Name: high-pressure nmr experiments for detecting protein low-lying conformational states
Uploaded: 2021-06-29T14:30:00
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Este trabajo fue apoyado por fondos del Roy J. Carver Charitable Trust a Julien Roche. Agradecemos a J. D. Levengood y B. S. Tolbert por proporcionar amablemente la muestra RRM2.

NOTA: El protocolo descrito aquí requiere (i) una bomba y celda de alta presión con un tubo de zirconia templado en aluminio de 2,5 kbar18,(ii) el software SPARKY19 para el análisis de los espectros de RMN, y (iii) un software de ajuste de curvas.
1. Preparación de la muestra, montaje de la celda de alta presión y puesta en preparación de los experimentos.
<ol><li>Elección del tampón: Utilice la misma mezcla de tampones aniónicos y cat...

<ol>
	<li>Alderson, R. T., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+invisible+protein+states+with+NMR+spectroscopy.">Unveiling invisible protein states with NMR spectroscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 60, 39-49 (2020).</li><li>Korzhnev, D. M., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=probing+invisible,+low-populated+states+of+protein+molecules+by+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy:+An+application+to+protein+folding.">probing invisible, low-populated states of protein molecules by relaxation dispersion NMR spectroscopy: An application to protein folding.</a> Accounts of Chemical Research. 41, 442-451 (2008).</li><li>Loria, P. J., Berlow, R. B., Watt, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+enzyme+motions+by+solution+NMR+relaxation+dispersion.">Characterization of enzyme motions by solution NMR relaxation dispersion.</a> Accounts of Chemical Research. 41, 214-221 (2008).</li><li>Ishima, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CPMG+relaxation+dispersion.">CPMG relaxation dispersion.</a> Methods in Molecular Biology. 1084, 29-49 (2014).</li><li>Longo, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+exchange+saturation+transfer+(CEST):+an+efficient+tool+for+detecting+molecular+information+on+proteins'+behaviour.">Chemical exchange saturation transfer (CEST): an efficient tool for detecting molecular information on proteins' behaviour.</a> Analyst. 39, 2687-2690 (2014).</li><li>Fawzi, N. L., Ying, J., Torchia, D. A., Clore, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+exchange+kinetics+and+atomic+resolution+dynamics+in+high-molecular-weight+complexes+using+dark-state+exchange+saturation+transfer+NMR+spectroscopy.">Probing exchange kinetics and atomic resolution dynamics in high-molecular-weight complexes using dark-state exchange saturation transfer NMR spectroscopy.</a> Nature Protocols. 7, 1523-1533 (2012).</li><li>Anthis, N. J., Clore, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+transient+dark+states+by+NMR+spectroscopy.">Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48, 35-116 (2015).</li><li>Roche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavities+determine+the+pressure+unfolding+of+proteins.">Cavities determine the pressure unfolding of proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 6945-6950 (2012).</li><li>Chen, C. R., Makhatadze, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinant+of+the+effects+of+hydrostatic+pressure+on+protein+folding+stability.">Molecular determinant of the effects of hydrostatic pressure on protein folding stability.</a> Nature Communications. 8, 14561 (2017).</li><li>Roche, J., Royer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+pressure+denaturation+of+proteins.">Lessons from pressure denaturation of proteins.</a> Journal of the Royal Society Interface. 15, 20180244 (2018).</li><li>Xu, X., Gagn&#233;, D., Aramini, J. M., Gardner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+and+compressibility+differences+between+protein+conformations+revealed+by+high-pressure+NMR.">Volume and compressibility differences between protein conformations revealed by high-pressure NMR.</a> Biophysical Journal. 120, 924-935 (2021).</li><li>Akasaka, K., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-lying+excited+states+of+proteins+revealed+from+non-linear+pressure+shifts+in+1H+and+15N+NMR.">Low-lying excited states of proteins revealed from non-linear pressure shifts in 1H and 15N NMR.</a> Biochemistry. 40, 8665-8671 (2001).</li><li>Akasaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+conformational+fluctuation+of+proteins+by+pressure+perturbation.">Probing conformational fluctuation of proteins by pressure perturbation.</a> Chemical Reviews. 106, 1814-1835 (2006).</li><li>Kitahara, R., Yokoyama, S., Akasaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+snapshots+of+a+fluctuating+protein+structure:+ubiquitin+at+30+bar-3+kbar.">NMR snapshots of a fluctuating protein structure: ubiquitin at 30 bar-3 kbar.</a> Journal of Molecular Biology. 347, 277-285 (2005).</li><li>Roche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=remodeling+of+the+folding+free+energy+landscape+of+Staphylococcal+nuclease+by+cavity-creating+mutations.">remodeling of the folding free energy landscape of Staphylococcal nuclease by cavity-creating mutations.</a> Biochemistry. 51, 9535-9546 (2012).</li><li>Nucci, N. V., Fuglestad, B., Athanasoula, E. A., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cavities+and+hydration+in+the+pressure+unfolding+of+T4+lysozyme.">Role of cavities and hydration in the pressure unfolding of T4 lysozyme.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13846-13851 (2014).</li><li>Maeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavity+as+a+source+of+conformational+fluctuation+and+high-energy+state:+High-pressure+NMR+study+of+a+cavity-enlarged+mutant+of+T4+lysozyme.">Cavity as a source of conformational fluctuation and high-energy state: High-pressure NMR study of a cavity-enlarged mutant of T4 lysozyme.</a> Biophysical Journal. 108, 133-145 (2015).</li><li>Peterson, R. W., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-contained+high-pressure+cell,+apparatus,+and+procedure+for+the+preparation+of+encapsulated+proteins+dissolved+in+low+viscosity+fluids+for+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy.">Self-contained high-pressure cell, apparatus, and procedure for the preparation of encapsulated proteins dissolved in low viscosity fluids for nuclear magnetic resonance spectroscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 76, 094101 (2005).</li><li>Goddard, T. D., Kneller, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sparky 3. , (2010).</li><li>Caro, J. A., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+aspects+of+high-pressure+NMR+spectroscopy+and+its+applications+in+protein+biophysics+and+structural+biology.">Practical aspects of high-pressure NMR spectroscopy and its applications in protein biophysics and structural biology.</a> Methods. 148, 67-80 (2018).</li><li>Kitamura, T., Itoh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+volume+of+protonic+ionization+for+buffering+agents.+Prediction+of+pressure+dependence+of+pH+and+pOH.">Reaction volume of protonic ionization for buffering agents. Prediction of pressure dependence of pH and pOH.</a> Journal of Solution Chemistry. 16, 715-725 (1987).</li><li>Royer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+volume+changes+in+pressure-induced+protein+unfolding.">Revisiting volume changes in pressure-induced protein unfolding.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1595, 201-209 (2002).</li><li>Erlach, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+nonliner+pressure-induced+chemical+shift+changes+and+thermodynamic+parameters.">Relationship between nonliner pressure-induced chemical shift changes and thermodynamic parameters.</a> Journal of Physical Chemistry B. 118, 5681-5690 (2014).</li><li>de Oliveira, G. A. P., Silva, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hypothesis+to+reconcile+the+physical+and+chemical+unfolding+of+proteins.">A hypothesis to reconcile the physical and chemical unfolding of proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States of America. 112, 2775-2784 (2015).</li><li>Nguyen, L. M., Roche, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pressure+NMR+techniques+for+the+study+of+protein+dynamics,+folding+and+aggregation.">High-pressure NMR techniques for the study of protein dynamics, folding and aggregation.</a> Journal of Magnetic Resonance. 277, 179-185 (2017).</li></ol>

Este estudio detalla un protocolo implementado para sondear las respuestas estructurales y termodinámicas de las proteínas a la perturbación de la presión. Los experimentos de alta presión registrados aquí en RRM2 demuestran que se pueden encontrar grandes variaciones en los valores de ΔVU, indicativos de un despliegue no totalmente cooperativo, en una proteína de dominio único relativamente pequeña. Una imagen similar surge del análisis de los cambios de cambio químico de 1H bajo presi?...

Durante mucho tiempo se ha reconocido que los estados conformacionales de mayor energía y escasamente poblados de proteínas y complejos de proteínas desempeñan un papel clave en muchas vías biológicas1,2,3. Gracias a experimentos basados en secuencias de pulsos Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)4,Chemical Exchange Saturation Transfer (CEST)5y dark-state exchange saturation transfer (DEST)6 (entre otras), la espectroscopia de RMN en solución ha surgido como un método de elección para caracterizar estados conformacionales transitorios7. Junto con estos experimentos, se pueden introducir perturbaciones como la temperatura, el pH o los desnaturalizantes químicos para aumentar la población relativa de subestados conformacionales de mayor energía. Del mismo modo, los equilibrios de proteínas también pueden ser perturbados mediante la aplicación de alta presión hidrostática. Dependiendo de la magnitud del cambio de volumen asociado con los cambios conformacionales correspondientes, un aumento de la presión de unos pocos cientos a unos pocos miles de bares puede estabilizar significativamente un estado de energía más alto o hacer que una proteína se despliegue completamente8,9,10. Los espectros de RMN de proteínas suelen mostrar dos tipos de cambios con presión hidrostática: (i) cambios de cambio químico y (ii) cambios de intensidad máxima. Los cambios químicos reflejan cambios en la interfaz proteína superficie-agua y/o compresión local de la estructura de la proteína en una escala de tiempo rápida (en relación con la escala de tiempo de RMN)11. Los cruces que exhiben grandes cambios químicos no lineales la dependencia de la presión pueden indicar la presencia de estados conformacionales de mayor energía12,13. Por otro lado, los cambios de intensidad máxima apuntan a transiciones conformacionales importantes en una escala de tiempo lenta, como cambios en las poblaciones de estados plegados / desplegados. La presencia de intermedios plegables o estados de energía superior se puede detectar a partir de grandes variaciones en la magnitud del cambio de volumen al desplegarse medido para diferentes residuos de una proteína dada14,15,16,17. Según nuestra experiencia, incluso las proteínas pequeñas que generalmente se clasifican como carpetas de dos estados exhiben respuestas no uniformes a la presión, lo que proporciona información útil sobre su estabilidad de plegamiento local. Aquí se describe un protocolo para la adquisición y análisis de la intensidad máxima de la amida y la dependencia de la presión de los cambios químicos de 1H, utilizando como proteína modelo el motivo de reconocimiento de ARN aislado 2 (RRM2) de la ribonucleoproteína nuclear heterogénea A1 (hnRNPA1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar</td>
			<td>Daedalus Innovations LLC</td>
			<td>NMRCELL-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparky3</td>
			<td>University of California San Francisco, CA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xtreme-60 Syringe pump</td>
			<td>Daedalus Innovations LLC</td>
			<td>XTREME-60</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-pressure nmr experiments for detecting protein low-lying conformational states

La alta presión es un método de perturbación bien conocido que se puede utilizar para desestabilizar las proteínas globulares y disociar los complejos de proteínas de manera reversible. La presión hidrostática impulsa los equilibrios termodinámicos hacia el estado (s) con el volumen molar más bajo. El aumento de la presión ofrece, por lo tanto, la oportunidad de ajustar finamente la estabilidad de las proteínas globulares y los equilibrios de oligomerización de los complejos de proteínas. Los experimentos de RMN de alta presión permiten una caracterización detallada de los factores que gobiernan la estabilidad de las proteínas globulares, sus mecanismos de plegamiento y los mecanismos de oligomerización mediante la combinación de la capacidad de ajuste de estabilidad fina de la perturbación de la presión y la resolución del sitio ofrecida por la espectroscopia de RMN de solución. Aquí presentamos un protocolo para sondear la estabilidad de plegamiento local de una proteína a través de un conjunto de experimentos 2D 1H-15N registrados desde 1 bar hasta 2.5 kbar. Los pasos necesarios para la adquisición y el análisis de tales experimentos se ilustran con datos adquiridos en el dominio RRM2 de hnRNPA1.

El protocolo aquí descrito se utilizó para sondear la dependencia de la presión de RRM2, el segundo motivo de reconocimiento de ARN de hnRNPA1 (residuos 95-106), que se despliega casi por completo dentro del rango de 2,5 kbar (>90%). 1 Los espectrosH-15N se recogieron a 1 bar, 500 bar, 750 bar, 1 kbar, 1.5 kbar, 2 kbar y 2.5 kbar(Figura 2). Dado que ninguno de los cruces nativos era visible por encima del nivel de ruido a 2,5 kbar, a todos los residuos correspondient...

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High-Pressure NMR Experiments for Detecting Protein Low-Lying Conformational States

Proporcionamos una descripción detallada de los pasos necesarios para ensamblar una celda de alta presión, configurar y registrar experimentos de RMN de alta presión y, finalmente, analizar tanto la intensidad máxima como los cambios de cambio químico bajo presión. Estos experimentos pueden proporcionar información valiosa sobre las vías de plegamiento y la estabilidad estructural de las proteínas.

Experimentos de RMN de alta presión para detectar estados conformacionales de baja altitud de proteínas

High-pressure is a well-known perturbation method that can be used to destabilize globular proteins and dissociate protein complexes in a reversible ...

La alta presión es el método de elección para cambiar la población relativa de una muestra conformacional de proteínas. Es extremadamente útil para aislar y caracterizar estados conformacionales de alta energía. En comparación con todos los métodos de perturbación, como el pH o la temperatura, la perturbación de presión es fácil de aplicar y totalmente reversible.También es una perturbación local, que afecta principalmente a regiones con cavidades de vidrio o volúmenes vacíos. Para comenzar, introduzca la muestra etiquetada con nitrógeno-15 en el tubo de zirconia con una pipeta de vidrio y asegúrese de que la muestra se atraque en la parte inferior del tubo. Para evitar que la muestra se mezcle con el líquido de transmisión, superponga la muestra con 200 microlitros de aceite mineral y luego llene el resto del tubo con líquido de transmisión.Coloque una junta tórica de un solo uso en la parte superior del tubo de zirconia y deslice el tubo en la base. Luego conecte el tubo a la línea de sución de alta presión y apriete la base a la celda a mano. Luego aplique 14.7 newton metros de torque para evitar fugas a menor presión.Para comprobar la integridad del conjunto de la celda de presión, presurice el tubo hasta 300 bares fuera del espectrómetro utilizando el soporte de la celda y el recipiente de contención. Después de 15 minutos, restablezca la presión a un bar y verifique si hay fugas con una toallita limpia y sin pelusa. Inserte el tubo no presurizado en el espectrómetro guiando cuidadosamente la línea de sujeción.Deslice el tubo en el espectrómetro hasta que el tubo alcance la posición de sentado de la muestra. Bloquee, shim, combine y ajuste los canales de protio y nitrógeno y guarde los shims optimizados para el futuro. Configure la espectroscopia optimizada para la relajación transversal con espectroscopia coherente hetero cuántico único y proceda a registrar un experimento de referencia en las condiciones atmosféricas.Registre una serie de experimentos 2D desde una barra hasta 2,5 kilobares por cada 500 barras. Si se conocen las tasas precisas de plegado o despliegue, después de cada incremento de 500 barras, deje que la muestra se equilibre durante 15 a 20 minutos. Cuando alcance el punto de inflexión de la transición de plegado o despliegue, registre experimentos adicionales para mejorar la precisión del ajuste.Este protocolo se utilizó para sondear la dependencia de presión de RRM2, el segundo motivo de reconocimiento de ARN heterogéneo de la ribonucleoproteína nuclear A1. La espectroscopia optimizada para la relajación transversal con espectros de espectros de espectros de espectros de coherencia heterocuántica única se recogió a una barra, 1,5 kilobares, dos kilobares y 2,5 kilobares. El RRM2 está casi completamente desplegado dentro del rango de 2,5 kilobares. Los perfiles de intensidad de presión individuales se ajustaron de acuerdo con la ecuación que se muestra aquí, para obtener los cambios correspondientes en la energía libre de Gibbs estándar y el volumen asociados con la reacción de despliegue.Cuando se mapearon en la estructura del dominio, los residuos con la mayor magnitud de cambio de volumen se encontraron dentro del núcleo estructural del dominio, mientras que aquellos con la menor magnitud de cambio de volumen se ubicaron principalmente en los bucles de conexión entre las hebras beta y la hebra beta a la hélice terminal C. Para sondear el grado de compresibilidad y heterogeneidad conformacional del conjunto de estado plegado, se analizaron los cambios químicos del protio. Los perfiles individuales de los cambios químicos del protio en función de la presión se ajustaron utilizando la ecuación mostrada, para extraer los coeficientes lineales y no lineales específicos del sitio.Los residuos con los coeficientes no lineales más grandes se encontraron principalmente en el núcleo estructural del dominio, mientras que los residuos con los coeficientes no lineales más pequeños se ubicaron principalmente dentro de bucles que conectan los diferentes motivos estructurales. Es importante configurar el tubo como un ajuste de presión correctamente, para evitar fugas. Si ocurre una fuga, la sonda probablemente tendría que ser removida para limpiar cualquier rastro de aceite mineral.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

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El uso de andamios liposomas para reconstituir las interacciones proteína-proteína-lípidos proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Investigación

Bioquímica

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Coincidencia de contraste detergente en Small-Angle Neutron Scattering experimentos para el análisis estructural de la proteína de membrana y modelado Ab Initio

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Un análisis de espectroscopia de fluorescencia fluctuación de interacciones de proteínas en los contactos célula-célula

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High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Medición de alta sensibilidad de transcripción DNA Factor obligatorio afinidades por valoración competitiva utilizando microscopía de fluorescencia

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Identificación de regiones de la proteína funcional a través de la construcción de la proteína quimérica

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Microscopía de seguimiento de una sola molécula - Una herramienta para determinar los estados difusos de las moléculas citosólicas

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

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Creación de sistemas de dimerización de proteínas altamente específicos inducidos químicamente por la selección de fagos escalonados de una biblioteca combinatoria de anticuerpos de un solo dominio

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Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Sistema de nanopartículas de membrana celular nativa para análisis de interacción proteína-proteína de membrana

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Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Optimización del crecimiento de cristales de endotiapepsina para experimentos de cristalografía en serie

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

Cribado de fragmentos basado en RMN en una muestra mínima pero en modo de automatización máxima

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...