Name: high-pressure nmr experiments for detecting protein low-lying conformational states
Uploaded: 2021-06-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Pressure NMR Experiments for Detecting Protein Low-Lying Conformational States at JoVE.com

Bu çalışma Roy J. Carver Hayır Kurumu'ndan Julien Roche'a fonlar tarafından desteklendi. J. D. Levengood ve B. S. Tolbert'e RRM2 örneğini sağladıkları için teşekkür ederiz.

NOT: Burada açıklanan protokol, (i) 2,5 kbar dereceli alüminyum sertleştirilmiş zirkonya tüpü18,(ii) NMR spektrumunun analizi için SPARKY19 yazılımı ve (iii) bir eğri uydurma yazılımına sahip yüksek basınçlı bir pompa ve hücre gerektirir.
1. Numune hazırlama, yüksek basınç hücresinin montajı ve deneylerin ayarlanması.
<ol><li>Tampon seçimi: Fosfat ve Tris20,21</sup...

<ol>
	<li>Alderson, R. T., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+invisible+protein+states+with+NMR+spectroscopy.">Unveiling invisible protein states with NMR spectroscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 60, 39-49 (2020).</li><li>Korzhnev, D. M., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=probing+invisible,+low-populated+states+of+protein+molecules+by+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy:+An+application+to+protein+folding.">probing invisible, low-populated states of protein molecules by relaxation dispersion NMR spectroscopy: An application to protein folding.</a> Accounts of Chemical Research. 41, 442-451 (2008).</li><li>Loria, P. J., Berlow, R. B., Watt, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+enzyme+motions+by+solution+NMR+relaxation+dispersion.">Characterization of enzyme motions by solution NMR relaxation dispersion.</a> Accounts of Chemical Research. 41, 214-221 (2008).</li><li>Ishima, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CPMG+relaxation+dispersion.">CPMG relaxation dispersion.</a> Methods in Molecular Biology. 1084, 29-49 (2014).</li><li>Longo, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+exchange+saturation+transfer+(CEST):+an+efficient+tool+for+detecting+molecular+information+on+proteins'+behaviour.">Chemical exchange saturation transfer (CEST): an efficient tool for detecting molecular information on proteins' behaviour.</a> Analyst. 39, 2687-2690 (2014).</li><li>Fawzi, N. L., Ying, J., Torchia, D. A., Clore, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+exchange+kinetics+and+atomic+resolution+dynamics+in+high-molecular-weight+complexes+using+dark-state+exchange+saturation+transfer+NMR+spectroscopy.">Probing exchange kinetics and atomic resolution dynamics in high-molecular-weight complexes using dark-state exchange saturation transfer NMR spectroscopy.</a> Nature Protocols. 7, 1523-1533 (2012).</li><li>Anthis, N. J., Clore, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+transient+dark+states+by+NMR+spectroscopy.">Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48, 35-116 (2015).</li><li>Roche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavities+determine+the+pressure+unfolding+of+proteins.">Cavities determine the pressure unfolding of proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 6945-6950 (2012).</li><li>Chen, C. R., Makhatadze, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinant+of+the+effects+of+hydrostatic+pressure+on+protein+folding+stability.">Molecular determinant of the effects of hydrostatic pressure on protein folding stability.</a> Nature Communications. 8, 14561 (2017).</li><li>Roche, J., Royer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+pressure+denaturation+of+proteins.">Lessons from pressure denaturation of proteins.</a> Journal of the Royal Society Interface. 15, 20180244 (2018).</li><li>Xu, X., Gagn&#233;, D., Aramini, J. M., Gardner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+and+compressibility+differences+between+protein+conformations+revealed+by+high-pressure+NMR.">Volume and compressibility differences between protein conformations revealed by high-pressure NMR.</a> Biophysical Journal. 120, 924-935 (2021).</li><li>Akasaka, K., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-lying+excited+states+of+proteins+revealed+from+non-linear+pressure+shifts+in+1H+and+15N+NMR.">Low-lying excited states of proteins revealed from non-linear pressure shifts in 1H and 15N NMR.</a> Biochemistry. 40, 8665-8671 (2001).</li><li>Akasaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+conformational+fluctuation+of+proteins+by+pressure+perturbation.">Probing conformational fluctuation of proteins by pressure perturbation.</a> Chemical Reviews. 106, 1814-1835 (2006).</li><li>Kitahara, R., Yokoyama, S., Akasaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+snapshots+of+a+fluctuating+protein+structure:+ubiquitin+at+30+bar-3+kbar.">NMR snapshots of a fluctuating protein structure: ubiquitin at 30 bar-3 kbar.</a> Journal of Molecular Biology. 347, 277-285 (2005).</li><li>Roche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=remodeling+of+the+folding+free+energy+landscape+of+Staphylococcal+nuclease+by+cavity-creating+mutations.">remodeling of the folding free energy landscape of Staphylococcal nuclease by cavity-creating mutations.</a> Biochemistry. 51, 9535-9546 (2012).</li><li>Nucci, N. V., Fuglestad, B., Athanasoula, E. A., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cavities+and+hydration+in+the+pressure+unfolding+of+T4+lysozyme.">Role of cavities and hydration in the pressure unfolding of T4 lysozyme.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13846-13851 (2014).</li><li>Maeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavity+as+a+source+of+conformational+fluctuation+and+high-energy+state:+High-pressure+NMR+study+of+a+cavity-enlarged+mutant+of+T4+lysozyme.">Cavity as a source of conformational fluctuation and high-energy state: High-pressure NMR study of a cavity-enlarged mutant of T4 lysozyme.</a> Biophysical Journal. 108, 133-145 (2015).</li><li>Peterson, R. W., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-contained+high-pressure+cell,+apparatus,+and+procedure+for+the+preparation+of+encapsulated+proteins+dissolved+in+low+viscosity+fluids+for+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy.">Self-contained high-pressure cell, apparatus, and procedure for the preparation of encapsulated proteins dissolved in low viscosity fluids for nuclear magnetic resonance spectroscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 76, 094101 (2005).</li><li>Goddard, T. D., Kneller, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sparky 3. , (2010).</li><li>Caro, J. A., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+aspects+of+high-pressure+NMR+spectroscopy+and+its+applications+in+protein+biophysics+and+structural+biology.">Practical aspects of high-pressure NMR spectroscopy and its applications in protein biophysics and structural biology.</a> Methods. 148, 67-80 (2018).</li><li>Kitamura, T., Itoh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+volume+of+protonic+ionization+for+buffering+agents.+Prediction+of+pressure+dependence+of+pH+and+pOH.">Reaction volume of protonic ionization for buffering agents. Prediction of pressure dependence of pH and pOH.</a> Journal of Solution Chemistry. 16, 715-725 (1987).</li><li>Royer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+volume+changes+in+pressure-induced+protein+unfolding.">Revisiting volume changes in pressure-induced protein unfolding.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1595, 201-209 (2002).</li><li>Erlach, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+nonliner+pressure-induced+chemical+shift+changes+and+thermodynamic+parameters.">Relationship between nonliner pressure-induced chemical shift changes and thermodynamic parameters.</a> Journal of Physical Chemistry B. 118, 5681-5690 (2014).</li><li>de Oliveira, G. A. P., Silva, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hypothesis+to+reconcile+the+physical+and+chemical+unfolding+of+proteins.">A hypothesis to reconcile the physical and chemical unfolding of proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States of America. 112, 2775-2784 (2015).</li><li>Nguyen, L. M., Roche, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pressure+NMR+techniques+for+the+study+of+protein+dynamics,+folding+and+aggregation.">High-pressure NMR techniques for the study of protein dynamics, folding and aggregation.</a> Journal of Magnetic Resonance. 277, 179-185 (2017).</li></ol>

Bu çalışmada, protein yapısal ve termodinamik yanıtlarının basınç pertürbasyonuna araştırılması için uygulanan bir protokol ayrıntılı olarak yer alıyor. Burada RRM2'de kaydedilen yüksek basınç deneyleri, ΔVU değerlerinde, tamamen işbirliğine bağlı olmayan açılmanın göstergesi olan büyük varyasyonların nispeten küçük bir tek alan proteininde bulunabileceğini göstermektedir. Benzer bir tablo basınç altında 1H kimyasal kayma değişikliklerinin analizinden ort...

Proteinlerin ve protein komplekslerinin daha yüksek enerjili, seyrek nüfuslu konformasyon durumlarının birçok biyolojik yolda kilit rol oynadığı uzun zamandır kabul edilmektedir1,2,3. Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)4,Kimyasal Değişim Doygunluk Transferi (Tsİ)5ve karanlık durum değişim doygunluk transferi (DEST)6 darbe dizisi (diğerleri arasında) tabanlı deneyler sayesinde, çözelti NMR spektroskopisi geçici uygun durumları karakterize etmek için bir seçim yöntemi olarak ortaya çıkmıştır7. Bu deneylerle birlikte, daha yüksek enerji konformasyonel alt durumlarının göreli popülasyonunu artırmak için sıcaklık, pH veya kimyasal denatürantlar gibi pertürbasyonlar da tanıtılabilir. Benzer şekilde, protein dengesi de yüksek hidrostatik basınç uygulanarak bozılabilir. İlgili konformasyon değişiklikleriyle ilişkili hacim değişiminin büyüklüğüne bağlı olarak, basıncın birkaç yüz ila birkaç bin çubuk artması, daha yüksek bir enerji durumunu önemli ölçüde stabilize edebilir veya bir proteinintamamen ortayaçıkmasına neden olabilir 8 ,9,10. Protein NMR spektrumu tipik olarak hidrostatik basınçla iki tür değişiklik gösterir: (i) kimyasal kayma değişiklikleri ve (ii) pik yoğunluk değişiklikleri. Kimyasal kayma değişiklikleri, protein yüzey suyu arayonundaki değişiklikleri ve/veya protein yapısının hızlı bir zaman ölçeğinde (NMR zaman ölçeğine göre) yerel sıkıştırmasını yansıtır11. Büyük doğrusal olmayan kimyasal kaymalar gösteren çapraz geçişler basınç bağımlılığı, daha yüksek enerji konformasyon durumlarının varlığını gösterebilir12,13. Öte yandan, pik yoğunluk değişiklikleri, katlanmış/katlanmış durum popülasyonlarındaki değişiklikler gibi yavaş bir zaman ölçeğinde büyük konformasyon geçişlerine işaret eder. Katlanır ara maddelerin veya daha yüksek enerji durumlarının varlığı, belirli bir proteinin farklı kalıntıları için ölçülen açma üzerine hacim değişiminin büyüklüğündeki büyük varyasyonlardan tespit edilebilir14,15,16,17. Deneyimlerimize dayanarak, tipik olarak iki durumlu klasörler olarak sınıflandırılan küçük proteinler bile, yerel katlama stabiliteleri hakkında yararlı bilgiler sağlayan basınca karşı tekdüze olmayan yanıtlar sergiler. Burada açıklanan, heterojen nükleer ribonükleoprotein A1'in(hnRNPA1) izole RNA tanıma motifi 2'yi (RRM2) model protein olarak kullanarak, amide tepe yoğunluğu ve 1 H kimyasal kayma basınç bağımlılığının kazanılması ve analizi için bir protokoldür.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar</td>
			<td>Daedalus Innovations LLC</td>
			<td>NMRCELL-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparky3</td>
			<td>University of California San Francisco, CA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xtreme-60 Syringe pump</td>
			<td>Daedalus Innovations LLC</td>
			<td>XTREME-60</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-pressure nmr experiments for detecting protein low-lying conformational states

Yüksek basınç, küresel proteinlerin dengesini bozmak ve protein komplekslerini ters çevrilebilir bir şekilde ayrıştırmak için kullanılabilecek iyi bilinen bir pertürbasyon yöntemidir. Hidrostatik basınç termodinamik dengeyi daha düşük azı dişi hacmi ile durum(lar)a doğru yönlendirir. Artan basınç, bu nedenle, küresel proteinlerin stabilitesini ve protein komplekslerinin oligomerizasyon dengesini ince bir şekilde ayarlama fırsatları sunar. Yüksek basınçlı NMR deneyleri, basınç pertürbasyonunun ince stabilite ayar yeteneğini ve çözelti NMR spektroskopisi tarafından sunulan saha çözünürlüğünü birleştirerek globüler proteinlerin stabilitesini, katlama mekanizmalarını ve oligomerizasyon mekanizmalarını yöneten faktörlerin ayrıntılı bir şekilde karakterizasyonuna izin verir. Burada, 1 bar'dan 2,5 kbar'a kadar kaydedilen 2D 1H-15N deneyleri seti aracılığıyla bir proteinin yerel katlama stabilitesini araştırmak için bir protokol sunuyoruz. Bu tür deneylerin alınması ve analizi için gereken adımlar, hnRNPA1'in RRM2 etki alanında elde edilen verilerle gösterilmiştir.

Burada açıklanan protokol, 2,5 kbar aralığında (%>90) neredeyse tamamen açılan hnRNPA1'in (kalıntılar 95-106) ikinci RNA tanıma motifi olan RRM2'nin basınç bağımlılığını araştırmak için kullanılmıştır. 1 H-15N spektrumları 1 bar, 500 bar, 750 bar, 1 kbar, 1.5 kbar, 2 kbar ve 2.5 kbar 'da toplanarak toplandırıldı (Şekil 2). Yerel çapraz uçların hiçbiri 2,5 kbar'daki gürültü seviyesinin üzerinde görünmediği için, karşılık gele...

Watch this Scientific Journal Video about High-Pressure NMR Experiments for Detecting Protein Low-Lying Conformational States at JoVE.com

High-Pressure NMR Experiments for Detecting Protein Low-Lying Conformational States

Yüksek basınçlı bir hücreyi monte etmek, yüksek basınçlı NMR deneylerini kurmak ve kaydetmek ve son olarak basınç altında hem pik yoğunluk hem de kimyasal kayma değişikliklerini analiz etmek için gereken adımların ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz. Bu deneyler, proteinlerin katlanır yolları ve yapısal stabilitesi hakkında değerli içgörüler sağlayabilir.

Protein Düşük Yatan Konformasyon durumlarını tespit etmek için Yüksek Basınçlı NMR Deneyleri

High-pressure is a well-known perturbation method that can be used to destabilize globular proteins and dissociate protein complexes in a reversible ...

Yüksek basınç, bir protein konformasyon örneğinin göreli popülasyonunu değiştirmek için tercih edilmesi olan yöntemdir. Yüksek enerjili konformasyon durumlarını izole etmek ve karakterize etmek için son derece yararlıdır. pH veya sıcaklık gibi tüm pertürbasyon yöntemleriyle karşılaştırıldığında, basınç pertürbasyonunun uygulanması kolaydır ve tamamen tersine çevrilebilir.Ayrıca, öncelikle cam boşlukları veya boşluk hacimleri olan bölgeleri etkileyen yerel bir pertürbasyondur. Başlamak için, azot-15 etiketli numuneyi bir cam pipet kullanarak zirkonya tüpüne sokun ve tüpün altındaki numune koltuklarını sağlayın. Numunenin iletim sıvısı ile karışmasını önlemek için, numuneyi 200 mikrolitre mineral yağ ile kaplayın ve ardından tüpün geri kalanını iletim sıvısı ile doldurun.Zirkonya tüpünün üzerine tek kullanımlık bir O-halka koyun ve tüpü tabana kaydırın. Daha sonra tüpü yüksek basınçlı bağlama hattına bağlayın ve tabanı elle hücreye sıkın. Daha sonra daha düşük basınçta sızıntıları önlemek için 14,7 newton metre tork uygulayın.Basınç hücresi tertibatının bütünlüğünü kontrol etmek için, hücre desteği ve muhafaza kabı kullanarak tüpü spektrometrenin dışında 300 bara kadar basınçlandırın. 15 dakika sonra basıncı bir çıla sıfırlayın ve temiz tüy bırakmayan bir mendille sızıntı olup olmadığını kontrol edin. Basınçsız tüpü, bağlama hattını dikkatlice yönlendirerek spektrometreye yerleştirin.Tüp örnek oturma konumuna ulaşana kadar tüpü spektrometreye kaydırın. Protium ve nitrojen kanallarını kilitleyin, dolgu yapın, eşleştirin ve ayarlayın ve optimize edilmiş dolguları geleceğe sakla. Hetero tek kuantum tutarlı spektroskopi ile enine gevşeme optimize spektroskopisi kurun ve atmosferik koşullarda bir referans deneyi kaydetmeye devam edin.Her 500 çubuk için bir çubuktan 2,5 kilobara kadar bir dizi 2D deneme kaydedin. Kesin katlama veya açılma oranları biliniyorsa, her 500 bar'in artışından sonra, numunenin 15 ila 20 dakika boyunca dengelenmesine izin verin. Katlama veya açılma geçişinin çekim noktası ulaştığında, sığdırma hassasiyetini artırmak için ek denemeler kaydedin.Bu protokol, ikinci RNA tanıma motifi heterojen nükleer ribonükleoprotein A1 olan RRM2'nin basınç bağımlılığını araştırmak için kullanılmıştır. Hetero tek kuantum tutarlılık spektroskopisi spektroskopisi ile enine gevşeme optimize spektroskopisi bir çubukta, 1,5 kilobar, iki kilobar ve 2,5 kilobars'ta toplandı. RRM2, 2,5 kilobar aralığında neredeyse tamamen açılmış. Bireysel basınç yoğunluğu profilleri, ortaya çıkan reaksiyonla ilişkili standart Gibbs serbest enerji ve hacmindeki ilgili değişiklikleri elde etmek için burada gösterilen denkleme göre monte edildi.Etki alanı yapısında eşlendiğinde, en büyük hacim değişikliği büyüklüğüne sahip kalıntılar etki alanı yapısal çekirdeğinde bulunurken, en küçük hacim değişikliği büyüklüğüne sahip olanlar esas olarak beta iplikçikleri ile beta iplikçikleri arasındaki bağlantı döngülerinde C terminali sarmalına yerleştirilmiştir. Katlanmış durum topluluğunun sıkıştırılabilirlik ve konformasyonsal heterojenlik derecesini araştırmak için protium kimyasal kaymaları analiz edildi. Protium kimyasal kaymalarının bir basınç fonksiyonu olarak bireysel profilleri, meksağa özgü doğrusal ve doğrusal olmayan katsayıları çıkarmak için gösterilen denklem kullanılarak monte edilmiştir.En büyük doğrusal olmayan katsayılara sahip kalıntılar çoğunlukla etki alanının yapısal çekirdeğinde bulunurken, en küçük doğrusal olmayan katsayılara sahip kalıntılar çoğunlukla farklı yapısal motifleri birbirine bağlayan döngüler içinde yer aldı. Sızıntıları önlemek için tüpü doğru bir basınç seti olarak kurmak önemlidir. Eğer bir sızıntı olursa, mineral yağ izlerini temizlemek için sondanın muhtemelen çıkarılması gerekir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Kontrast eşleştirme deterjan küçük açı Nötron saçılma deneylerde membran proteini yapısal analiz ve Ab Initio modelleme

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Transkripsiyon faktörü-DNA bağlayıcı Affinities floresans mikroskobu kullanarak rekabet titrasyon tarafından yüksek hassasiyet ölçümü

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Fonksiyonel Protein bölgeleri Chimeric Protein inşaat aracılığıyla tanımlaması

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Tek Moleküllü İzleme Mikroskobu - Sitosolik Moleküllerin Diffüz Durumlarını Belirlemede Bir Araç

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Bir Kombinatoryal Tek Etki Alanı Antikor Kütüphanesi adım wise Faj Seçimi ile Son Derece Spesifik Kimyasal Kaynaklı Protein Dimerization Sistemleri Oluşturma

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Membran Protein-Protein Etkileşim Analizi için Yerli Hücreli Membran Nanopartiküller Sistemi

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Seri Kristalografi Deneyleri için Endotiapepsin Kristallerinin Büyümesini Optimize Etme

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

Minimum numune ancak maksimum otomasyon modunda NMR tabanlı parça taraması

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...