Name: serial block-face scanning electron microscopy (sbem) for the study of dendritic spines
Uploaded: 2021-10-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines at JoVE.com

Las imágenes SBEM, las imágenes de microscopía de luz y la preparación de muestras de microscopía electrónica se realizaron con el uso del equipo del Laboratorio de Imágenes de Tejido y Función que sirve como una instalación central de imágenes en el Instituto Nencki de Biología Experimental.
Para la preparación de la Figura 1, se utilizó la imagen de un ratón (Souris_02) y un vial del https://smart.servier.com/.
Este trabajo fue apoyado por el Centro Nacional de Ciencias (Polonia) Grant Opus (UMO-2018/31/B/NZ4/01603) otorgado a KR.

La investigación se realizó de conformidad con las directrices del Instituto Nencki y el permiso del Comité De Ética Local. Los estudios se llevaron a cabo de conformidad con la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas de 24 de noviembre de 1986 (86/609/CEE), Ley de Protección animal de Polonia y aprobados por el primer Comité de Ética Local en Varsovia. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el número de animales utilizados y su sufrimiento.
PRECAUCIÓN: Todos los pro...

<ol>
	<li>Bosch, M., Hayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+dendritic+spines.">Structural plasticity dendritic spines.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).</li><li>Borczyk, M., Radwanska, K., Giese, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+ultrastructural+analysis+of+memory.">The importance of ultrastructural analysis of memory.</a> Brain Research Bulletin. 173, 28-36 (2021).</li><li>Wanner, A. A., Kirschmann, M. 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A., Caly, A., Bernas, T., Radwanska, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+plasticity+affects+correlation+between+the+size+of+dendritic+spine+and+its+postsynaptic+density.">Neuronal plasticity affects correlation between the size of dendritic spine and its postsynaptic density.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1693 (2019).</li><li>Leighton, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEM+images+of+block+faces,+cut+by+a+miniature+microtome+within+the+SEM+-+a+technical+note.">SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note.</a> Scanning Electron Microscopy. , 73-76 (1981).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+Block-Face+Scanning+Electron+Microscopy+to+Reconstruct+Three-Dimensional+Tissue+Nanostructure.">Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure.</a> PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).</li><li>Smith, D., Starborg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block+face+scanning+electron+microscopy+in+cell+biology:+Applications+and+technology.">Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology.</a> Tissue and Cell. 57, 111-122 (2019).</li><li>Titze, B., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+scanning+electron+microscopy+for+imaging+biological+ultrastructure:+Volume+scanning+electron+microscopy.">Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure: Volume scanning electron microscopy.</a> Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).</li><li>Deerinck, T. 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R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+correlative+light+and+electron+microscopy+of+cultured+cells+using+serial+blockface+scanning+electron+microscopy.">3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy.</a> Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).</li><li>P&#322;achno, B. J., &#346;wi&#261;tek, P., Jobson, R. W., Ma&#322;ota, K., Brutkowski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block+face+SEM+visualization+of+unusual+plant+nuclear+tubular+extensions+in+a+carnivorous+plant+(Utricularia,+Lentibulariaceae).">Serial block face SEM visualization of unusual plant nuclear tubular extensions in a carnivorous plant (Utricularia, Lentibulariaceae).</a> Annals of Botany. 120 (5), 673-680 (2017).</li><li>Genoud, C., Titze, B., Graff-Meyer, A., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Homogeneous+En+Bloc+Staining+of+Large+Tissue+Samples+for+Volume+Electron+Microscopy.">Fast Homogeneous En Bloc Staining of Large Tissue Samples for Volume Electron Microscopy.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, (2018).</li><li>Puhka, M., Joensuu, M., Vihinen, H., Belevich, I., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+sheet-to-tubule+transformation+is+a+general+mechanism+for+endoplasmic+reticulum+partitioning+in+dividing+mammalian+cells.">Progressive sheet-to-tubule transformation is a general mechanism for endoplasmic reticulum partitioning in dividing mammalian cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (13), 2424-2432 (2012).</li><li>Gluenz, E., Wheeler, R. J., Hughes, L., Vaughan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+and+three-dimensional+electron+microscopy+methods+for+the+study+of+Trypanosoma+brucei+and+Leishmania+mexicana+flagella.">Scanning and three-dimensional electron microscopy methods for the study of Trypanosoma brucei and Leishmania mexicana flagella.</a> Methods in Cell Biology. 127, 509-542 (2015).</li><li>Starborg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+transmission+electron+microscopy+and+3View+to+determine+collagen+fibril+size+and+three-dimensional+organization.">Using transmission electron microscopy and 3View to determine collagen fibril size and three-dimensional organization.</a> Nature Protocols. 8 (7), 1433-1448 (2013).</li><li>Hughes, L., Borrett, S., Towers, K., Starborg, T., Vaughan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+organelle+ontogeny+through+a+cell+cycle+revealed+by+whole-cell+reconstructions+using+3D+electron+microscopy.">Patterns of organelle ontogeny through a cell cycle revealed by whole-cell reconstructions using 3D electron microscopy.</a> Journal of Cell Science. 130 (3), 637-647 (2017).</li><li>Bojko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Autophagic+Flux+in+Escapers+from+Doxorubicin-Induced+Senescence/Polyploidy+of+Breast+Cancer+Cells.">Improved Autophagic Flux in Escapers from Doxorubicin-Induced Senescence/Polyploidy of Breast Cancer Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6084 (2020).</li><li>Knott, G. W., Holtmaat, A., Trachtenberg, J. T., Svoboda, K., Welker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+preparing+GFP-labeled+neurons+previously+imaged+in+vivo+and+in+slice+preparations+for+light+and+electron+microscopic+analysis.">A protocol for preparing GFP-labeled neurons previously imaged in vivo and in slice preparations for light and electron microscopic analysis.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1145-1156 (2009).</li><li>Glauert, A. M., Lewis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological specimen preparation for transmission electron microscopy. , (2014).</li><li>Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Synapse+Formation+in+the+Adult+Somatosensory+Cortex+of+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Heterozygote+Mice.">Altered Synapse Formation in the Adult Somatosensory Cortex of Brain-Derived Neurotrophic Factor Heterozygote Mice.</a> Journal of Neuroscience. 24 (10), 2394-2400 (2004).</li></ol>

Hay muchas variaciones del método NCMIR primario descrito por Deerinck en 201010. Los principios básicos siguen siendo los mismos pero, dependiendo del tipo de material estudiado, se implementan ligeros cambios. Anteriormente se describió que se pueden utilizar diferentes resinas para incrustar especímenes para SBEM y por ejemplo en el caso de las plantas, Spurr's es la resina de elección debido a su baja viscosidad que permite una mejor infiltración a través de las paredes celulares<sup cl...

La mayoría de las sinapsis excitatorias en el sistema nervioso central se encuentran en las espinas dendríticas, pequeñas protuberancias de una membrana neuronal. Estas protuberancias forman compartimentos bioquímicos confinados que controlan la transducción de señales intracelulares. La plasticidad estructural de las espinas dendríticas y las sinapsis está estrechamente relacionada con los cambios funcionales en la eficacia sináptica que subyacen a procesos tan importantes como el aprendizaje y la memoria1,2. Es importante tener en cuenta que la microscopía electrónica (EM) es la única técnica que permite determinar si una columna dendrítica tiene una entrada presináptica. La resolución EM también es necesaria para estudiar detalles ultraestructurales como la forma de una densidad postsináptica (PSD), que representa una parte postsináptica de una sinapsis, o las dimensiones de una columna dendrítica, así como el tamaño y la forma de un bouton axonal. Además, con EM es posible visualizar las sinapsis y su entorno.
Gracias a los avances en las tecnologías de imagen y computación es posible reconstruir circuitos neuronales completos. Las técnicas de microscopía electrónica de volumen, como la microscopía electrónica de transmisión de sección serie (ssTEM), la microscopía electrónica de barrido de cara de bloque serie (SBEM) y la microscopía electrónica de barrido de haz de iones enfocado (FIB-SEM) se utilizan comúnmente para reconstrucciones de circuitos neuronales3.
En nuestros estudios, el método SBEM se emplea con éxito para investigar la plasticidad estructural de las espinas dendríticas y las PSD en muestras del hipocampo del ratón y cortes cerebrales organotípicos 4,5. El SBEM se basa en la instalación de un ultramicrotomo en miniatura dentro de la cámara del microscopio electrónico de barrido6,7,8,9. Se toma una imagen de la parte superior del bloque de muestra, y luego el ultramicrotomo corta la muestra a una profundidad especificada, revelando una nueva cara de bloque, que se vuelve a obtener una imagen y luego se repite el proceso8. Como resultado, solo queda la imagen de una cara de bloque, mientras que la rebanada que se ha cortado se pierde como escombros. Es por eso que SBEM se llama una técnica destructiva, lo que significa que no es posible obtener imágenes del mismo lugar nuevamente. Sin embargo, la ventaja de los métodos destructivos en bloque es que no sufren problemas de deformación y pérdida de sección que pueden afectar significativamente la calidad de los datos y el análisis de datos3. Además, SBEM ofrece la posibilidad de obtener imágenes de un campo de visión relativamente grande (> 0,5 mm × 0,5 mm) a alta resolución3.
Para emplear SBEM, las muestras deben prepararse de acuerdo con un protocolo dedicado y altamente contrastante debido al detector de electrones retrodibuerados utilizado para adquirir imágenes. Mostramos aquí cómo realizar la preparación de muestras de acuerdo con el protocolo basado en un procedimiento desarrollado por Deerinck10 (método del Centro Nacional de Microscopía e Investigación de Imágenes (NCMIR)), utilizando tinciones reducidas de osmio-tiocarbohidrazida-osmio (rOTO) desarrolladas en la década de 19808,11. Además, introducimos un enfoque de fijación en dos pasos, con perfusión de fijación leve que permite utilizar el mismo cerebro tanto para estudios de inmunofluorescencia con microscopía de luz como para SBEM.
En el protocolo, un cerebro de ratón se fija principalmente con un fijador suave, y luego se corta en mitades, y un hemisferio se posfija y se prepara para la inmunofluorescencia (IF), mientras que el otro para los estudios EM(Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62712/62712fig01.jpg"> Figura 1. Representación esquemática del flujo de trabajo para la preparación de espinas dendríticas para el análisis con SBEM. Los ratones fueron sacrificados y perfundidos con un fijador primario suave. El cerebro se cortó en mitades, y un hemisferio se colocó con fijador dedicado a la inmunofluorescencia (IF), crioprotegido, se cortó en rodajas con un criostato y se procesó para estudios de FI, mientras que el otro hemisferio se posfijó con fijador EM, se cortó con el vibrátomo y se preparó para los estudios em. Las rebanadas cerebrales para los estudios de SBEM se contrastaron, se incrustaron de forma plana en resina, luego se montó una región CA1 del hipocampo en el pasador y se tomaron imágenes con SBEM(Figura 1). La parte del protocolo resaltada en un cuadro amarillo se presentó en el video. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62712/62712fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthetic:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine/xylazine mixture (Ketamina/Sedazin)</td>
			<td>Biowet Pulawy, Pulawy, Poland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital (Morbital)</td>
			<td>Biowet Pulawy, Pulawy, Poland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixatives:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (GA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>G5882</td>
			<td>Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>POCH, Gliwice, Poland</td>
			<td>575283115</td>
			<td>pure p.a.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>441244</td>
			<td>prilled, 95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td>tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>S5881</td>
			<td>reagent grade, <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png" />98%, pellets (anhydrous)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large blunt/blunt curved scissors (~14.5 cm)</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>14519-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-spatula (double 2&#34; flat ends, one rounded, one tapered to 1/8&#34;)</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>10091-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle tip, 15 GA, blunt (perfusion needle)</td>
			<td>KD Medical GmbH Hospital Products, Berlin, Germany</td>
			<td>KD-FINE 900413</td>
			<td>1.80 x 40 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pair of fine (Graefe) tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>11050-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Lead Fluid</td>
			<td>BQ80S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic vials</td>
			<td>Profilab, Warsaw, Poland</td>
			<td>534.02</td>
			<td>plastic vials with blue cap for tissue storage, 20 ml, 31 x 48 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight iris scissors (~9 cm)</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain slices preparation for EM:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>NEST, Rahway, NJ, USA</td>
			<td>712001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylic glue</td>
			<td>Fenedur, Montevideo, Uruguay</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>72632</td>
			<td>20 ml Scintillation Vial, a pack of 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>612-4545</td>
			<td>LDPE, disposable, 7.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Wilkinson Sword, London, UK</td>
			<td></td>
			<td>Classic double edge safety razor blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Swann-Morton, Sheffield, UK</td>
			<td>No. 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>Leica VT1000 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain slices preparation for IF:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>NEST, Rahway, NJ, USA</td>
			<td>701101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criostat</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>Leica CM 1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol</td>
			<td>Bioshop, Burlington, Canada</td>
			<td>ETH001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-profile disposable blade 819</td>
			<td>Leica Biosystems Inc., USA</td>
			<td>14035838925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Swann-Morton, Sheffield, UK</td>
			<td>No. 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide (NaN3)</td>
			<td>POCH, Gliwice, Poland</td>
			<td>792770426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>POCH, Gliwice, Poland</td>
			<td>772090110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue freezing medium for cryosectioning, OCT-Compound</td>
			<td>Leica Biosystems, Switzerland</td>
			<td>14020108926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostaining:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>NEST, Rahway, NJ, USA</td>
			<td>702001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Post Synaptic Density Protein 95 Antibody</td>
			<td>Merck-Millipore, Burlington, MA, USA</td>
			<td>MAB1598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Zeiss Spinning Disc microscope (63 &#215; oil objective, NA 1.4, pixel size 0.13 &#181;m &#215; 0.13 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slide</td>
			<td>Menzel Glaser, Braunschweig, Germany</td>
			<td>B-1231</td>
			<td>24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>A31570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>AGAA00008</td>
			<td>SuperFrost</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>JWElectronic, Warsaw, Poland</td>
			<td>KL-942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonT X-100 Reagent Grade</td>
			<td>Bioshop, Burlington, Canada</td>
			<td>TRX506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron microsocpy sample preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate</td>
			<td>POCH, Gliwice, Poland</td>
			<td>746980113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aclar 33C Film</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>50425</td>
			<td>Fluoropolymer Film embedding sheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP-30, 2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>T58203</td>
			<td>Epoxy embedding medium accelerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM single component A, M</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>44611</td>
			<td>Durcupan ACM single component A, M epoxy resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM single component B</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>44612</td>
			<td>Durcupan ACM single component B, hardener 964</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM single component D</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>44614</td>
			<td>Durcupan ACM single component D , plasticizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol absolute</td>
			<td>POCH, Gliwice, Poland</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td>Ethyl alcohol absolute 99.8 % pure P.A.-BASIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genlab laboratory oven</td>
			<td>Wolflabs, York, UK</td>
			<td>Mino/18/SS</td>
			<td>Oven Genlab MINO/18/SS 18l volume, no fan circulation, no digital display, standard temperature gradient, standard recovery rate, no timer, 250&#176;C maximum temperature, 240V electrical supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>A-9256</td>
			<td>reagent grade, <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png" />98% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead (II) nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>467790</td>
			<td><img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png" />99.95% trace metals basis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>75632</td>
			<td>for electron microscopy, 4% in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Elmetron, Zabrze, Poland</td>
			<td>CP-5-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>BioSan, J&#243;zef&#243;w, Poland</td>
			<td>Multi Bio RS-24</td>
			<td>rotator Multi Bio RS-24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>S5881</td>
			<td>reagent grade, <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png" />98%, pellets (anhydrous)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunflower mini shaker</td>
			<td>Grant bio, Shepreth,UK</td>
			<td>PD-3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Millipore, Burlington, MA, USA</td>
			<td>SLGP033NB</td>
			<td>0,22 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>88535</td>
			<td>purum p.a., for electron microscopy, <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png" />99.0% (N)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Serva, Heidelberg, Germany</td>
			<td>77870</td>
			<td>Uranyl acetate&#183;2H2O, research grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>WSL, Swietochlowice, Poland</td>
			<td>LWT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen mounting for SBEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>734-2782</td>
			<td>96-well plates, round bottom, non treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AM Gatan 3View stub handling tweezers</td>
			<td>Micro to Nano, Haarlem, Netherlands 
			Netherlands</td>
			<td>50-001521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular</td>
			<td>OPTA-TECH, Warsaw, Poland</td>
			<td>X2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive glue</td>
			<td>Chemtronics, Georgia, USA</td>
			<td>CW2400</td>
			<td>conductive eopxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gatan 3View sample pin stubs</td>
			<td>Micro to Nano, Haarlem, Netherlands 
			Netherlands</td>
			<td>10-006003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>P7793</td>
			<td>roll size 20&#160;in. &#215; 50&#160;ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco conductive silver paint</td>
			<td>Ted Pella, Redding, CA, USA</td>
			<td>16062-15</td>
			<td>PELCO&#174;&#160;Conductive Silver Paint, 15g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades double edge</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>72000</td>
			<td>Stainless Steel &#34;PTFE&#34; coated. PERSONNA brand .004&#34; thick, wrapped individually, 250 blades in a box.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Sigma VP with Gatan 3View2 chamber, acceleration voltage 2.5 kV, variable pressure 5 Pa, aperture 20 &#181;m, dwell time 6 &#181;s, slice thickness 60 nm, magnification 15 000 x, image resolution 2048 x 2048 pixels, pixel size 7.3 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trim 90&#176; diamond knife</td>
			<td>Diatome Ltd., Nidau, Switzerland</td>
			<td>DTB90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>Leica ultracutR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td>webpage</td>
			<td></td>
			<td>tutorials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FijiJ</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Image Browser</td>
			<td>http://mib.helsinki.fi/</td>
			<td></td>
			<td>http://mib.helsinki.fi/tutorials.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reconstruct</td>
			<td>https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0</td>
			<td></td>
			<td>https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Adult 3-month old and&#160;20&#177;1&#160;month old&#160;female&#160;Thy1-GFP(M) mice (Thy1-GFP +/-) (Feng et al.,2000) which express GFP in a sparsely distributed population of glutamatergic neurons. Animals were bred as heterozygotes with the C57BL/6J background in the Animal House of the Nencki Institute of Experimental Biology.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

serial block-face scanning electron microscopy (sbem) for the study of dendritic spines

La microscopía electrónica tridimensional (3D EM) da la posibilidad de analizar parámetros morfológicos de espinas dendríticas con resolución a nanoescala. Además, algunas características de las espinas dendríticas, como el volumen de la columna vertebral y la densidad postsináptica (PSD) (que representa la parte postsináptica de la sinapsis), la presencia de terminal presináptico y el retículo endoplásmico liso o la forma atípica de PSD (por ejemplo, espinas multiinervadas), se pueden observar solo con EM 3D. Mediante el empleo de la microscopía electrónica de barrido de cara de bloque serie (SBEM) es posible obtener datos EM 3D más fácilmente y de una manera más reproducible que cuando se realiza la sección en serie tradicional. Aquí mostramos cómo preparar muestras de hipocampo de ratón para el análisis de SBEM y cómo este protocolo se puede combinar con el estudio de inmunofluorescencia de espinas dendríticas. La perfusión de fijación leve nos permite realizar estudios de inmunofluorescencia con microscopía de luz en una mitad del cerebro, mientras que la otra mitad fue preparada para SBEM. Este enfoque reduce el número de animales que se utilizarán para el estudio.

Utilizando el método descrito anteriormente de alto contraste, se pueden obtener imágenes de buena resolución del tejido cerebral del ratón. Un gran campo de visión proporcionado por la técnica SBEM facilita la selección precisa de la región de interés. La imagen grande de la región CA1 del hipocampo se tomó para medir la longitud del estrato radiatum (SR)(Figura 2A)y para establecer la imagen con precisión en el centro(Figura 2B). A continu...

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Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines

La microscopía electrónica de barrido serial de cara de bloque (SBEM) se aplica para obtener imágenes y analizar espinas dendríticas en el hipocampo murino.

Microscopía electrónica de barrido serial de cara de bloque (SBEM) para el estudio de espinas dendríticas

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...

Cada neurona en el cerebro está conectada con otras células neuronales por aproximadamente 7.000 sinapsis. Excepto que esas sinapsis en el cerebro de los mamíferos se encuentran principalmente en las pequeñas protuberancias de la membrana llamadas espinas dendríticas. Plasticidad de las sinapsis y espinas dendríticas y similares, funciones cerebrales tan importantes como el aprendizaje y los procesos de memoria.Es importante tener en cuenta que solo la microscopía electrónica da una idea completa de si una columna dendrítica tiene una entrada postsináptica. Hay disponibles varias técnicas de imágenes de espinas dendríticas. Sin embargo, la microscopía electrónica de barrido de cara de bloque serie ofrece una posibilidad única de obtener imágenes de un gran volumen de tejido con una alta resolución.La técnica de microscopía electrónica de barrido basada en bloques en serie requiere un protocolo especial de preparación de muestras que implica un fuerte contraste con metales pesados. Mi fijación primaria durante la perfusión nos permitió usar los mismos cerebros para la microscopía electrónica aligerada. Los ratones fueron sacrificados y perfundidos con un fijador primario suave.El cerebro se cortó en mitades y un hemisferio se fijó con un fijador dedicado a la inmunofluorescencia, crioprotector, se cortó en rodajas con un criostato y se procesó para estudios de inmunofluorescencia. Donde el otro hemisferio fue fijado con fijador de microscopía electrónica, cortado con el vibrátomo y preparado para estudios de microscopía electrónica. Las rebanadas cerebrales para los estudios de microscopía electrónica de barrido basada en bloques en serie se contrastaron, se incrustaron de forma plana en resina, luego se montó una región CA1 del hipocampo en el pasador y se tomaron imágenes con el microscopio electrónico de barrido basado en bloques en serie.La parte del protocolo resaltada en un cuadro amarillo se presentó en el video. Tome el tejido, que ha sido fijado y cortado en 100 rodajas microbióticas y lávelo con tampón de fosfato frío cinco veces durante tres minutos cada una. Prepare una mezcla uno a uno de tetróxido de osmio al 4% y ferrocianuro de potasio al 3%.El producto final se volverá marrón. Sumergir las muestras en esta mezcla. Luego coloque las muestras en hielo.Y a partir de esta etapa es importante protegerlos de la luz. Incubarlos con un suave agitación durante una hora. Mientras tanto, prepare la solución TCH.Mezclar 10 mililitros de agua destilada doble y 0,1 gramos de TCH. Colóquelo en un horno a 60 grados centígrados durante una hora. Es importante dar la solución de vez en cuando.Cuando esté listo, enfríelo a temperatura ambiente. Ahora lave las muestras con agua destilada doble cinco veces durante tres minutos cada una y luego sumérjalas en una solución TCH filtrada. Las rodajas se volverán negras.Incubarlos durante 20 minutos a temperatura ambiente. Lave las muestras con agua destilada doble cinco veces durante tres minutos cada una e incube con tetróxido de osmio al 2% durante 30 minutos, esta vez a temperatura ambiente. Nuevamente, lave las muestras con agua destilada doble cinco veces durante tres minutos cada una y colóquelas en acetato de amilo filtrado al 1%.Incubarlos a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, comience con la preparación de D-aspartato. Mezcle el nitrato de plomo con la solución de ácido aspártico precalentada a 60 grados centígrados.Coloque la mezcla en un baño de agua a 60 grados centígrados y ajuste el pH a 5.5 con un hidróxido de sodio molar. Cierre el vial con aspartato de plomo y déjelo en 60 grados centígrados durante 30 minutos. La solución debe ser clara.Si se vuelve turbio, debe descartarse y se debe preparar uno nuevo. Mientras tanto, lave las muestras con el gas doble agua destilada cinco veces durante tres minutos cada una y manténgalas en el horno a 60 grados centígrados durante 30 minutos. Sumergir las muestras en la solución de aspartato de plomo recién preparada e incubarlas en el horno a 60 grados centígrados durante 20 minutos.Preparar resina epoxi. Pesar los ingredientes y mezclar bien la resina durante al menos 30 minutos antes de añadir el acelerador DMP 30. Preparar el virus con dilución graduada de etanol.Luego saque las muestras del horno y lávelas nuevamente con agua destilada doble cinco veces durante tres minutos cada una. Mientras tanto, mezcle la resina con 100% de etanol en proporción uno a uno para obtener la resina del 50%. Mézclalo bien.Después de esto, deshidrate las muestras en cada dilución de etanol durante cinco minutos. Recuerde que las muestras nunca deben secarse por completo. Infiltrar las muestras primero en 50% de resina durante 30 minutos, luego en 100% de resina durante una hora, y luego nuevamente en una resina fresca de 100% durante la noche.Al día siguiente, coloque las muestras en resina fresca 100% durante una hora y luego insértelas entre las láminas de incrustación de fluoropolímeros. Prepare trozos de lámina de incrustación que hayan sido desgrasados con etanol y deje a un lado los portaobjetos de vidrio que se utilizarán como soporte. Coloque un trozo de lámina incrustante en un portaobjetos de vidrio, coloque una gota de resina sobre él, luego transfiera la muestra con cuidado con el uso de un palo de madera.Cúbrelo con la segunda pieza. Trate de evitar las burbujas de aire. Sea suave ya que el tejido es muy frágil.Coloque con cuidado otro portaobjetos de vidrio encima de la pieza de la hoja de incrustación y cure la muestra en el horno a 70 grados centígrados durante al menos 48 horas. Separe las capas y corte un trozo de la muestra incrustada con una cuchilla de afeitar. Transfiéralo a la parafina.Esto minimizará el peligro de perder la muestra debido a la electrostática. Tome un pasador de aluminio que haya sido desengrasado con etanol. Mezcle bien un epoxi conductor y use una pequeña cantidad de él para montar la muestra en el pasador.Cure el epoxi conductor a 70 grados centígrados durante 10 minutos. Recorte cada lado del bloque de muestra con el cuchillo de diamante y luego pula la cara del bloque hasta que el tejido quede expuesto. Moele la muestra al pasador con pintura conductora y cújela.Para minimizar la carga, las muestras también deben ser manchadas recubiertas con una fina capa de oro o paladio de oro. Coloque el pasador con la muestra en la cámara del microscopio electrónico de barrido basado en bloques en serie. Alinee la muestra con el cuchillo y luego cierre la cámara y establezca los parámetros.Recopila una pila de imágenes. Utilizando el método descrito, se obtuvieron imágenes de tejido cerebral de ratón. Se tomó la imagen grande del hipocampo en una región y la imagen se colocó en el centro del estrato radiatum.Se adquirió una pila de imágenes y se segmentaron los objetos de interés, como las espinas dendríticas y las sinapsis. Se obtuvo una morfología tisular de buena calidad con membranas y vesículas sinápticas claramente visibles y mitocondrias bien conservadas. Los estudios inmunofluorescentes de anticuerpos PSD 95 confirmaron que la fijación primaria leve y la fijación tradicional con 4% pfa dan resultados comparables.El protocolo presentado permite la adquisición de imágenes de tejido cerebral con el uso de microscopía electrónica de barrido basada en bloques en serie, morfología tisular de alta calidad y 12 membranas visibles que facilitan la segmentación y reconstrucción correctas de 10. Mi fijación primaria hizo posible utilizar los mismos cerebros para el análisis de la inmunofluorescencia PSD 95 y la microscopía electrónica de imágenes de las espinas dendríticas. Aquí usamos PSE 9, 500 en ciernes.Sin embargo, el otro también se puede usar.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

La recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) de fluorescencia de proteínas marcadas en las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo cultivadas

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Investigación

Neurociencias

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

Haz de iones enfocado fresado y microscopía electrónica de barrido en el tejido cerebral

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Sensibles al voltaje Dye grabación de axones, dendritas y espinas dendríticas de las neuronas individuales en rodajas de cerebro

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

La manipulación genética de las neuronas cerebelosa gránulo<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em&gt; Estudiar Neuronal Morfología y Migración

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imaging las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo de rata primaria utilizando Estructurado Iluminación Microscopía

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

De dos fotones<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de las espinas dendríticas en la corteza del ratón Usando un Diluido-cráneo Preparación

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

El sistema olfativo como un modelo para estudiar los patrones de crecimiento axonal y Morfología<em&gt; En Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Análisis del Cerebro Las mitocondrias Usando serie Bloque-Cara Microscopía Electrónica de Barrido

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Purificación de la fracción defípoda dendrítica

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

3D Modeling of Dendritic Spines with Synaptic Plasticity

Modelado 3D de espinas dendríticas con plasticidad sináptica

Computational modeling of diffusion and reaction of chemical species in a three-dimensional (3D) geometry is a fundamental method to understand the ...