Name: high-pressure nmr experiments for detecting protein low-lying conformational states
Uploaded: 2021-06-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Pressure NMR Experiments for Detecting Protein Low-Lying Conformational States at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av midler fra Roy J. Carver Charitable Trust til Julien Roche. Vi takker J. D. Levengood og B. S. Tolbert for vennlig å gi RRM2-prøven.

MERK: Protokollen som er beskrevet her krever (i) en høytrykkspumpe og celle med et 2,5 kbar-klassifisert aluminiums-herdet zirkoniarør18, (ii) programvaren SPARKY19 for analyse av NMR-spektraet, og (iii) en programvare for kurvetilpasning.
1. Prøvepreparering, montering av høytrykkscellen og oppsett av forsøkene.
<ol><li>Valg av buffer: Bruk lik blanding av anioniske og kationiske buffere, for eksempel fosfat og Tris20</...

<ol>
	<li>Alderson, R. T., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+invisible+protein+states+with+NMR+spectroscopy.">Unveiling invisible protein states with NMR spectroscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 60, 39-49 (2020).</li><li>Korzhnev, D. M., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=probing+invisible,+low-populated+states+of+protein+molecules+by+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy:+An+application+to+protein+folding.">probing invisible, low-populated states of protein molecules by relaxation dispersion NMR spectroscopy: An application to protein folding.</a> Accounts of Chemical Research. 41, 442-451 (2008).</li><li>Loria, P. J., Berlow, R. B., Watt, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+enzyme+motions+by+solution+NMR+relaxation+dispersion.">Characterization of enzyme motions by solution NMR relaxation dispersion.</a> Accounts of Chemical Research. 41, 214-221 (2008).</li><li>Ishima, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CPMG+relaxation+dispersion.">CPMG relaxation dispersion.</a> Methods in Molecular Biology. 1084, 29-49 (2014).</li><li>Longo, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+exchange+saturation+transfer+(CEST):+an+efficient+tool+for+detecting+molecular+information+on+proteins'+behaviour.">Chemical exchange saturation transfer (CEST): an efficient tool for detecting molecular information on proteins' behaviour.</a> Analyst. 39, 2687-2690 (2014).</li><li>Fawzi, N. L., Ying, J., Torchia, D. A., Clore, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+exchange+kinetics+and+atomic+resolution+dynamics+in+high-molecular-weight+complexes+using+dark-state+exchange+saturation+transfer+NMR+spectroscopy.">Probing exchange kinetics and atomic resolution dynamics in high-molecular-weight complexes using dark-state exchange saturation transfer NMR spectroscopy.</a> Nature Protocols. 7, 1523-1533 (2012).</li><li>Anthis, N. J., Clore, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+transient+dark+states+by+NMR+spectroscopy.">Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48, 35-116 (2015).</li><li>Roche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavities+determine+the+pressure+unfolding+of+proteins.">Cavities determine the pressure unfolding of proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 6945-6950 (2012).</li><li>Chen, C. R., Makhatadze, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinant+of+the+effects+of+hydrostatic+pressure+on+protein+folding+stability.">Molecular determinant of the effects of hydrostatic pressure on protein folding stability.</a> Nature Communications. 8, 14561 (2017).</li><li>Roche, J., Royer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+pressure+denaturation+of+proteins.">Lessons from pressure denaturation of proteins.</a> Journal of the Royal Society Interface. 15, 20180244 (2018).</li><li>Xu, X., Gagn&#233;, D., Aramini, J. M., Gardner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+and+compressibility+differences+between+protein+conformations+revealed+by+high-pressure+NMR.">Volume and compressibility differences between protein conformations revealed by high-pressure NMR.</a> Biophysical Journal. 120, 924-935 (2021).</li><li>Akasaka, K., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-lying+excited+states+of+proteins+revealed+from+non-linear+pressure+shifts+in+1H+and+15N+NMR.">Low-lying excited states of proteins revealed from non-linear pressure shifts in 1H and 15N NMR.</a> Biochemistry. 40, 8665-8671 (2001).</li><li>Akasaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+conformational+fluctuation+of+proteins+by+pressure+perturbation.">Probing conformational fluctuation of proteins by pressure perturbation.</a> Chemical Reviews. 106, 1814-1835 (2006).</li><li>Kitahara, R., Yokoyama, S., Akasaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+snapshots+of+a+fluctuating+protein+structure:+ubiquitin+at+30+bar-3+kbar.">NMR snapshots of a fluctuating protein structure: ubiquitin at 30 bar-3 kbar.</a> Journal of Molecular Biology. 347, 277-285 (2005).</li><li>Roche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=remodeling+of+the+folding+free+energy+landscape+of+Staphylococcal+nuclease+by+cavity-creating+mutations.">remodeling of the folding free energy landscape of Staphylococcal nuclease by cavity-creating mutations.</a> Biochemistry. 51, 9535-9546 (2012).</li><li>Nucci, N. V., Fuglestad, B., Athanasoula, E. A., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cavities+and+hydration+in+the+pressure+unfolding+of+T4+lysozyme.">Role of cavities and hydration in the pressure unfolding of T4 lysozyme.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13846-13851 (2014).</li><li>Maeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavity+as+a+source+of+conformational+fluctuation+and+high-energy+state:+High-pressure+NMR+study+of+a+cavity-enlarged+mutant+of+T4+lysozyme.">Cavity as a source of conformational fluctuation and high-energy state: High-pressure NMR study of a cavity-enlarged mutant of T4 lysozyme.</a> Biophysical Journal. 108, 133-145 (2015).</li><li>Peterson, R. W., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-contained+high-pressure+cell,+apparatus,+and+procedure+for+the+preparation+of+encapsulated+proteins+dissolved+in+low+viscosity+fluids+for+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy.">Self-contained high-pressure cell, apparatus, and procedure for the preparation of encapsulated proteins dissolved in low viscosity fluids for nuclear magnetic resonance spectroscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 76, 094101 (2005).</li><li>Goddard, T. D., Kneller, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sparky 3. , (2010).</li><li>Caro, J. A., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+aspects+of+high-pressure+NMR+spectroscopy+and+its+applications+in+protein+biophysics+and+structural+biology.">Practical aspects of high-pressure NMR spectroscopy and its applications in protein biophysics and structural biology.</a> Methods. 148, 67-80 (2018).</li><li>Kitamura, T., Itoh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+volume+of+protonic+ionization+for+buffering+agents.+Prediction+of+pressure+dependence+of+pH+and+pOH.">Reaction volume of protonic ionization for buffering agents. Prediction of pressure dependence of pH and pOH.</a> Journal of Solution Chemistry. 16, 715-725 (1987).</li><li>Royer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+volume+changes+in+pressure-induced+protein+unfolding.">Revisiting volume changes in pressure-induced protein unfolding.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1595, 201-209 (2002).</li><li>Erlach, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+nonliner+pressure-induced+chemical+shift+changes+and+thermodynamic+parameters.">Relationship between nonliner pressure-induced chemical shift changes and thermodynamic parameters.</a> Journal of Physical Chemistry B. 118, 5681-5690 (2014).</li><li>de Oliveira, G. A. P., Silva, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hypothesis+to+reconcile+the+physical+and+chemical+unfolding+of+proteins.">A hypothesis to reconcile the physical and chemical unfolding of proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States of America. 112, 2775-2784 (2015).</li><li>Nguyen, L. M., Roche, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pressure+NMR+techniques+for+the+study+of+protein+dynamics,+folding+and+aggregation.">High-pressure NMR techniques for the study of protein dynamics, folding and aggregation.</a> Journal of Magnetic Resonance. 277, 179-185 (2017).</li></ol>

Denne studien beskriver en protokoll implementert for å undersøke proteinstrukturelle og termodynamikkresponser på trykkperturbasjon. Høytrykkseksperimentene som er registrert her på RRM2, viser at store variasjoner i ΔVU-verdier, som indikerer ikke-fullt samarbeidsvillig utfoldelse, finnes i et relativt lite enkelt domeneprotein. Et lignende bilde kommer ut av analysen av 1H kjemiske skiftendringer under trykk. Det skal bemerkes kalbitzer og kolleger har vist at en mer dyptgående analyse av ...

Det har lenge vært anerkjent at høyere energi, tynt befolkede konformasjonstilstander av proteiner og proteinkomplekser spiller en nøkkelrolle i mange biologiske veier1,2,3. Takket være eksperimenter basert på Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)4, Chemical Exchange Saturation Transfer (CEST)5, og mørk-tilstand utveksling metningsoverføring (DEST)6 pulssekvenser (blant annet), løsning NMR spektroskopi har dukket opp som en metode for valg for karakterisering av forbigående konformasjonstilstander7. Sammen med disse eksperimentene kan perturbasjoner som temperatur, pH eller kjemiske denaturer innføres for å øke den relative populasjonen av høyere energikonformasjonstilstander. På samme måte kan proteinlikevekter også bli forstyrret ved å bruke høyt hydrostatisk trykk. Avhengig av størrelsen på volumendringen forbundet med de tilsvarende konformasjonsendringene, kan en økning av trykket med noen få hundre til noen få tusen barer stabilisere en høyere energitilstand eller føre til at et protein helt utfolder seg8,9,10. Protein NMR spektra viser vanligvis to typer endringer med hydrostatisk trykk: (i) kjemiske skiftendringer og (ii) toppintensitetsendringer. Kjemiske skiftendringer gjenspeiler endringer i proteinoverflatevanngrensesnittet og/eller lokal kompresjon av proteinstrukturen på rask tidsskala (i forhold til NMR-tidsskala)11. Crosspeaks som viser store ikke-lineære kjemiske skift trykkavhengighet kan indikere tilstedeværelsen av høyere energikonformasjonstilstander12,13. På den annen side peker endringer i toppintensiteten på store konformasjonsoverganger på en langsom tidsskala, for eksempel endringer i brettede/utfoldede tilstandspopulasjoner. Tilstedeværelsen av sammenleggbare mellomprodukter eller høyere energitilstander kan påvises fra store variasjoner i volumendringens størrelse ved utfoldelse målt for forskjellige rester av et gitt protein14,15,16,17. Basert på vår erfaring viser selv små proteiner som vanligvis er klassifisert som tostatsmapper ikke-ensartede respons på trykk, noe som gir nyttig informasjon om deres lokale foldestabilitet. Beskrevet her er en protokoll for oppkjøp og analyse av blant toppintensitet og 1H kjemiske skift trykkavhengighet, ved hjelp av som modellprotein det isolerte RNA-anerkjennelsesmotivet 2 (RRM2) av det heterogene kjernefysiske ribonukleoproteinet A1 (hnRNPA1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar</td>
			<td>Daedalus Innovations LLC</td>
			<td>NMRCELL-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparky3</td>
			<td>University of California San Francisco, CA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xtreme-60 Syringe pump</td>
			<td>Daedalus Innovations LLC</td>
			<td>XTREME-60</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-pressure nmr experiments for detecting protein low-lying conformational states

Høyt trykk er en velkjent perturbasjonsmetode som kan brukes til å destabilisere kuleproteiner og dissosiere proteinkomplekser på en reversibel måte. Hydrostatisk trykk driver termodynamisk likevekt mot staten(e) med lavere molarvolum. Økende trykk gir derfor mulighetene til å finjustere stabiliteten til kulelige proteiner og oligomeriseringslikevekten til proteinkomplekser. Høytrykks NMR-eksperimenter tillater en detaljert karakterisering av faktorene som styrer stabiliteten til kuleformede proteiner, deres foldemekanismer og oligomeriseringsmekanismer ved å kombinere den fine stabilitetsjusteringsevnen til trykkperturbasjon og stedsoppløsningen som tilbys av løsning NMR-spektroskopi. Her presenterer vi en protokoll for å sondere den lokale foldestabiliteten til et protein via et sett med 2D 1H-15N eksperimenter registrert fra 1 bar til 2,5 kbar. Trinnene som kreves for innsamling og analyse av slike eksperimenter er illustrert med data innhentet på RRM2-domenet til hnRNPA1.

Protokollen beskrevet her ble brukt til å sondere trykkavhengigheten til RRM2, det andre RNA-anerkjennelsesmotivet til hnRNPA1 (rester 95-106), som nesten er helt utfoldet innenfor 2,5 kbarområdet (>90%). 1 H-15N spektra ble samlet inn i 1 bar, 500 bar, 750 bar, 1 kbar, 1,5 kbar, 2 kbar og 2,5 kbar (figur 2). Siden ingen av de innfødte krysspeakene var synlige over støynivået på 2,5 kbar, ble alle tilsvarende rester tilskrevet en intensitetsverdi på 0 ved dette t...

Watch this Scientific Journal Video about High-Pressure NMR Experiments for Detecting Protein Low-Lying Conformational States at JoVE.com

High-Pressure NMR Experiments for Detecting Protein Low-Lying Conformational States

Vi gir en detaljert beskrivelse av trinnene som kreves for å montere en høytrykkscelle, sette opp og registrere høytrykks NMR-eksperimenter, og til slutt analysere både toppintensitet og kjemiske skiftendringer under trykk. Disse eksperimentene kan gi verdifull innsikt i foldeveiene og strukturell stabilitet av proteiner.

Høytrykks NMR-eksperimenter for å oppdage protein lavtliggende konformasjonstilstander

High-pressure is a well-known perturbation method that can be used to destabilize globular proteins and dissociate protein complexes in a reversible ...

Høyt trykk er den valgte metoden for å endre den relative populasjonen av en proteinkonformasjonsprøve. Det er ekstremt nyttig for å isolere og karakterisere høyenergikonformasjonstilstander. Sammenlignet med alle perturbasjonsmetodene, som pH eller temperatur, er trykkperturbasjon lett å påføre og fullt reversibel.Det er også en lokal perturbasjon, som hovedsakelig påvirker regioner med glasshuler eller tomromsvolumer. Til å begynne med, introduser den nitrogen-15-merkede prøven i zirkonia-røret ved hjelp av en glasspipette, og sørg for prøvesetene nederst på røret. For å forhindre at prøven blandes med transmisjonsvæsken, legg over prøven med 200 mikroliter mineralolje, og fyll deretter resten av røret med overføringsvæske.Sett en engangs O-ring på toppen av zirkoniarøret og skyv røret inn i basen. Koble deretter røret til høytrykkslenkelinjen og stram basen til cellen for hånd. Påfør deretter 14,7 newtonmeter dreiemoment for å forhindre lekkasjer ved lavere trykk.For å kontrollere integriteten til trykkcelleenheten, trykk røret opp til 300 barer utenfor spektrometeret ved hjelp av cellestøtte og inneslutningsbeholder. Etter 15 minutter tilbakestiller du trykket til en bar og ser etter lekkasjer med en ren lofri klut. Sett det trykksatte røret inn i spektrometeret ved å føre tetherlinjen forsiktig.Skyv røret inn i spektrometeret til røret når prøvestilling. Lås, shim, match og still inn protium- og nitrogenkanalene og lagre de optimaliserte avstandsskivene for fremtiden. Sett opp tverrgående avslapning optimalisert spektroskopi med hetero enkelt-kvante sammenhengende spektroskopi og fortsett med å registrere et referanseeksperiment under atmosfæriske forhold.Ta opp en serie med 2D-eksperimenter fra én stolpe til 2,5 kilobar for hver 500 stolper. Hvis de nøyaktige foldings- eller utfoldelseshastighetene er kjent, la prøven likevekt i 15 til 20 minutter etter hver 500 stolpers økning. Når bøyningspunktet for folding eller utfoldende overgang når, registrer flere eksperimenter for å forbedre presisjonen til passformen.Denne protokollen ble brukt til å undersøke trykkavhengigheten til RRM2, det andre RNA-anerkjennelsesmotivet heterogent kjernefysisk ribonukleoprotein A1. Tverrgående avslapningsoptimalisert spektroskopi med hetero enkelt-kvante koherensspektroskopispektra ble samlet inn på en bar, 1,5 kilobar, to kilobarer og 2,5 kilobarer. RRM2 er nesten helt utfoldet innenfor 2,5 kilobar rekkevidde. Individuelle trykkintensitetsprofiler ble montert i henhold til ligningen som er vist her, for å oppnå de tilsvarende endringene i standard Gibbs fri energi og volum knyttet til den utfoldende reaksjonen.Når de ble kartlagt på domenestrukturen, ble rester med størst volumendringsstørrelse funnet i domenestrukturkjernen, mens de med den minste størrelsen på volumendring hovedsakelig var plassert i koblingsløkkene mellom betastrengene og betastrengen til C-terminal helixen. For å undersøke graden av komprimerbarhet og konformasjons heterogenitet i det brettede tilstandsensemblet, ble protiumkjemiske skift analysert. Individuelle profiler av protium kjemiske skift som en funksjon av trykk ble montert ved hjelp av ligningen vist, for å trekke ut de stedsspesifikke lineære og ikke-lineære koeffisientene.Rester med de største ikke-lineære koeffisientene ble for det meste funnet i den strukturelle kjernen av domenet, mens rester med de minste ikke-lineære koeffisientene for det meste var plassert innenfor løkker som forbinder de forskjellige strukturelle motivene. Det er viktig å sette opp røret som et trykksett riktig, for å forhindre lekkasjer. Hvis det oppstår en lekkasje, må sonden sannsynligvis fjernes for å rydde opp spor av mineralolje.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Kontrast-samsvarende vaskemiddel i liten vinkel Neutron spredning eksperimenter for membran Protein strukturell analyse og Ab Initio modellering

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens svingninger spektroskopi analysen av Protein-Protein interaksjoner i celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høy følsomhet måling av transkripsjon faktor-DNA Binding slektskap av konkurransedyktige titrering bruker fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Identifikasjon av funksjonelle Protein områder gjennom Chimeric Protein konstruksjon

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-molekylet Tracking mikroskopi-et verktøy for fastsettelse av Diffusive statene cytosolic molekyler

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Opprette svært spesifikke kjemisk indusert protein Dimerization Systems av trinnvis Phage utvalg av Kombinatorisk single-Domain antistoff bibliotek

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Native Cell Membran Nanopartikler System for membran Protein-Protein Interaksjon Analyse

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Optimalisering av veksten av endothiapepsinkrystaller for serielle krystallografieksperimenter

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

NMR-basert fragmentscreening i et minimumsutvalg, men maksimal automatiseringsmodus

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...