Name: hyperactive piggybac transposase-mediated germline transformation in the fall armyworm, spodoptera frugiperda
Uploaded: 2021-09-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda at JoVE.com

Den rapporterede forskning er støttet af National Science Foundation I / UCRC, Center for Arthropod Management Technologies, under Grant No IIP-1821936 og af industripartnere, Landbrug og Fødevareforskningsinitiativ Competitive Grant No. 2019-67013-29351 og National Institute of Food and Agriculture, US Department of Agriculture (2019-67013-29351 og 2353057000).

1. In vitro syntese af hyPBase mRNA
BEMÆRK: Den komplette kodningssekvens af hyPBase-sekvensen blev syntetiseret og indsat i en pTD1-Cas9-vektor (se materialetabellen) for at producere pTD1-hyPBase-konstruktionen, som indeholder en hyPBase-udtrykkende kassette, T7 promotor: polyhedrin-5' UTR: hyPBase: polyhedrin-3'UTR: poly (A). Den fulde sekvens af pTD1-hyPBase-konstruktionen findes i det supplerende materiale.
<ol><li>Udarbejdelse af skabelonen t...

<ol>
	<li>Gui, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+transcriptomic+analysis+unveils+population+evolution+and+development+of+pesticide+resistance+in+fall+armyworm+Spodoptera+frugiperda.">Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda.</a> Protein Cell. , (2020).</li><li>Montezano, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+plants+of+Spodoptera+frugiperda+(Lepidoptera:+Noctuidae)+in+the+Americas.">Host plants of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in the Americas.</a> African Entomology. 26 (2), 286-300 (2018).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+ecdysone+oxidase+impairs+tissue+degeneration+in+Bombyx+mori.">Ectopic expression of ecdysone oxidase impairs tissue degeneration in Bombyx mori.</a> Proceedings, Biological Sciences. 282 (1809), 20150513 (2015).</li><li>Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+sexing+system+for+Ceratitis+capitata+(Diptera:+Tephritidae)+based+on+female-specific+embryonic+lethality.">Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (1), 1-8 (2013).</li><li>Gregory, M., Alphey, L., Morrison, N. I., Shimeld, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+transformation+with+piggyBac:+getting+the+number+of+injections+just+right.">Insect transformation with piggyBac: getting the number of injections just right.</a> Insect Molecular Biology. 25 (3), 259-271 (2016).</li><li>Otte, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+genetic+transformation+rates+in+honeybees.">Improving genetic transformation rates in honeybees.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16534 (2018).</li><li>Eckermann, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactive+piggyBac+transposase+improves+transformation+efficiency+in+diverse+insect+species.">Hyperactive piggyBac transposase improves transformation efficiency in diverse insect species.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 98, 16-24 (2018).</li><li>Chen, X., Koo, J., Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+systemic+RNA+interference+defective+protein+1+enhances+RNAi+efficiency+in+a+lepidopteran+insect,+the+fall+armyworm,+in+a+tissue-specific+manner.">Caenorhabditis elegans systemic RNA interference defective protein 1 enhances RNAi efficiency in a lepidopteran insect, the fall armyworm, in a tissue-specific manner.</a> RNA Biology. , 1-9 (2020).</li><li>Liu, Y. G., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+thermal+asymmetric+interlaced+PCR+for+amplification+of+unknown+flanking+sequences.">High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences.</a> Biotechniques. 43 (5), 649-650 (2007).</li><li>Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hyperactive+piggyBac+transposase+for+mammalian+applications.">A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).</li><li>Xu, H., O'Brochta, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+technologies+for+genetically+manipulating+the+silkworm+Bombyx+mori,+a+model+Lepidopteran+insect.">Advanced technologies for genetically manipulating the silkworm Bombyx mori, a model Lepidopteran insect.</a> Proceedings, Biological Sciences. 282 (1810), 20150487 (2015).</li><li>Wu, S. C. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+is+a+flexible+and+highly+active+transposon+as+compared+to+sleeping+beauty,+Tol2,+and+Mos1+in+mammalian+cells.">piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103 (41), 15008-15013 (2006).</li><li>Tamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transformation+of+the+silkworm+Bombyx+mori+L.+using+a+piggyBac+transposon-derived+vector.">Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector.</a> Nature Biotechnology. 18 (1), 81-84 (2000).</li><li>Handler, A. M., Harrell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transformation+of+Drosophila+melanogaster+with+the+piggyBac+transposon+vector.">Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector.</a> Insect Molecular Biology. 8 (4), 449-457 (1999).</li><li>Dreyfus, M., R&#233;gnier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+poly+(A)+tail+of+mRNAs:+bodyguard+in+eukaryotes,+scavenger+in+bacteria.">The poly (A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria.</a> Cell. 111 (5), 611-613 (2002).</li></ol>

Den lave gennemførelsesgrad og vanskeligheden ved at levere transgene komponenter til friske embryoner begrænser succesen af bakterielintransformation i mange ikke-modelinsekter, især dem fra orden, Lepidoptera. For at øge bakterielinjen transformation sats, en hyperaktiv version af de mest udbredte piggyBac transposase (hyPBase) blev udviklet7,10. Til dato er vellykket kimlinjetransformation i lepidopteran insekter hovedsageligt rapporteret i modell...

Faldet armyworm (FAW), Spodoptera frugiperda, er hjemmehørende i tropiske og subtropiske regioner i Amerika. I øjeblikket er dette en ødelæggende insekt planteæder i mere end 100 lande verden over1. FAW larver foder på mere end 350 værtsplanter, herunder nogle vigtige korte fødevarer afgrøder2. FAW-voksnes stærke migrationsevne bidrager til dens nylige hurtige spredning fra Amerika til andre steder1,2. Som følge heraf truer dette insekt nu fødevaresikkerheden internationalt. Anvendelse af nye teknologier kan lette avancerede undersøgelser i FAW og give nye strategier til at styre dette skadedyr.
Transformation af insektkimlinjen er blevet brugt til at studere genfunktion og generere transgene insekter til brug i genetisk kontrol3,4. Blandt de forskellige metoder, der anvendes til at opnå genetisk transformation i insekter, er piggyBac-elementbaseret metode den mest anvendte metode5. På grund af den lave gennemførelsesrate er det dog stadig udfordrende at udføre transgenese hos ikke-modelinsekter. For nylig blev en hyperaktiv version af piggyBac transposase (hyPBase) udviklet6,7. Germline transformation blev opnået i FAW for nylig8, hvilket er den første rapport, der brugte hyPBase i lepidopteran insekter. I denne rapport beskrives detaljerede oplysninger om anvendelse af hyPBase mRNA til generering af transgen FAW. Den metode, der er beskrevet her, kunne anvendes til at opnå omdannelsen af andre lepidopteran insekter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5&#34; Dental Cotton Rolls</td>
			<td>PlastCare USA</td>
			<td>8542025591</td>
			<td>REARING</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 oz Souffle Cup Lids</td>
			<td>DART</td>
			<td>PL1N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 oz Souffle Cups</td>
			<td>DART</td>
			<td>P100N</td>
			<td>REARING</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 oz Plastic Deli Containers</td>
			<td>Genpack</td>
			<td>AD48</td>
			<td>REARING</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Add-on Filter Set (Green)</td>
			<td>NightSea LLC</td>
			<td>SFA-BLFS-GR</td>
			<td>SCREENING</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF100-50-10</td>
			<td>INJECTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass</td>
			<td>SUTTER INSTRUMENT</td>
			<td>BF-100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745T</td>
			<td>SCREENING</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Featherweight Forceps</td>
			<td>BioQuip</td>
			<td>4750</td>
			<td>REARING</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gutter Guard</td>
			<td>ThermWell Products</td>
			<td>VX620</td>
			<td>REARING</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td>INJECTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-300</td>
			<td>INJECTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>INJECTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-22</td>
			<td>INJECTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NightSea Full System</td>
			<td>NightSea LLC</td>
			<td>SFA-RB-DIM</td>
			<td>SCREENING</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen Gas</td>
			<td>AWG/Scott-Gross</td>
			<td>NI 225</td>
			<td>INJECTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper Towels</td>
			<td>Bounty</td>
			<td>&#160;43217-45074</td>
			<td>REARING</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spodoptera frugiperda Artificial Diet</td>
			<td>Southland Products, Inc</td>
			<td>N/A [Request Species/Quantity]</td>
			<td>REARING</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spodoptera frugiperda Eggs</td>
			<td>Benzon Research, Inc</td>
			<td>N/A [Request Species/Quantity]</td>
			<td>REARING</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq MasterMix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>polymerase mixture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hyperactive piggybac transposase-mediated germline transformation in the fall armyworm, spodoptera frugiperda

Stabil indsættelse af genetisk last i insektgenomer ved hjælp af transposable elementer er et kraftfuldt værktøj til funktionelle genomiske undersøgelser og udvikling af genetiske skadedyrsbekæmpelsesstrategier. Det mest anvendte transposable element i insekttransformation er piggyBac, og piggyBac-baseretkimlinjetransformation er blevet udført med succes i modelinsekter. Det er dog stadig udfordrende at anvende denne teknologi i ikke-modelinsekter, der omfatter skadedyr i landbruget. Dette papir rapporter om kimlinje transformation af en global landbrugs skadedyr, faldet armyworm (FAW), Spodoptera frugiperda, ved hjælp af hyperaktiv piggyBac transposase (hyPBase).
I dette arbejde blev hyPBase mRNA produceret og brugt i stedet for hjælper plasmid i embryo mikroinjections. Denne ændring førte til en vellykket generation af transgene FAW. Desuden beskrives metoderne til screening af transgene dyr, PCR-baseret hurtig påvisning af transgeneindføring og termisk asymmetrisk interlaced PCR (TAIL-PCR)-baseret bestemmelse af integrationsstedet. Således præsenterer dette papir en protokol til fremstilling af transgene FAW, som vil lette piggyBac-baserettransgenese i FAW og andre lepidopteran insekter.

En konstruktion til udtryk for hyPBase-holdige T7 promotor: polyhedrin-5'UTR: hyPBase: polyhedrin-3'UTR: poly (A) signal blev genereret (Figur 1A) og forstærket som en ~ 2,2 kb PCR fragment til at syntetisere hyPBase mRNA in vitro (Figur 1B). Derefter blev hyPBase mRNA produceret og udsat for agarosegelelektroforese. mRNA'et af den forventede størrelse (~1,1 kb bånd) blev fundet på en 1 % agarosegel (Figur 1C).
<p c...

Watch this Scientific Journal Video about Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda at JoVE.com

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Vellykket kimlinje transformation i efteråret armyworm, Spodoptera frugiperda, blev opnået ved hjælp af mRNA af hyperaktiv piggyBac transposase.

Hyperaktiv piggyBac Transposase-medieret Germline Transformation i Efteråret Armyworm, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic ...

Denne protokol viser produktion af transgen Fall Armyworm ved hjælp af piggyBac-baseret transformationssystem. Vi håber, at disse metoder vil gavne forbedringen af transformationen, ikke kun i Fall Armyworm, men også lepidopteran insekter. Den metode, der er beskrevet her, gør kimlintransformationen af lepidopteran skadedyrsinsekter effektiv.Dr.Xien Chen, en postdoc i mit laboratorium. Begynd med at placere 12 hanunge og 12 kvindelige pupper i en kasse. Placer en 10% saccharoseopløsning i kassen til fodring af voksne.Dæk kassen med et køkkenrulle. På dag to efter ekslosion, udsætte de voksne til intenst lys natten over. På dag tre efter ekslosionen overføres de voksne til et mørkt sted.Saml embryonerne inden for to timer efter over position. Tilsæt dråber vand til stykket af køkkenrullen med friske æg opbevaret i en petriskål på is. Overfør æggene forsigtigt til en glasrutschebane med en fin børste og juster dem en efter en på en glasrutschebane.Hold glasrutschebanerne med æggene justeret på is før mikroinjektion. Indsprøjt en blanding af de 200 nanogram pr. mikroliter piggyBac-baseret EGFP, der udtrykker plasmid, 200 nanogram pr. mikroliter hyperaktiv piggyBac-transposase mRNA, og sterilt destilleret vand i æggene ved hjælp af kompensationstrykket fra den automatiserede mikroinjektor. Hold de injicerede æg på 27 plus eller minus en grad Celsius, 60 plus eller minus 10% relativ luftfugtighed indtil udklækning.Foder de udklækkede larver på en kunstig kost, og overfør hver larve til en lille kop på den tidlige ostemasse og stjerne scene. Saml pupper og sted ca 150 kvindelige og 150 mandlige pupper i et bur. Hæng flere stykker papirhåndklæder 30 centimeter gange 15 centimeter i størrelse i buret for at samle æggene.Saml papirhåndklæder med æg dagligt, og hold æggene under passende forhold, indtil udklækning. Hold de nyfødte larver på fire grader Celsius i fem minutter for at immobilisere dem, og overfør dem derefter på en iskold plade. Screen de immobiliserede nyfødte larver under et fluorescens stereomikroskop.Vælg egfp-positive nyfødte, hæve dem til pupal fase, i omkring to uger på 27 plus eller minus en grad Celsius. Den hyperaktive piggyBac transposase mRNA syntetiseret in vitro blev opdaget ved hjælp af en 1%Agarose gel. De PDS-injicerede embryoner viste ikke EGFP-signal, mens egfp-udtrykke plasmid og hyperaktive piggyBac transposase mRNA-injicerede embryoner viste EGP fluorescens, hvilket indikerer, at piggyBac konstruktionen var vellykket.G1 larverne fra æg fra et selvkors af G0 voksne viste et stærkt EGFP-signal. Et fragment, der indeholdt promotoren og EGFP-fragmentet, blev forstærket med succes ved hjælp af det genomiske DNA isoleret fra de EGFP-positive larver som skabelon. Det samme fragment blev dog ikke opdaget, da genomisk DNA blev isoleret fra de vilde larver som skabelonen.Æggene til mikroinjektion skal være så friske som muligt og skal altid opbevares på is før mikroinjektion for at bremse deres udvikling. Denne teknik baner vejen for forskere til at besvare spørgsmål i skadedyr insekt funktionelle genomforskning og udvikle genetiske kontrolmetoder for denne globale skadedyr.

Research

JoVE Journal

Biology

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Brain Slice Stimulation Using a Microfluidic Network and Standard Perfusion Chamber

We have demonstrated the fabrication of a two-level microfluidic device that can be easily integrated with existing electrophysiology setups. The ...

Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

Efficient Polyethylene Glycol PEG Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella ...

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Genomisk Transformation af Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus Tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose

Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose

Identifikation af metabolisk aktive bakterier i tarmen af ​​generalist<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; Via DNA stabile isotoper Probing Brug<sup&gt; 13</sup&gt; C-glucose

Guts of most insects are inhabited by complex communities of symbiotic nonpathogenic bacteria. Within such microbial communities it is possible to ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Forberedelse og injektion af embryoner af Culex-myg til generering af Null-mutationer ved hjælp af CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Microsurgical Obstruction of Testes Fusion in Spodoptera litura

Microsurgical Obstruction of Testes Fusion in Spodoptera litura

Mikrokirurgisk obstruktion af testiklerne fusion i Spodoptera litura

Instead of using genetic methods like RNA interference (RNAi) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated ...

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Naturlig transformation, proteinekspression og kryokonservering af den filamentøse cyanobakterie Phormidium lacuna

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is ...

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Embryoinjektionsteknik til genredigering i den sortbenede flåt, Ixodes scapularis

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

Superopløsningsmikroskopi af det synaptonemale kompleks inden for Caenorhabditis elegans Germline

During meiosis, homologous chromosomes must recognize and adhere to one another to allow for their correct segregation. One of the key events that secures ...