Name: a scalable model to study the effects of blunt-force injury in adult zebrafish
Uploaded: 2021-05-31T15:00:00
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Die Autoren danken den Hyde-Labormitgliedern für ihre durchdachten Diskussionen, den Technikern des Freimann Life Sciences Center für die Pflege und Haltung von Zebrafischen und der University of Notre Dame Optical Microscopy Core/NDIIF für den Einsatz von Instrumenten und deren Dienstleistungen. Diese Arbeit wurde vom Center for Zebrafish Research an der University of Notre Dame, dem Center for Stem Cells and Regenerative Medicine an der University of Notre Dame und Zuschüssen des National Eye Institute of NIH R01-EY018417 (DRH), dem National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (JTH), LTC Neil Hyland Fellowship of Notre Dame (JTH) unterstützt. Sentinels of Freedom Fellowship (JTH) und das Pat Tillman Scholarship (JTH).

Zebrafische wurden in der Zebrafischanlage Notre Dame im Freimann Life Sciences Center gezüchtet und gepflegt. Die in diesem Manuskript beschriebenen Methoden wurden vom Animal Care and Use Committee der University of Notre Dame genehmigt.
1. Paradigma der traumatischen Hirnverletzung
<ol><li>1 ml 2-Phenoxyethanol zu 1 l Systemwasser (60 mg Instant Ocean in 1 l entionisiertem RO-Wasser) geben.</li>
	<li>Bereiten Sie einen belüfteten Rückgewinnungstank mit 2 l Systemwasser bei Raumtemperat...

<ol>
	<li>Centers for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveillance+Report+of+Traumatic+Brain+Injury-related+Emergency+Department+Visits,+Hospitalizations,+and+Deaths-United+States,+2014.">Surveillance Report of Traumatic Brain Injury-related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths-United States, 2014.</a> Centers for Disease Control and Prevention, U.S. Department of Health and Human Services. , (2019).</li><li>Galgano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+brain+injury:+current+treatment+strategies+and+future+endeavors.">Traumatic brain injury: current treatment strategies and future endeavors.</a> Cell transplantation. 26 (7), 1118-1130 (2017).</li><li>Santiago, L. A., Oh, B. C., Dash, P. K., Holcomb, J. B., Wade, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clinical+comparison+of+penetrating+and+blunt+traumatic+brain+injuries.">A clinical comparison of penetrating and blunt traumatic brain injuries.</a> Brain injury. 26 (2), 107-125 (2012).</li><li>Korley, F. K., Kelen, G. D., Jones, C. M., Diaz-Arrastia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergency+department+evaluation+of+traumatic+brain+injury+in+the+United+States,+2009-2010.">Emergency department evaluation of traumatic brain injury in the United States, 2009-2010.</a> The Journal of Head Trauma Rehabilitation. 31 (6), 379-387 (2016).</li><li>Faul, M., Xu, L., Wald, M., Coronado, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Traumatic Brain Injury in the United States: Emergency Department Visits, Hospitalizations and Deaths. , (2010).</li><li>Campbell, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch3+and+DeltaB+maintain+M&#252;ller+glia+quiescence+and+act+as+negative+regulators+of+regeneration+in+the+light-damaged+zebrafish+retina.">Notch3 and DeltaB maintain M&#252;ller glia quiescence and act as negative regulators of regeneration in the light-damaged zebrafish retina.</a> Glia. 69 (3), 546-566 (2021).</li><li>Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. 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Part I: Pathophysiology and biomechanics.</a> Journal of Neurosurgery. 80 (2), 291-300 (1994).</li><li>Mussulini, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seizures+induced+by+pentylenetetrazole+in+the+adult+zebrafish:+a+detailed+behavioral+characterization.">Seizures induced by pentylenetetrazole in the adult zebrafish: a detailed behavioral characterization.</a> PloS One. 8 (1), 54515 (2013).</li><li>Kalueff, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+comprehensive+catalog+of+zebrafish+behavior+1.0+and+beyond.">Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond.</a> Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).</li><li>Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+traumatic+brain+injuries.">Animal models of traumatic brain injuries.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14, 128-142 (2013).</li><li>Amamoto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+axolotls+can+regenerate+original+neuronal+diversity+in+response+to+brain+injury.">Adult axolotls can regenerate original neuronal diversity in response to brain injury.</a> eLife. 5, 13998 (2016).</li><li>Yamamoto, S., Levin, H., Prough, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mild,+moderate+and+severe:+terminology+implications+for+clinical+and+experimental+traumatic+brain+injury.">Mild, moderate and severe: terminology implications for clinical and experimental traumatic brain injury.</a> Current Opinion in Neurology. 31 (6), 672-680 (2008).</li><li>Lund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate+traumatic+brain+injury,+acute+phase+course+and+deviations+in+physiological+variables:+an+observational+study.">Moderate traumatic brain injury, acute phase course and deviations in physiological variables: an observational study.</a> Scandinavian Journal of Trauma Resuscitation and Emergency Medicine. 24, 77 (2016).</li><li>Levin, H., Arrastia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis,+prognosis,+and+clinical+management+of+mild+traumatic+brain+injury.">Diagnosis, prognosis, and clinical management of mild traumatic brain injury.</a> The Lancet Neurology. 14 (5), 506-517 (2015).</li><li>Ruff, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+diagnosing+a+mild+traumatic+brain+injury:+a+National+Academy+of+Neuropsychology+education+paper.">Recommendations for diagnosing a mild traumatic brain injury: a National Academy of Neuropsychology education paper.</a> Archives of Clinical Neuropsychology: The Official Journal of the National Academy of Neuropsychologists. 24 (1), 3-10 (2009).</li><li>Ganz, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+in+fish.">Adult neurogenesis in fish.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (7), 019018 (2016).</li><li>Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurogenesis+in+the+adult+zebrafish+brain:+origin,+proliferation+dynamics,+migration+and+cell+fate.">Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate.</a> Developmental Biology. 295, 263-277 (2006).</li><li>Lahne, M., Nagashima, M., Hyde, D. R., Hitchcock, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+Muller+glia+to+regenerate+retinal+neurons.">Reprogramming Muller glia to regenerate retinal neurons.</a> Annual Review of Visual Science. 6, 171-193 (2020).</li></ol>

Untersuchungen zu Neurotrauma und assoziierten Folgeerkrankungen konzentrieren sich seit langem auf traditionelle nicht-regenerative Nagetiermodelle20. Erst kürzlich haben Studien verschiedene Formen von ZNS-Schäden auf regenerative Modelle angewendet9,11,13,14,21. Obwohl aufschlussreich, sind diese Modelle entweder durch die Verwendu...

Traumatische Hirnverletzungen (TBIs) sind eine globale Gesundheitskrise und eine der Hauptursachen für Tod und Behinderung. In den Vereinigten Staaten erleben etwa 2,9 Millionen Menschen jedes Jahr einen TBI, und zwischen 2006 und 2014 stieg die Mortalität aufgrund von TBI oder TBI-Folgeerkrankungen um über 50%1. TBIs unterscheiden sich jedoch in ihrer Ätiologie, Pathologie und klinischen Präsentation, was zum großen Teil auf den Mechanismus der Verletzung (MOI) zurückzuführen ist, der auch die Behandlungsstrategien und die prognostizierte Prognose beeinflusst2. Obwohl TBIs aus verschiedenen MOI resultieren können, sind sie überwiegend das Ergebnis eines durchdringenden oder stumpfen Gewalttraumas. Penetrierende Traumata machen einen kleinen Prozentsatz der TBIs aus und erzeugen eine schwere und fokale Verletzung, die auf die unmittelbaren und umliegenden aufgespießten Hirnregionen lokalisiert ist3. Im Gegensatz dazu sind stumpfe TBIs häufiger in der Allgemeinbevölkerung, umfassen eine Reihe von Schweregraden (leicht, mittelschwer und schwer) und verursachen eine diffuse, heterogene und globale Verletzung, die mehrere Hirnregionen betrifft1,4,5.
Zebrafische (Danio rerio) wurden verwendet, um eine breite Palette von neurologischen Beleidigungen zu untersuchen, die das zentrale Nervensystem (ZNS) umfassen.6,7,8,9. Zebrafische besitzen im Gegensatz zu Säugetieren auch eine angeborene und robuste regenerative Reaktion, um ZNS-Schäden zu reparieren10. Aktuelle Zebrafisch-Traumamodelle verwenden verschiedene Verletzungsmethoden, einschließlich Penetration, Exzision, chemische Beleidigung oder Druckwellen11,12,13,14,15,16. Jede dieser Methoden verwendet jedoch ein MOI, das von der menschlichen Bevölkerung selten erlebt wird, nicht über eine Reihe von Verletzungsschweregraden skalierbar ist und nicht auf die Heterogenität oder schweregradabhängige TBI-Folge zurückzuführen ist, die nach stumpfer TBI berichtet wurde. Diese Faktoren schränken die Verwendung des Zebrafischmodells ein, um die zugrunde liegenden Mechanismen der Pathologien zu verstehen, die mit der häufigsten Form von SHT in der menschlichen Bevölkerung (leichte stumpfe Gewaltverletzungen) verbunden sind.
Unser Ziel war es, ein schnelles und skalierbares TBI-Zebrafischmodell mit stumpfer Kraft zu entwickeln, das Möglichkeiten zur Untersuchung der Verletzungspathologie, des Fortschreitens von TBI-Folgeerkrankungen und der angeborenen regenerativen Reaktion bietet. Wir modifizierten den häufig verwendeten Nagetier-Marmarou17-Gewichtstropfen und trugen ihn auf erwachsene Zebrafische auf. Dieses Modell ergibt einen reproduzierbaren Schweregradbereich von leicht, mittelschwer bis schwer. Dieses Modell rekapituliert auch mehrere Facetten der menschlichen TBI-Pathologie in einer schweregradabhängigen Weise, einschließlich Anfällen, Ödemen, subduralen und intrazerebralen Hämatomen, neuronalem Zelltod und kognitiven Defiziten wie Lern- und Gedächtnisstörungen. Tage nach der Verletzung lösen sich Pathologien und Defizite auf und kehren zu einem Niveau zurück, das unbeschädigten Kontrollen ähnelt. Darüber hinaus zeigt dieses Zebrafischmodell eine robuste Proliferations- und neuronale Regenerationsreaktion über die Neuroaxis in Bezug auf die Schwere der Verletzung.
Hier geben wir Details zur Einrichtung und Induktion eines stumpfen Gewalttraumas, zur Bewertung posttraumatischer Anfälle, zur Beurteilung von Gefäßverletzungen, Anweisungen zur Vorbereitung von Hirnschnitten, Ansätze zur Quantifizierung von Ödemen und Einblicke in die proliferative Reaktion nach einer Verletzung.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-phenoxyethanol</td>
			<td>Sigma Alderich</td>
			<td>77699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#00 buckshot</td>
			<td>Remington</td>
			<td>RMS23770</td>
			<td>3.3g weight for sTBI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#3 buckshot</td>
			<td>Remington</td>
			<td>RMS23776</td>
			<td>1.5g weight for miTBI/moTBI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Dumont forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-ethynyl-2&#8217;-deoxyuridine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10044</td>
			<td>EdU</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml glass vial</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66011-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Cell Proliferation Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoOne 12-well plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7682-7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super frost postiviely charged slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super PAP Pen Liquid Blocker</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>22309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue freezing medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15148-031</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a scalable model to study the effects of blunt-force injury in adult zebrafish

Stumpfe Schädel-Hirn-Traumata (TBI) sind die häufigste Form des Kopftraumas, das sich über einen dicken Schweregrad erstreckt und zu komplexen und heterogenen Nebenwirkungen führt. Während es keinen Mechanismus gibt, um die verlorenen Neuronen nach einem TBI beim Menschen zu ersetzen oder zu regenerieren, besitzen Zebrafische die Fähigkeit, Neuronen in ihrem ganzen Körper, einschließlich des Gehirns, zu regenerieren. Um die Breite der Pathologien zu untersuchen, die bei Zebrafischen nach einem stumpfen TBI gezeigt werden, und um die Mechanismen zu untersuchen, die der nachfolgenden neuronalen regenerativen Reaktion zugrunde liegen, modifizierten wir den häufig verwendeten Nagetier-Marmarou-Gewichtsabfall für die Verwendung bei erwachsenen Zebrafischen. Unser einfaches Stumpfkraft-TBI-Modell ist skalierbar, induziert einen leichten, mittelschweren oder schweren TBI und rekapituliert viele der Phänotypen, die nach menschlichen TBI beobachtet wurden, wie Kontakt- und posttraumatische Anfälle, Ödeme, subdurale und intrazerebrale Hämatome und kognitive Beeinträchtigungen, die jeweils in Abhängigkeit von der Schwere der Verletzung auftreten. TBI-Folgeerscheinungen, die innerhalb von Minuten nach der Verletzung auftreten, klingen ab und kehren innerhalb von 7 Tagen nach der Verletzung auf nahezu unbeschädigte Kontrollniveaus zurück. Der regenerative Prozess beginnt bereits 48 Stunden nach der Verletzung (hpi), wobei die maximale Zellproliferation von 60 hpi beobachtet wird. So erzeugt unser Zebrafisch-Stumpfkraft-TBI-Modell charakteristische primäre und sekundäre Verletzungs-TBI-Pathologien, die dem menschlichen SHT ähneln, was die Untersuchung des Krankheitsbeginns und -fortschreitens sowie der Mechanismen der neuronalen Regeneration ermöglicht, die für Zebrafische einzigartig sind.

Die Vorbereitung des Verletzungsinduktions-Rigs ermöglicht eine schnelle und vereinfachte Möglichkeit, erwachsenen Zebrafischen einen skalierbaren stumpfen TBI zu liefern. Der abgestufte Schweregrad des Verletzungsmodells liefert mehrere leicht identifizierbare Metriken für eine erfolgreiche Verletzung, obwohl die Gefäßverletzung eine der einfachsten und prominentesten Pathologien ist (Abbildung 3). Die Belastung der Fische, die während der Verletzung verwendet wurden, kann diesen Indi...

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A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

Wir modifizierten das Marmarou-Gewichtsabfallmodell für erwachsene Zebrafische, um eine Breite von Pathologien nach stumpfer traumatischer Hirnverletzung (TBI) und die Mechanismen, die der nachfolgenden neuronalen Regeneration zugrunde liegen, zu untersuchen. Dieses stumpfe TBI-Modell ist skalierbar, induziert ein leichtes, mittelschweres oder schweres SHT und rekapituliert die bei menschlichen TBI beobachtete Verletzungsheterogenität.

Ein skalierbares Modell zur Untersuchung der Auswirkungen von Stumpfkraftverletzungen bei erwachsenen Zebrafischen

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...

Dieses Protokoll bietet eine einfache, schnelle und reproduzierbare Methode, um eine skalierbare stumpfe Schädel-Hirn-Trauma bei erwachsenen Zebrafischen zu induzieren. Die erwachsenen Zebrafische, die diese stumpfe traumatische Hirnverletzung erleiden, weisen viele der Merkmale auf, die bei Menschen beobachtet werden, die an einer stumpfen Kraft TBI leiden. Das Verfahren wird von Herrn James Hentig und Frau Kaylee Cloghessy, zwei Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert.Beginnen Sie mit dem Füllen einer Petrischale mit Modelliermasse. Verwenden Sie dann Finger oder die Rückseite einer Pinzette, um eine erhöhte Plattform mit zusätzlicher Modelliermasse zu erstellen. Teilen Sie die erhöhte Plattform der Länge nach mit einer Rasierklinge in zwei ungefähr gleiche Hälften.Bilden Sie die beiden Hälften zu einem Kanal, so dass er die Länge eines erwachsenen Fisches aufnimmt. Verwenden Sie zusätzlichen Lehm, um Wände zu bauen, um 2/3 des Fischkörpers mit freiliegendem Kopf zu sichern. Formen Sie eine kleine Stütze im freiliegenden Kopfbereich senkrecht zu den Wänden, um eine Rotation oder einen Rückstoß des Kopfes bei Verletzungen zu vermeiden.Stellen Sie sicher, dass die Seiten des Kanals das abfallende Gewicht nicht behindern. Verwenden Sie einen Mini-Locher, um eine 3-Millimeter-Stahlscheibe aus einem 22-Gauge-Stahlblitz zu erstellen. Legen Sie einen betäubten Fisch, der nicht auf Schwanzdrücken reagiert, mit der Dorsalseite nach oben auf die Tonform im Kanal, so dass sein Körper an den Seiten befestigt ist.Legen Sie die 3-Millimeter-22-Gauge-Stahlscheibe auf den Kopf, zentriert über den gewünschten Aufprallpunkt. Richten Sie den Fisch senkrecht aus, um zu vermeiden, dass sein Kopf zur Seite kippt, was zu einem ungleichmäßigen Aufprall führen könnte. Verwenden Sie einen Standard-Ringständer und eine Armklemme, um das Stahl- oder Kunststoffrohr zu sichern, und stellen Sie sicher, dass es gerade ist, so dass der Boden des Schlauches 1,5 Zentimeter über dem Kopf des Zebrafisches liegt.Schauen Sie nach dem Rohr, um sicherzustellen, dass es über der Stahlplatte ausgerichtet ist. Wählen Sie das geeignete Kugellager basierend auf der gewünschten Schwere der Verletzung. Lassen Sie das Kugellager aus einer vorgegebenen Höhe das Rohr hinunter auf die Stahlplatte fallen.Legen Sie dann die verletzten Fische in das Bergungsbecken, um überwacht zu werden. Füllen Sie eine Petrischale mit Modelliermasse und schaffen Sie einen kleinen Hohlraum, um den Körper während der Dissektion zu unterstützen. Legen Sie den Fisch mit der Rückenseite nach oben in die Tonform.Platzieren Sie zwei Sezierstifte, einen durch die Mittellinie auf halber Höhe des Körpers und den anderen etwa 5 Millimeter hinter der Basis des Kopfes. Verwenden Sie ein Paar 5 Dumont-Pinzetten, um den Sehnerv stumpf zu durchtrennen und die Augen zu entfernen. Legen Sie ein Ende der 5 Pinzetten unter die rechte Parietalplatte.Machen Sie eine absichtliche Scherenaktion, die sich in Richtung des Rostralendes bewegt, und entfernen Sie die rechte Frontplatte. Drehen Sie dann den Fisch um 90 Grad im Uhrzeigersinn. Legen Sie ein Ende der 5 Pinzetten unter die linke Parietalplatte und verwenden Sie die gleiche Scherenbewegung, um die linken Parietal- und Frontalplatten zu entfernen und den gesamten dorsalen Aspekt des Gehirns freizulegen.Verwenden Sie die 5 Pinzetten, um den Oberkiefer stumpf zu durchschneiden, so dass die Riechkolben erhalten bleiben und nicht beschädigt werden. Entfernen Sie mit derselben Pinzette den rechten Operkel, den Präoperkel, den Interoperkel und den Suboperkel. Resezieren Sie dann stumpf die Muskulatur am kaudalen Ende des Kalvarienbergs, um das Rückenmark freizulegen.Mit der Pinzette stumpf das Rückenmark transektieren. Legen Sie die Pinzette vorsichtig unter das Gehirn und entfernen Sie das Gehirn vorsichtig aus dem Kalvarienberg. Sezieren Sie das gesamte Gehirn oder die Region von Interesse mit den Anweisungen im Textmanuskript und legen Sie das Gehirn sofort mit einer feinen Pinzette auf ein kleines Wiegeboot, wobei Sie darauf achten, das Gehirn nicht zu erstechen oder zu kratzen.Übertragen Sie das Gehirn auf das geteerte Trocknungswiegeboot und zeichnen Sie das nasse Gewicht des Gehirns auf. Richten Sie die Gehirne so aus, dass sie flach auf dem Wiegeboot mit der Rückenseite nach oben liegen. Dann legen Sie das Gehirn und das Trocknungswiegeboot für acht Stunden in einen Hybridisierungsofen, der auf 60 Grad Celsius eingestellt ist.Um das Gehirn auf ein neues geteertes kleines Wiegeboot zu übertragen, sobald es trocken ist, kneifen Sie die feine Pinzette zusammen und schöpfen Sie ab der ventralen Seite des Gehirns eine Aufwärtsbewegung ein. Machen Sie einen Teilschnitt auf einem nassen Schwamm. Legen Sie einen Fisch nach dem anderen mit der ventralen Seite nach oben in die Öffnung und injizieren Sie mit einer 30-Gauge-Nadel etwa 40 Mikroliter 10 Millimol EdU in den Körper des Fisches.Dann bringen Sie den Fisch in den mit Systemwasser gefüllten Fäkalientank zurück. Sammeln Sie die Gehirne wie bereits erwähnt und legen Sie sie als Gruppe in eine 9-Milliliter-Glasfläschchen mit 2 Millilitern von neun Teilen 100% Ethanol zu einem Teil 37% Formaldehyd. Fixiere die Gehirne bei 4 Grad Celsius auf einer Wippplattform.Verwenden Sie ein Kryostatenfutter, um die Gehirne in TFM in der gewünschten Ausrichtung auf Trockeneis einzubetten. Vaskuläre Verletzungen erwiesen sich als eine der einfachsten und prominentesten Pathologien, um erfolgreiche Verletzungen über dieses Modell zu identifizieren. Die Fähigkeit, den Indikator zu identifizieren, änderte sich mit dem Stamm der Fische, die während der Verletzung verwendet wurden.Die Identifizierung einer Gefäßverletzung bei Wildtyp AB war aufgrund der Pigmentierung schwer zwischen leichtem oder mittelschwerem TBI und unbeschädigten Kontrollfischen zu unterscheiden. Nach einer Verletzung zeigten die milden TBI-Fische minimale Oberflächenabschürfungen, während die moderaten TBI-Fische eine begrenzte Hirnblutung aufwiesen. Das Ausmaß der Verletzung zeigte sich bei schweren TBI-Fischen.Im Gegensatz dazu können Gefäßverletzungen bei der Verwendung von Albino- oder Casperfischen leicht identifiziert werden. Schwellungen des Großhirns aufgrund von Verletzungen wurden anhand von Ödemen beurteilt. Im Gegensatz dazu wiesen sowohl moderate TBI als auch schwere TBI signifikante Ödeme, 1 dpi und 3 dpi auf, aber der Flüssigkeitsgehalt sowohl von moderatem TBI als auch von schwerem TBI kehrte zu einem Niveau zurück, das einer unbeschädigten Kontrolle von 5 dpi ähnelte.Diese stumpfe Kraftverletzung führte zu einer robusten Zellproliferationsantwort, die sich über die Neuroachse erstreckt. Eine erhöhte EdU-Markierung wurde in den ventrikulären und subventrikulären Zonen des Vorderhirns im Vergleich zu unbeschädigten Kontrollen beobachtet. Die verletzten Gehirne zeigten eine erhöhte EdU-Markierung in der periventrikulären Grauzone, den optischen Tektallappen und Aspekten des vorderen Hypothalamus im Vergleich zum unbeschädigten Fischgehirn.Nach schweren TBI zeigten neurogene Regionen im Hinterhirn im Vergleich zum unbeschädigten Gehirn eine erhöhte Zellproliferation. Stellen Sie für eine ordnungsgemäße Induktion der Verletzung sicher, dass die Fische in der Form gesichert und stabil sind und dass der Schlauch gerade ist, um einen außermittigen Aufprall zu vermeiden oder die Gewichtsabfallbahn zu verändern. Dieses Verfahren bietet eine schnelle und kostengünstige Induktionsmethode für stumpfe Gewaltverletzungen, die auf ein regeneratives Modell angewendet wird, das insbesondere für wiederholte Kopfverletzungen oder verletzungsinduzierte regenerative Studien geeignet wäre.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Ein Optic Nerve Crush Injury Mausmodell zur retinalen Ganglienzellen Survival Study

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Forschung

Neurowissenschaften

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Mikromanipulation der Genexpression in der Erotik-Zebrafischgehirn Mit cerebroventricular Mikroinjektion von Morpholino Oligonukleotiden

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Elektrophysiologische Aufnahme im Gehirn von erwachsenen Zebrafisch Intact

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Stichwunde Verletzung des Zebrafisch Erwachsene Telen: eine Methode, um Wirbel Gehirn Neurogenese und Regeneration Untersuchen

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

Das olfaktorische System als Modell zur Axonal Wachstumsmuster und Morphologie Studieren<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Auswirkungen der Explosion-induzierte Neurotrauma auf Druck Nagetier mittlerer Hirnarterien

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

Facial Nerve Surgery in the Rat Model to Study Axonal Inhibition and Regeneration

Gesichtsnervenchirurgie im Rattenmodell zur Untersuchung der axonalen Hemmung und Regeneration

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial ...

Using Zebrafish Larvae to Study the Pathological Consequences of Hemorrhagic Stroke

Verwendung von Zebrafisch-Lamellen, um die pathologischen Folgen von hämorrhagischen Stroke zu studieren

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage ...

Combining Behavior and EEG to Study the Effects of Mindfulness Meditation on Episodic Memory

Kombination von Verhalten und EEG, um die Auswirkungen von Achtsamkeitsmeditation auf das episodische Gedächtnis zu untersuchen

Although there has been recent interest in how mindfulness meditation can affect episodic memory as well as brain structure and function, no study has ...

A Metric Test for Assessing Spatial Working Memory in Adult Rats Following Traumatic Brain Injury

Ein metrischer Test zur Beurteilung des räumlichen Arbeitsgedächtnisses bei erwachsenen Ratten nach traumatischer Hirnverletzung

Impairments to sensory, short-term, and long-term memory are common side effects after traumatic brain injury (TBI). Due to the ethical limitations of ...