する原因となる。タンパク質NMRスペクトルは、通常、静水圧で2種類の変化を表示する:(i)化学シフト変化および(ii)ピーク強度変化。化学シフトの変化は、タンパク質表面水界面における変化および/またはタンパク質構造の局所圧縮を速い時間スケール(NMR時間スケールに対する)11に反映する。大きな非線形化学シフト圧力依存性を示すクロスピークは、より高いエネルギー立体構造状態12,13の存在を示すことができる。一方、ピーク強度の変化は、折り畳まれた状態/展開された状態の人口の変化など、遅い時間スケールでの主要な立体構造遷移を指します。フォールディング中間体または高いエネルギー状態の存在は、所与のタンパク質14、15、16、17の異なる残基について測定された展開時の体積変化の大きさの大きな変動から検出することができる。我々の経験に基づいて、通常2状態フォルダとして分類される小さなタンパク質でさえ、圧力に対する不均一な応答を示し、局所的な折りたたみの安定性に関する有用な情報を提供します。ここで説明するアミドピーク強度および1H化学シフト圧力依存の取得及び分析のためのプロトコルは、異種核リボヌクレオプロテインA1(hnRNPA1)の単離されたRNA認識モチーフ2(RRM2)をモデルタンパク質として用いる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar</td>
			<td>Daedalus Innovations LLC</td>
			<td>NMRCELL-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparky3</td>
			<td>University of California San Francisco, CA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xtreme-60 Syringe pump</td>
			<td>Daedalus Innovations LLC</td>
			<td>XTREME-60</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-pressure nmr experiments for detecting protein low-lying conformational states

高圧は、球状タンパク質を不安定化させ、タンパク質複合体を可逆的に解化するために使用できる、よく知られた摂動法です。静水圧は、熱力学的平衡を、より低いモル体積の状態に向かって駆動します。圧力の上昇は、したがって、球状タンパク質の安定性とタンパク質複合体のオリゴマー化平衡を細かく調整する機会を提供します。高圧NMR実験は、NMR分光法の溶液によって提供される圧力摂動の微細な安定性調整能力と部位分解能を組み合わせることにより、球状タンパク質の安定性、その折りたたみ機構、およびオリゴマー化メカニズムを支配する因子の詳細な特徴付けが可能になります。ここでは、1バーから2.5kbarまで記録された2D 1H-15N実験のセットを介してタンパク質の局所的な折りたたみ安定性をプローブするプロトコルを提示する。このような実験の取得および分析に必要なステップは、hnRNPA1のRRM2ドメイン上で取得したデータと共に示されている。

ここで説明するプロトコルは、2.5kbar範囲(>90%)内でほぼ完全に展開されたhnRNPA1(残基95〜106)の第2RNA認識モチーフであるRRM2の圧力依存性をプローブするために使用した。1H-15Nスペクトルは、1バー、500バー、750バー、1 kbar、1.5 kbar、2 kbar、および2.5kbarで収集した(図2)。2.5 kbarのノイズレベルより上に現れたクロスピークはどれも見えなかったので、対応する?...

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High-Pressure NMR Experiments for Detecting Protein Low-Lying Conformational States

高圧セルの組み立て、高圧NMR実験の設定と記録に必要なステップの詳細な説明を提供し、最後に圧力下でのピーク強度と化学シフトの両方の変化を分析します。これらの実験は、タンパク質の折りたたみ経路と構造安定性に関する貴重な洞察を提供することができます。

低層構造状態のタンパク質検出のための高圧NMR実験

High-pressure is a well-known perturbation method that can be used to destabilize globular proteins and dissociate protein complexes in a reversible ...

高圧は、タンパク質立体構造サンプルの相対集団を変化させる方法です。高エネルギーの立体構造状態を特定し、特徴付けるための非常に有用です。pHや温度などのすべての摂動方法と比較すると、圧力摂動は適用しやすく、完全に可逆的です。また、主にガラスの空洞や空隙体積を有する領域に影響を与える局所的な摂動である。まず、ガラスピペットを使用してジルコニアチューブに窒素15標識サンプルを導入し、チューブの底部のサンプルシートを確認します。サンプルが透過液と混合するのを防ぐには、サンプルを200マイクロリットルの鉱物油で重ね、残りのチューブに透過液を充填します。ジルコニアチューブの上に使い捨てのOリングを置き、ベースにチューブをスライドさせます。次に、チューブを高圧テザーラインに接続し、手でセルにベースを締めます。次に、14.7ニュートンメートルのトルクを適用して、低圧での漏れを防ぎます。圧力セルアセンブリの完全性を確認するには、細胞支持体と格納容器を使用して、分光計の外に最大300本のバーを加圧します。15分後、圧力を1つのバーにリセットし、きれいな糸くずのない拭き取りで漏れをチェックします。テザーラインを慎重に導いて、無加圧チューブを分光器に挿入します。チューブがサンプルの座っている位置に到達するまで、管を分光計に差し込む。プロチウムと窒素チャネルをロック、シム、マッチング、チューニングし、最適化されたシムを将来のために保存します。横方向緩和最適化分光法をヘテロ単一量子コヒーレント分光法で設定し、大気条件での基準実験の記録を進めます。500本ごとに1つのバーから2.5キロバーまでの一連の2D実験を記録します。正確な折りたたみ速度または展開率がわかっている場合は、500 本のバーの増分を行った後、サンプルを 15 ~ 20 分間平衡させます。折り畳みまたは展開遷移の変曲点が到達したら、フィットの精度を向上させるために追加の実験を記録します。このプロトコルは、RRM2の圧力依存性をプローブするために使用された、第2のRNA認識モチーフ不均一核リボヌクレオプロテインA1。横方向緩和最適化分光法ヘテロ単一量子コヒーレンス分光スペクトルを用いて、1つの棒、1.5キロバー、2キロバー、および2.5キロバーで収集した。RRM2は2.5キロバーの範囲内でほぼ完全に展開される。個々の圧力強度プロファイルは、ここで示す式に従って適合し、展開反応に関連する標準的なGibbs自由エネルギーおよび体積の対応する変化を得た。ドメイン構造にマッピングすると、体積変化の大きさが最も大きい残基がドメイン構造コア内で見つかり、体積変化の最も大きさが小さいものは、主にベータ鎖とC端子ヘリクスとの間の接続ループに位置していた。折り畳まれた状態アンサンブルの圧縮性および立体構造の不均一性の程度を調査するために、プロチウム化学シフトを分析した。圧力の関数としてのプロチウム化学シフトの個々のプロファイルは、示された式を用いて適合し、部位特異的線形および非線形係数を抽出した。非線形係数が最も大きい残基は主にドメインの構造コアに見られ、非線形係数が最も小さい残基は、異なる構造モチーフを結ぶループ内に位置していました。漏れを防ぐために、管を正しく設定する圧力として設定することが重要です。漏れが発生した場合、おそらく鉱物油の痕跡をクリーンアップするためにプローブを取り外す必要があります。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成します<em&gt;インビトロ</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

膜蛋白質の構造解析および経験的モデリング中性子小角散乱実験でコントラストに一致する洗剤

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

細胞間の接触でタンパク質間相互作用の分析計蛍光の変動

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

蛍光顕微鏡を使用して競争力のある滴定による転写因子の DNA 結合親和性の高感度測定

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

キメラ蛋白質の構築による機能性タンパク質領域の同定

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

単一分子トラッキング顕微鏡 - 細胞細胞分子の拡散状態を決定するツール

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

組み合わせ単一ドメイン抗体ライブラリーの段階的ファージ選択による高特異的化学的誘起タンパク質二量体化システムの作成

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

膜蛋白質相互作用解析用のネイティブ細胞膜ナノ粒子システム

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

連続結晶構造解析実験のためのエンドチアペプシン結晶の成長の最適化

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

NMRベースのフラグメントスクリーニングは、最小サンプルで最大限の自動化モードで

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...