Name: serial block-face scanning electron microscopy (sbem) for the study of dendritic spines
Uploaded: 2021-10-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines at JoVE.com

Визуализация SBEM, визуализация световой микроскопии и электронная микроскопия пробоподготовки были выполнены с использованием оборудования Лаборатории визуализации тканей и функций, которая служит основным оборудованием визуализации в Институте экспериментальной биологии Ненцки.
Для приготовления рисунка 1 использовали изображение мыши (Souris_02) и флакон с https://smart.servier.com/.
Эта работа была поддержана грантом Национального научного центра (Польша) Opus (UMO-2018/31/B/NZ4/01603), присужденным КР.

Исследование проводилось в соответствии с руководящими принципами Института Ненцки и разрешением Местного этического комитета. Исследования проводились в соответствии с Директивой Совета Европейских сообществ от 24 ноября 1986 года (86/609/EEC), Законом о защите животных Польши и одобрены п...

<ol>
	<li>Bosch, M., Hayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+dendritic+spines.">Structural plasticity dendritic spines.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).</li><li>Borczyk, M., Radwanska, K., Giese, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+ultrastructural+analysis+of+memory.">The importance of ultrastructural analysis of memory.</a> Brain Research Bulletin. 173, 28-36 (2021).</li><li>Wanner, A. A., Kirschmann, M. A., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+of+microtome-based+serial+block-face+scanning+electron+microscopy+in+neuroscience:+challenges+of+SBEM+in+neuroscience.">Challenges of microtome-based serial block-face scanning electron microscopy in neuroscience: challenges of SBEM in neuroscience.</a> Journal of Microscopy. 259 (2), 137-142 (2015).</li><li>&#346;liwi&#324;ska, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+Memory+Upscales+Volume+of+Postsynaptic+Densities+in+the+Process+that+Requires+Autophosphorylation+of+&#945;CaMKII.">Long-term Memory Upscales Volume of Postsynaptic Densities in the Process that Requires Autophosphorylation of &#945;CaMKII.</a> Cerebral Cortex. 30 (4), 2573-2585 (2020).</li><li>Borczyk, M., &#346;liwi&#324;ska, M. A., Caly, A., Bernas, T., Radwanska, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+plasticity+affects+correlation+between+the+size+of+dendritic+spine+and+its+postsynaptic+density.">Neuronal plasticity affects correlation between the size of dendritic spine and its postsynaptic density.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1693 (2019).</li><li>Leighton, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEM+images+of+block+faces,+cut+by+a+miniature+microtome+within+the+SEM+-+a+technical+note.">SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note.</a> Scanning Electron Microscopy. , 73-76 (1981).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+Block-Face+Scanning+Electron+Microscopy+to+Reconstruct+Three-Dimensional+Tissue+Nanostructure.">Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure.</a> PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).</li><li>Smith, D., Starborg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block+face+scanning+electron+microscopy+in+cell+biology:+Applications+and+technology.">Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology.</a> Tissue and Cell. 57, 111-122 (2019).</li><li>Titze, B., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+scanning+electron+microscopy+for+imaging+biological+ultrastructure:+Volume+scanning+electron+microscopy.">Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure: Volume scanning electron microscopy.</a> Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).</li><li>Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , 6-8 (2010).</li><li>Willingham, M. C., Rutherford, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+osmium-thiocarbohydrazide-osmium+(OTO)+and+ferrocyanide-reduced+osmium+methods+to+enhance+membrane+contrast+and+preservation+in+cultured+cells.">The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 32 (4), 455-460 (1984).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Neuronal+Subsets+in+Transgenic+Mice+Expressing+Multiple+Spectral+Variants+of+GFP.">Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2004).</li><li>Walton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lead+aspartate,+an+en+bloc+contrast+stain+particularly+useful+for+ultrastructural+enzymology.">Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).</li><li>Mercer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+scheme+for+section+staining+in+electron+microscopy.">a scheme for section staining in electron microscopy.</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 81 (3-4), 179-186 (1963).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+Image+Browser:+A+Platform+for+Segmentation+and+Analysis+of+Multidimensional+Datasets.">Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets.</a> PLOS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).</li><li>Fiala, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruct:+a+free+editor+for+serial+section+microscopy.">Reconstruct: a free editor for serial section microscopy.</a> Journal of Microscopy. 218 (1), 52-61 (2005).</li><li>Roels, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interactive+ImageJ+plugin+for+semi-automated+image+denoising+in+electron+microscopy.">An interactive ImageJ plugin for semi-automated image denoising in electron microscopy.</a> Nature Communications. 11 (1), 771 (2020).</li><li>Radwanska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+for+long-term+memory+formation+when+synaptic+strengthening+is+impaired.">Mechanism for long-term memory formation when synaptic strengthening is impaired.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (45), 18471-18475 (2011).</li><li>Kittelmann, M., Hawes, C., Hughes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block+face+scanning+electron+microscopy+and+the+reconstruction+of+plant+cell+membrane+systems:+SBFSEM+Methods+for+Plant+Cells.">Serial block face scanning electron microscopy and the reconstruction of plant cell membrane systems: SBFSEM Methods for Plant Cells.</a> Journal of Microscopy. 263 (2), 200-211 (2016).</li><li>Fendrych, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+Cell+Death+Controlled+by+ANAC033/SOMBRERO+Determines+Root+Cap+Organ+Size+in+Arabidopsis.">Programmed Cell Death Controlled by ANAC033/SOMBRERO Determines Root Cap Organ Size in Arabidopsis.</a> Current Biology. 24 (9), 931-940 (2014).</li><li>Russell, M. R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+correlative+light+and+electron+microscopy+of+cultured+cells+using+serial+blockface+scanning+electron+microscopy.">3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy.</a> Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).</li><li>P&#322;achno, B. J., &#346;wi&#261;tek, P., Jobson, R. W., Ma&#322;ota, K., Brutkowski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block+face+SEM+visualization+of+unusual+plant+nuclear+tubular+extensions+in+a+carnivorous+plant+(Utricularia,+Lentibulariaceae).">Serial block face SEM visualization of unusual plant nuclear tubular extensions in a carnivorous plant (Utricularia, Lentibulariaceae).</a> Annals of Botany. 120 (5), 673-680 (2017).</li><li>Genoud, C., Titze, B., Graff-Meyer, A., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Homogeneous+En+Bloc+Staining+of+Large+Tissue+Samples+for+Volume+Electron+Microscopy.">Fast Homogeneous En Bloc Staining of Large Tissue Samples for Volume Electron Microscopy.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, (2018).</li><li>Puhka, M., Joensuu, M., Vihinen, H., Belevich, I., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+sheet-to-tubule+transformation+is+a+general+mechanism+for+endoplasmic+reticulum+partitioning+in+dividing+mammalian+cells.">Progressive sheet-to-tubule transformation is a general mechanism for endoplasmic reticulum partitioning in dividing mammalian cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (13), 2424-2432 (2012).</li><li>Gluenz, E., Wheeler, R. J., Hughes, L., Vaughan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+and+three-dimensional+electron+microscopy+methods+for+the+study+of+Trypanosoma+brucei+and+Leishmania+mexicana+flagella.">Scanning and three-dimensional electron microscopy methods for the study of Trypanosoma brucei and Leishmania mexicana flagella.</a> Methods in Cell Biology. 127, 509-542 (2015).</li><li>Starborg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+transmission+electron+microscopy+and+3View+to+determine+collagen+fibril+size+and+three-dimensional+organization.">Using transmission electron microscopy and 3View to determine collagen fibril size and three-dimensional organization.</a> Nature Protocols. 8 (7), 1433-1448 (2013).</li><li>Hughes, L., Borrett, S., Towers, K., Starborg, T., Vaughan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+organelle+ontogeny+through+a+cell+cycle+revealed+by+whole-cell+reconstructions+using+3D+electron+microscopy.">Patterns of organelle ontogeny through a cell cycle revealed by whole-cell reconstructions using 3D electron microscopy.</a> Journal of Cell Science. 130 (3), 637-647 (2017).</li><li>Bojko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Autophagic+Flux+in+Escapers+from+Doxorubicin-Induced+Senescence/Polyploidy+of+Breast+Cancer+Cells.">Improved Autophagic Flux in Escapers from Doxorubicin-Induced Senescence/Polyploidy of Breast Cancer Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6084 (2020).</li><li>Knott, G. W., Holtmaat, A., Trachtenberg, J. T., Svoboda, K., Welker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+preparing+GFP-labeled+neurons+previously+imaged+in+vivo+and+in+slice+preparations+for+light+and+electron+microscopic+analysis.">A protocol for preparing GFP-labeled neurons previously imaged in vivo and in slice preparations for light and electron microscopic analysis.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1145-1156 (2009).</li><li>Glauert, A. M., Lewis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological specimen preparation for transmission electron microscopy. , (2014).</li><li>Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Synapse+Formation+in+the+Adult+Somatosensory+Cortex+of+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Heterozygote+Mice.">Altered Synapse Formation in the Adult Somatosensory Cortex of Brain-Derived Neurotrophic Factor Heterozygote Mice.</a> Journal of Neuroscience. 24 (10), 2394-2400 (2004).</li></ol>

Существует множество вариаций первичного метода NCMIR, описанного Диринком в 2010 году10. Основные принципы остаются прежними, но в зависимости от типа изучаемого материала вносятся незначительные изменения. Ранее было описано, что различные смолы могут быть использованы для ?...

Большинство возбуждающих синапсов в центральной нервной системе расположены на дендритных шипах - небольших выступах мембраны нейрона. Эти протрузии образуют замкнутые биохимические компартменты, которые контролируют внутриклеточную трансдукцию сигнала. Структурная пластичность дендритных шипов и синапсов тесно связана с функциональными изменениями синаптической эффективности, лежащими в основе таких важных процессов, как обучение и память1,2. Важно отметить, что электронная микроскопия (ЭМ) является единственным методом, позволяющим определить, имеет ли дендритный позвоночник пресинаптический вход. Разрешение ЭМ также необходимо для изучения ультраструктурных деталей, таких как форма постсинаптической плотности (PSD), представляющая собой постсинаптическую часть синапса, или размеры дендритного позвоночника, а также размер и форма аксонального бутона. Кроме того, с помощью ЭМ можно визуализировать синапсы и их окружение.
Благодаря достижениям в области визуализации и вычислительных технологий можно реконструировать целые нейронные цепи. Методы объемной электронной микроскопии, такие как просвечивающая электронная микроскопия с последовательным сечением (ssTEM), последовательная блочная сканирующая электронная микроскопия (SBEM) и сфокусированная ионно-лучевая сканирующая электронная микроскопия (FIB-SEM), обычно используются для реконструкций нейронныхцепей 3.
В наших исследованиях метод SBEM успешно используется для исследования структурной пластичности дендритных шипов и PSD в образцах гиппокампа мыши и органотипических срезов мозга 4,5. SBEM основан на установке миниатюрного ультрамикротома внутри камеры сканирующего электронного микроскопа6,7,8,9. Верхняя часть блока образца визуалируется, а затем образец разрезается на заданную глубину ультрамикротомом, выявляя новую грань блока, которая снова визуализирована, а затем процесс повторяется8. В результате остается только изображение грани блока, в то время как вырезанный срез теряется в виде обломков. Вот почему SBEM называют деструктивной техникой, что означает, что невозможно снова изобразить одно и то же место. Однако преимущество деструктивных методов on-block заключается в том, что они не страдают от проблем деформации и потери секций, что может существенно повлиять на качество данных и анализ данных3. Кроме того, SBEM дает возможность изображения относительно большого поля зрения (> 0,5 мм × 0,5 мм) при высоком разрешении3.
Чтобы использовать SBEM, образцы должны быть подготовлены в соответствии со специальным, высококонтрастным протоколом из-за обратно рассеянного электронного детектора, используемого для получения изображений. Здесь мы покажем, как выполнять пробоподготовку по протоколу, основанному на процедуре, разработанной Методом Deerinck10 (Метод Национального центра микроскопии и визуализации (NCMIR)), с использованием восстановленных пятен осмий-тиокарбогидразид-осмий (rOTO), разработанных в 1980-хгодах8,11. Кроме того, мы вводим двухэтапный подход фиксации, с мягкой фиксацией перфузии, что позволяет использовать один и тот же мозг как для иммунофлуоресцентных исследований с помощью световой микроскопии, так и SBEM.
В протоколе мозг мыши в первую очередь фиксируется мягким фиксатором, а затем разрезается на половинки, а одно полушарие постфиксируется и готовится к иммунофлуоресценции (ИФ), а другое для ЭМ-исследований(Рисунок 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62712/62712fig01.jpg"> Рисунок 1. Схематическое представление рабочего процесса подготовки дендритных шипов к анализу с помощью SBEM. Мышей приносили в жертву и перфузировали мягким первичным фиксатором. Мозг разрезали на половинки, и одно полушарие было постфиксировано иммунофлуоресцентным (IF) фиксатором, криопротекционировано, разрезано с использованием криостата и обработано для исследований ПЧ, в то время как другое полушарие было постфиксировано ЭМ-фиксатором, разрезано вибратомом и подготовлено для эм-исследований. Срезы мозга для исследований SBEM были противопоставлены, плоско встроены в смолу, затем область CA1 гиппокампа была установлена на штифт и изображена с помощью SBEM(рисунок 1). Часть протокола, выделенная в желтом поле, была показана в видео. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62712/62712fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthetic:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine/xylazine mixture (Ketamina/Sedazin)</td>
			<td>Biowet Pulawy, Pulawy, Poland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital (Morbital)</td>
			<td>Biowet Pulawy, Pulawy, Poland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixatives:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (GA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>G5882</td>
			<td>Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>POCH, Gliwice, Poland</td>
			<td>575283115</td>
			<td>pure p.a.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>441244</td>
			<td>prilled, 95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td>tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>S5881</td>
			<td>reagent grade, <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png" />98%, pellets (anhydrous)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large blunt/blunt curved scissors (~14.5 cm)</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>14519-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-spatula (double 2&#34; flat ends, one rounded, one tapered to 1/8&#34;)</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>10091-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle tip, 15 GA, blunt (perfusion needle)</td>
			<td>KD Medical GmbH Hospital Products, Berlin, Germany</td>
			<td>KD-FINE 900413</td>
			<td>1.80 x 40 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pair of fine (Graefe) tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>11050-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Lead Fluid</td>
			<td>BQ80S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic vials</td>
			<td>Profilab, Warsaw, Poland</td>
			<td>534.02</td>
			<td>plastic vials with blue cap for tissue storage, 20 ml, 31 x 48 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight iris scissors (~9 cm)</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain slices preparation for EM:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>NEST, Rahway, NJ, USA</td>
			<td>712001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylic glue</td>
			<td>Fenedur, Montevideo, Uruguay</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>72632</td>
			<td>20 ml Scintillation Vial, a pack of 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>612-4545</td>
			<td>LDPE, disposable, 7.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Wilkinson Sword, London, UK</td>
			<td></td>
			<td>Classic double edge safety razor blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Swann-Morton, Sheffield, UK</td>
			<td>No. 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>Leica VT1000 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain slices preparation for IF:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>NEST, Rahway, NJ, USA</td>
			<td>701101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criostat</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>Leica CM 1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol</td>
			<td>Bioshop, Burlington, Canada</td>
			<td>ETH001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-profile disposable blade 819</td>
			<td>Leica Biosystems Inc., USA</td>
			<td>14035838925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Swann-Morton, Sheffield, UK</td>
			<td>No. 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide (NaN3)</td>
			<td>POCH, Gliwice, Poland</td>
			<td>792770426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>POCH, Gliwice, Poland</td>
			<td>772090110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue freezing medium for cryosectioning, OCT-Compound</td>
			<td>Leica Biosystems, Switzerland</td>
			<td>14020108926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostaining:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>NEST, Rahway, NJ, USA</td>
			<td>702001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Post Synaptic Density Protein 95 Antibody</td>
			<td>Merck-Millipore, Burlington, MA, USA</td>
			<td>MAB1598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Zeiss Spinning Disc microscope (63 &#215; oil objective, NA 1.4, pixel size 0.13 &#181;m &#215; 0.13 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slide</td>
			<td>Menzel Glaser, Braunschweig, Germany</td>
			<td>B-1231</td>
			<td>24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>A31570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>AGAA00008</td>
			<td>SuperFrost</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>JWElectronic, Warsaw, Poland</td>
			<td>KL-942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonT X-100 Reagent Grade</td>
			<td>Bioshop, Burlington, Canada</td>
			<td>TRX506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron microsocpy sample preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate</td>
			<td>POCH, Gliwice, Poland</td>
			<td>746980113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aclar 33C Film</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>50425</td>
			<td>Fluoropolymer Film embedding sheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP-30, 2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>T58203</td>
			<td>Epoxy embedding medium accelerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM single component A, M</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>44611</td>
			<td>Durcupan ACM single component A, M epoxy resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM single component B</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>44612</td>
			<td>Durcupan ACM single component B, hardener 964</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM single component D</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>44614</td>
			<td>Durcupan ACM single component D , plasticizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol absolute</td>
			<td>POCH, Gliwice, Poland</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td>Ethyl alcohol absolute 99.8 % pure P.A.-BASIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genlab laboratory oven</td>
			<td>Wolflabs, York, UK</td>
			<td>Mino/18/SS</td>
			<td>Oven Genlab MINO/18/SS 18l volume, no fan circulation, no digital display, standard temperature gradient, standard recovery rate, no timer, 250&#176;C maximum temperature, 240V electrical supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>A-9256</td>
			<td>reagent grade, <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png" />98% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead (II) nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>467790</td>
			<td><img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png" />99.95% trace metals basis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>75632</td>
			<td>for electron microscopy, 4% in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Elmetron, Zabrze, Poland</td>
			<td>CP-5-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>BioSan, J&#243;zef&#243;w, Poland</td>
			<td>Multi Bio RS-24</td>
			<td>rotator Multi Bio RS-24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>S5881</td>
			<td>reagent grade, <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png" />98%, pellets (anhydrous)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunflower mini shaker</td>
			<td>Grant bio, Shepreth,UK</td>
			<td>PD-3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Millipore, Burlington, MA, USA</td>
			<td>SLGP033NB</td>
			<td>0,22 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>88535</td>
			<td>purum p.a., for electron microscopy, <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png" />99.0% (N)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Serva, Heidelberg, Germany</td>
			<td>77870</td>
			<td>Uranyl acetate&#183;2H2O, research grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>WSL, Swietochlowice, Poland</td>
			<td>LWT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen mounting for SBEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>734-2782</td>
			<td>96-well plates, round bottom, non treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AM Gatan 3View stub handling tweezers</td>
			<td>Micro to Nano, Haarlem, Netherlands 
			Netherlands</td>
			<td>50-001521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular</td>
			<td>OPTA-TECH, Warsaw, Poland</td>
			<td>X2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive glue</td>
			<td>Chemtronics, Georgia, USA</td>
			<td>CW2400</td>
			<td>conductive eopxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gatan 3View sample pin stubs</td>
			<td>Micro to Nano, Haarlem, Netherlands 
			Netherlands</td>
			<td>10-006003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>P7793</td>
			<td>roll size 20&#160;in. &#215; 50&#160;ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco conductive silver paint</td>
			<td>Ted Pella, Redding, CA, USA</td>
			<td>16062-15</td>
			<td>PELCO&#174;&#160;Conductive Silver Paint, 15g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades double edge</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>72000</td>
			<td>Stainless Steel &#34;PTFE&#34; coated. PERSONNA brand .004&#34; thick, wrapped individually, 250 blades in a box.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Sigma VP with Gatan 3View2 chamber, acceleration voltage 2.5 kV, variable pressure 5 Pa, aperture 20 &#181;m, dwell time 6 &#181;s, slice thickness 60 nm, magnification 15 000 x, image resolution 2048 x 2048 pixels, pixel size 7.3 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trim 90&#176; diamond knife</td>
			<td>Diatome Ltd., Nidau, Switzerland</td>
			<td>DTB90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>Leica ultracutR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td>webpage</td>
			<td></td>
			<td>tutorials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FijiJ</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Image Browser</td>
			<td>http://mib.helsinki.fi/</td>
			<td></td>
			<td>http://mib.helsinki.fi/tutorials.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reconstruct</td>
			<td>https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0</td>
			<td></td>
			<td>https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Adult 3-month old and&#160;20&#177;1&#160;month old&#160;female&#160;Thy1-GFP(M) mice (Thy1-GFP +/-) (Feng et al.,2000) which express GFP in a sparsely distributed population of glutamatergic neurons. Animals were bred as heterozygotes with the C57BL/6J background in the Animal House of the Nencki Institute of Experimental Biology.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

serial block-face scanning electron microscopy (sbem) for the study of dendritic spines

Трехмерная электронная микроскопия (3D EM) дает возможность анализировать морфологические параметры дендритных шипов с наноразмерным разрешением. Кроме того, некоторые особенности дендритных шипов, такие как объем позвоночника и постсинаптическая плотность (PSD) (представляющая постсинаптическую часть синапса), наличие пресинаптического терминала и гладкого эндоплазматического ретикулума или атипичной формы PSD (например, мультииннервированные шипы), могут наблюдаться только при 3D EM. Используя последовательную блочно-лицевую сканирующую электронную микроскопию (SBEM), можно получить 3D EM-данные проще и воспроизводимее, чем при выполнении традиционного последовательного сечения. Здесь мы покажем, как подготовить образцы гиппокампа мышей для анализа SBEM и как этот протокол можно сочетать с иммунофлуоресцентным исследованием дендритных шипов. Мягкая фиксация перфузии позволяет проводить иммунофлуоресцентные исследования с помощью световой микроскопии на одной половине мозга, в то время как другая половина была подготовлена к SBEM. Такой подход уменьшает количество животных, которые будут использоваться для исследования.

Используя описанный выше метод высокой контрастности, можно получить изображения ткани мозга мыши с хорошим разрешением. Большое поле зрения, обеспечиваемое техникой SBEM, облегчает точный выбор интересуемой области. Большое изображение области CA1 гиппокампа было сделано для измерения...

Watch this Scientific Journal Video about Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines at JoVE.com

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines

Последовательная блочно-лицевая сканирующая электронная микроскопия (SBEM) применяется для изображения и анализа дендритных шипов в мышином гиппокампе.

Последовательная блочно-лицевая сканирующая электронная микроскопия (SBEM) для исследования дендритных шипов

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...

Каждый нейрон в мозге связан с другими нейронными клетками примерно 7000 синапсами. За исключением того, что эти синапсы в мозге млекопитающих в основном расположены на небольших выступах мембраны, называемых дендритными шипами. Пластичность синапсов и дендритных шипов и т.д., такие важные функции мозга, как процессы обучения и памяти.Важно отметить, что только электронная микроскопия дает полное представление о том, имеет ли дендритный позвоночник постсинаптический вход. Доступны различные методы визуализации дендритных шипов. Однако последовательная блочная сканирующая электронная микроскопия дает уникальную возможность получить изображение большого объема ткани с высоким разрешением.Метод последовательной блочной сканирующей электронной микроскопии требует специального протокола пробоподготовки, который включает в себя сильное контрастирование с тяжелыми металлами. Моя первичная фиксация во время перфузии позволила нам использовать тот же мозг для осветленной электронной микроскопии. Мышей приносили в жертву и перфузировали мягким первичным фиксатором.Мозг разрезали на половинки, а одно полушарие постфиксировали иммунофлуоресцентным специальным фиксатором, криопротектором, разрезали с помощью криостата и обрабатывали для иммунофлуоресцентных исследований. Где другое полушарие было постфиксировано с помощью электронной микроскопии фиксатором, разрезано вибратомом и подготовлено для исследований электронной микроскопии. Срезы мозга для серийных блочных сканирующей электронной микроскопии были противопоставлены, плоско встроены в смолу, затем область CA1 гиппокампа была установлена на штырь и визуалирована с помощью последовательного сканирующего электронного микроскопа на основе блоков.Часть протокола, выделенная в желтом поле, была показана в видео. Возьмите ткань, которая была зафиксирована, и нарежьте на 100 микробиотических ломтиков и промыть ее холодным фосфатным буфером пять раз в течение трех минут каждая. Приготовьте смесь один к одному из 4% тетроксида осмия и 3% ферроцианида калия.Конечный продукт станет коричневым. Погрузите образцы в эту смесь. Затем поместите образцы на лед.И с этого этапа важно защищать их от света. Высиживать их с легким встряхиванием в течение одного часа. Тем временем приготовьте раствор ТХ.Смешайте 10 миллилитра двойной дистиллированной воды и 0,1 грамма ТГ. Поместите его в духовку, установленную при 60 градусах Цельсия, на один час. Важно время от времени взмахивать раствором.Когда он будет готов, охладите его до комнатной температуры. Теперь промыть образцы двойной дистиллированной водой пять раз по три минуты каждый, а затем погрузить их в фильтрованный раствор ТП. Срезы почернеют.Инкубировать их в течение 20 минут при комнатной температуре. Промыть образцы двойной дистиллированной водой пять раз по три минуты каждый и инкубировать их с 2% тетроксидом осмия в течение 30 минут, на этот раз при комнатной температуре. Опять же, промыть образцы двойной дистиллированной водой пять раз в течение трех минут каждый и поместить их в фильтрованный 1% или амилацетат.Высиживают их при четырех градусах Цельсия в течение ночи. На следующий день начинают с препарата D-аспартата. Смешайте нитрат свинца с раствором аспарагиновой кислоты, предварительно нагретым до 60 градусов Цельсия.Поместите смесь на водяную баню, установленную при 60 градусах Цельсия, и отрегулируйте рН до 5,5 с помощью одного молярного гидроксида натрия. Закройте флакон аспартатом свинца и оставьте его при 60 градусах Цельсия на 30 минут. Решение должно быть ясным.Если он становится мутным, его необходимо выбросить, и нужно подготовить новый. Тем временем промыть образцы газообразной двойной дистиллированной водой пять раз по три минуты каждый и держать их в духовке при 60 градусах Цельсия в течение 30 минут. Погрузите образцы в свежеприготовленный раствор аспартата свинца и инкубируете их в духовке, установленной при 60 градусах Цельсия, в течение 20 минут.Готовят эпоксидную смолу. Взвесьте ингредиенты и хорошо перемешайте смолу в течение не менее 30 минут, прежде чем добавлять ускоритель DMP 30. Готовят вирус с градуированной разведением этанола.Затем доберите образцы из духовки и снова вымойте их двойной дистиллированной водой пять раз в течение трех минут каждый. Тем временем смешайте смолу со 100% этанолом в пропорции один к одному, чтобы получить 50% смолу. Хорошо перемешать.После этого обезвоживают образцы в каждом разведении этанола в течение пяти минут. Помните, что образцы никогда не должны полностью высыхать. Проникайте в образцы сначала в 50% смолу в течение 30 минут, затем в 100% смолу в течение одного часа, а затем снова в свежую 100% смолу на ночь.На следующий день поместите образцы в свежую 100% смолу на один час, а затем вставьте их между листами встраивания фторполимера. Подготовьте кусочки встраиваемого листа, которые были смазаны этанолом, и отложите в сторону стеклянные слайды, которые будут использоваться в качестве поддержки. Поместите кусок встраиваемого листа на стеклянную горку, нанесите на него каплю смолы, затем аккуратно перенесите образец с использованием деревянной палочки.Накройте его вторым куском. Старайтесь избегать пузырьков воздуха. Будьте нежны, так как ткань очень хрупкая.Осторожно поместите еще один стеклянный слайд поверх куска встраиваемого листа и отвержьте образец в духовке при 70 градусах Цельсия в течение не менее 48 часов. Отделите слои и вырежьте кусок встроенного образца лезвием бритвы. Перенесите его в парафин.Это позволит свести к минимуму опасность потери образца из-за электростатики. Возьмите алюминиевый штифт, который был смазан этанолом. Смешайте проводящий эпоксидный колодец и используйте небольшое его количество, чтобы закрепить образец на штифте.Отверждаем проводящей эпоксидной смолой при 70 градусах Цельсия в течение 10 минут. Обрежьте каждую сторону блока образца алмазным ножом, а затем отполируйте лицевую часть блока до тех пор, пока ткань не подвергется воздействию. Измельчите образец на штифт с помощью проводящей краски и отверждим его.Чтобы свести к минимуму зарядку, образцы также должны быть покрыты тонким слоем золота или золотого палладия. Поместите штифт с образцом в камеру серийного блочного сканирующего электронного микроскопа. Выровняйте образец по ножу, затем закройте камеру и задайте параметры.Соберите стопку изображений. С помощью описанного метода были получены изображения мозговой ткани мыши. Было сделано большое изображение гиппокампа одной области, и изображение было установлено в центре луща радиата.Была получена стопка изображений и сегментированы объекты интереса, такие как дендритные шипы и синапсы. Морфология тканей хорошего качества была получена с хорошо видимыми мембранами и синаптическими везикулами и хорошо сохранившимися митохондриями. Иммунофлуоресцентные исследования антител PSD 95 подтвердили, что легкая первичная фиксация и традиционная фиксация с 4% PFA дают сопоставимые результаты.Представленный протокол позволяет получать изображения тканей головного мозга с использованием серийной блочной сканирующей электронной микроскопии, высококачественной морфологии тканей, а 12 видимых мембран облегчают 10 правой сегментации и реконструкции. Моя первичная фиксация позволила использовать один и тот же мозг для анализа иммунофлуоресценции PSD 95 и электронной микроскопии, визуализирующей дендритные шипы. Здесь мы используем PSE 9, 500 budding.Тем не менее, другой может быть использован также.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Флуоресценция Восстановление после фотообесцвечивания (FRAP) флуоресценции меткой Белки в Дендритные Шипы культивированный нейронов гиппокампа

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

Сосредоточены ионного пучка фрезерные и сканирующей электронной микроскопии ткани мозга

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Напряжение чувствительные краски Запись с аксонов, дендритов и дендритных шипиков отдельных нейронов в срезах мозга

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Генетических манипуляций мозжечка Granule нейронов<em&gt; Экстракорпоральное</em&gt; И<em&gt; В Vivo</em&gt; По изучению нейронных Морфология и миграция

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Визуализация дендритных шипиков крысы первичной нейронов гиппокампа с помощью структурированного подсветки микроскопия

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Двухфотонное<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Визуализация дендритных шипиков в мыши Cortex Использование разреженных черепа Подготовка

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

Обонятельная система как модель для изучения характера роста аксонов и морфология<em&gt; В Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Анализ мозга Митохондрии Использование последовательного Block-Face сканирующая электронная микроскопия

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Очистка дендритной филоподии богатой фракцией

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

3D Modeling of Dendritic Spines with Synaptic Plasticity

3D моделирование дендритных шипов с синаптической пластичностью

Computational modeling of diffusion and reaction of chemical species in a three-dimensional (3D) geometry is a fundamental method to understand the ...