Name: hyperactive piggybac transposase-mediated germline transformation in the fall armyworm, spodoptera frugiperda
Uploaded: 2021-09-23T14:00:00
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A pesquisa relatada é apoiada pela National Science Foundation I/UCRC, o Center for Arthropod Management Technologies, sob o Grant No IIP-1821936 e por parceiros da indústria, Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant No. 2019-67013-29351 e o National Institute of Food and Agriculture, Departamento de Agricultura dos EUA (2019-67013-29351 e 2353057000).

1. Síntese in vitro de hipPBase mRNA
NOTA: A sequência completa de codificação da sequência hyPBase foi sintetizada e inserida em um vetor pTD1-Cas9 (ver a Tabela de Materiais) para produzir a construção pTD1-hyPBase, que contém um expresso em hyPBase, promotor T7: polyhedrin-5' UTR: hyPBase: polyhedrin-3' UTR: poly (A). A sequência completa da construção pTD1-hyPBase está prevista no Material Suplementar.
<ol><li>Preparação do modelo ...

<ol>
	<li>Gui, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+transcriptomic+analysis+unveils+population+evolution+and+development+of+pesticide+resistance+in+fall+armyworm+Spodoptera+frugiperda.">Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda.</a> Protein Cell. , (2020).</li><li>Montezano, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+plants+of+Spodoptera+frugiperda+(Lepidoptera:+Noctuidae)+in+the+Americas.">Host plants of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in the Americas.</a> African Entomology. 26 (2), 286-300 (2018).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+ecdysone+oxidase+impairs+tissue+degeneration+in+Bombyx+mori.">Ectopic expression of ecdysone oxidase impairs tissue degeneration in Bombyx mori.</a> Proceedings, Biological Sciences. 282 (1809), 20150513 (2015).</li><li>Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+sexing+system+for+Ceratitis+capitata+(Diptera:+Tephritidae)+based+on+female-specific+embryonic+lethality.">Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (1), 1-8 (2013).</li><li>Gregory, M., Alphey, L., Morrison, N. I., Shimeld, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+transformation+with+piggyBac:+getting+the+number+of+injections+just+right.">Insect transformation with piggyBac: getting the number of injections just right.</a> Insect Molecular Biology. 25 (3), 259-271 (2016).</li><li>Otte, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+genetic+transformation+rates+in+honeybees.">Improving genetic transformation rates in honeybees.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16534 (2018).</li><li>Eckermann, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactive+piggyBac+transposase+improves+transformation+efficiency+in+diverse+insect+species.">Hyperactive piggyBac transposase improves transformation efficiency in diverse insect species.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 98, 16-24 (2018).</li><li>Chen, X., Koo, J., Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+systemic+RNA+interference+defective+protein+1+enhances+RNAi+efficiency+in+a+lepidopteran+insect,+the+fall+armyworm,+in+a+tissue-specific+manner.">Caenorhabditis elegans systemic RNA interference defective protein 1 enhances RNAi efficiency in a lepidopteran insect, the fall armyworm, in a tissue-specific manner.</a> RNA Biology. , 1-9 (2020).</li><li>Liu, Y. G., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+thermal+asymmetric+interlaced+PCR+for+amplification+of+unknown+flanking+sequences.">High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences.</a> Biotechniques. 43 (5), 649-650 (2007).</li><li>Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hyperactive+piggyBac+transposase+for+mammalian+applications.">A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).</li><li>Xu, H., O'Brochta, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+technologies+for+genetically+manipulating+the+silkworm+Bombyx+mori,+a+model+Lepidopteran+insect.">Advanced technologies for genetically manipulating the silkworm Bombyx mori, a model Lepidopteran insect.</a> Proceedings, Biological Sciences. 282 (1810), 20150487 (2015).</li><li>Wu, S. C. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+is+a+flexible+and+highly+active+transposon+as+compared+to+sleeping+beauty,+Tol2,+and+Mos1+in+mammalian+cells.">piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103 (41), 15008-15013 (2006).</li><li>Tamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transformation+of+the+silkworm+Bombyx+mori+L.+using+a+piggyBac+transposon-derived+vector.">Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector.</a> Nature Biotechnology. 18 (1), 81-84 (2000).</li><li>Handler, A. M., Harrell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transformation+of+Drosophila+melanogaster+with+the+piggyBac+transposon+vector.">Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector.</a> Insect Molecular Biology. 8 (4), 449-457 (1999).</li><li>Dreyfus, M., R&#233;gnier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+poly+(A)+tail+of+mRNAs:+bodyguard+in+eukaryotes,+scavenger+in+bacteria.">The poly (A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria.</a> Cell. 111 (5), 611-613 (2002).</li></ol>

A baixa taxa de transposição e a dificuldade de entregar componentes transgênicos em embriões frescos limitam o sucesso da transformação germinal em muitos insetos não-modelo, especialmente aqueles da ordem, Lepidoptera. Para aumentar a taxa de transformação germinal, foi desenvolvida uma versão hiperativa da transposase de piggyBac mais utilizada (hyPBase)7,10. Até o momento, a transformação germinal bem sucedida em insetos lepidopteranos ?...

O verme do exército de outono (FAW), Spodoptera frugiperda,é nativo de regiões tropicais e subtropicais da América. Atualmente, este é um herbívoro de insetos devastador em mais de 100 países em todo o mundo1. As larvas faw se alimentam de mais de 350 plantas hospedeiras, incluindo algumas importantes culturas alimentaresbásicas 2. A forte capacidade migratória dos adultos da FAW contribui para sua recente rápida disseminação das Américas para outros lugares1,2. Como resultado, este inseto está ameaçando a segurança alimentar internacionalmente. A aplicação de novas tecnologias pode facilitar estudos avançados na FAW e fornecer novas estratégias para gerenciar essa praga.
A transformação da germinação de insetos tem sido usada para estudar a função genética e gerar insetos transgênicos para uso no controle genético3,4. Entre os vários métodos utilizados para alcançar a transformação genética em insetos, o método baseado em elementos piggyBac é o método mais utilizado5. No entanto, devido à baixa taxa de transposição, ainda é desafiador realizar transgênese em insetos não modelo. Recentemente, uma versão hiperativa de piggyBac transposase (hyPBase) foi desenvolvida6,7. A transformação germinal foi alcançada na FAW recentemente8, que é o primeiro relatório que utilizou o hyPBase em insetos lepidopteranos. Neste relatório, são descritas informações detalhadas sobre a contratação de mRNA hipPBase na geração de FAW transgênicos. O método aqui descrito poderia ser aplicado para alcançar a transformação de outros insetos lepidopteranos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5&#34; Dental Cotton Rolls</td>
			<td>PlastCare USA</td>
			<td>8542025591</td>
			<td>REARING</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 oz Souffle Cup Lids</td>
			<td>DART</td>
			<td>PL1N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 oz Souffle Cups</td>
			<td>DART</td>
			<td>P100N</td>
			<td>REARING</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 oz Plastic Deli Containers</td>
			<td>Genpack</td>
			<td>AD48</td>
			<td>REARING</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Add-on Filter Set (Green)</td>
			<td>NightSea LLC</td>
			<td>SFA-BLFS-GR</td>
			<td>SCREENING</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF100-50-10</td>
			<td>INJECTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass</td>
			<td>SUTTER INSTRUMENT</td>
			<td>BF-100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745T</td>
			<td>SCREENING</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Featherweight Forceps</td>
			<td>BioQuip</td>
			<td>4750</td>
			<td>REARING</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gutter Guard</td>
			<td>ThermWell Products</td>
			<td>VX620</td>
			<td>REARING</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td>INJECTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-300</td>
			<td>INJECTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>INJECTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-22</td>
			<td>INJECTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NightSea Full System</td>
			<td>NightSea LLC</td>
			<td>SFA-RB-DIM</td>
			<td>SCREENING</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen Gas</td>
			<td>AWG/Scott-Gross</td>
			<td>NI 225</td>
			<td>INJECTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper Towels</td>
			<td>Bounty</td>
			<td>&#160;43217-45074</td>
			<td>REARING</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spodoptera frugiperda Artificial Diet</td>
			<td>Southland Products, Inc</td>
			<td>N/A [Request Species/Quantity]</td>
			<td>REARING</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spodoptera frugiperda Eggs</td>
			<td>Benzon Research, Inc</td>
			<td>N/A [Request Species/Quantity]</td>
			<td>REARING</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq MasterMix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>polymerase mixture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hyperactive piggybac transposase-mediated germline transformation in the fall armyworm, spodoptera frugiperda

A inserção estável da carga genética em genomas de insetos usando elementos transposáveis é uma poderosa ferramenta para estudos genômicos funcionais e desenvolvimento de estratégias genéticas de manejo de pragas. O elemento transposável mais usado na transformação de insetos é o piggyBac, e a transformação germinal baseada em piggyBactem sido conduzida com sucesso em insetos modelo. No entanto, ainda é desafiador empregar essa tecnologia em insetos não-modelo que incluem pragas agrícolas. Este artigo relata a transformação germinal de uma praga agrícola global, a minhoca de outono (FAW), Spodoptera frugiperda,usando a transposase hiperativa piggyBac (hyPBase).
Neste trabalho, o mRNA hyPBase foi produzido e utilizado no lugar de plasmídeo de ajudante em microinjeções de embriões. Essa mudança levou à geração bem sucedida de FAW transgênico. Além disso, também são descritos os métodos de triagem de animais transgênicos, a detecção rápida da inserção transgênica baseada em PCR e a determinação assimétrica do local de integração. Assim, este artigo apresenta um protocolo para produzir FAW transgênico, o que facilitará a transgênese baseada em piggyBacna FAW e outros insetos lepidopteranos.

Uma construção para a expressão do promotor T7 contendo hippBase: poliedrin-5'UTR: hyPBase: poliedrin-3'UTR: poly (A) sinal foi gerado(Figura 1A) e amplificado como um fragmento de PCR ~2,2 kb para sintetizar hipPBase mRNA in vitro (Figura 1B). Em seguida, o mRNA hyPBase foi produzido e submetido à eletroforese de gel agarose. O mRNA do tamanho esperado (~1,1 kb de banda) foi detectado em um gel de 1% de agarose(Figura 1C).</str...

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Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

A transformação germinal bem sucedida no verme do exército de outono, Spodoptera frugiperda,foi alcançada usando mRNA de transposase hiperativo piggyBac.

Transformação germline hiperativa da Transposase mediada pela Transposase no Verme do Exército de Outono, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic ...

Este protocolo mostra a produção de transgênicos Fall Armyworm usando sistema de transformação baseado em piggyBac. Esperamos que esses métodos beneficiem a melhoria da transformação, não apenas no Verme do Exército de Outono, mas também insetos lepidopteranos. O método descrito aqui torna eficiente a transformação germinal de insetos pestes lepidopteranos.Xien Chen, pós-doutorando no meu laboratório. Comece colocando 12 pupas machos e 12 pupas fêmeas em uma caixa. Coloque uma solução de 10% de sacarose na caixa para alimentar adultos.Cubra a caixa com uma toalha de papel. No segundo dia pós-eclosão, exponha os adultos à luz intensa durante a noite. No terceiro dia pós-eclosão, transfira os adultos para um lugar escuro.Colete os embriões dentro de duas horas após a posição. Adicione gotas de água ao pedaço da toalha de papel com ovos frescos mantidos em uma placa de Petri no gelo. Transfira os ovos suavemente para um deslizamento de vidro com uma escova fina e alinhe-os um a um em uma lâmina de vidro.Mantenha os slides de vidro com os ovos alinhados no gelo antes da microinjeção. Injete uma mistura de 200 nanogramas por microliter e EGFP à base de co-doença, 200 nanogramas por microliter hiperativo piggyBac transposase mRNA, e água destilada estéril nos ovos usando a pressão de compensação do microinjetor automatizado. Mantenha os ovos injetados em 27 mais ou menos um grau Celsius, 60 mais ou menos 10% de umidade relativa até eclodir.Alimente as larvas eclodidas em uma dieta artificial, e transfira cada larva para uma pequena xícara no estágio inicial de coalhada e estrela. Recolhe a pupa e coloca aproximadamente 150 fêmeas e 150 pupas machos em uma gaiola. Pendure vários pedaços de papel toalhas de 30 centímetros por 15 centímetros de tamanho na gaiola para coletar os ovos.Colete as toalhas de papel com ovos diariamente e mantenha os ovos em condições adequadas até chocar. Mantenha as larvas de nénato a quatro graus Celsius por cinco minutos para imobilizá-las e, em seguida, transfira-as para uma placa gelada. Trie as larvas imobilizadas de recém-nascidos sob um microscópio estéreo de fluorescência.Selecione os recém-nascidos positivos do EGFP, eleve-os para o estágio pupal, em cerca de duas semanas a 27 mais ou menos um grau Celsius. O hiperativo piggyBac transposase mRNA sintetizado in vitro foi detectado usando um gel de 1%Agarose. Os embriões injetados pelo PDS não apresentaram sinal de EGFP, enquanto os embriões de transposição de combísmo e hiperativos de combísmo de combísmo de co-pDA apresentaram fluorescência EGP, indicando que a construção do piggyBac foi bem sucedida.As larvas do G1 obtidas a partir de ovos resultantes de uma auto-cruz de adultos G0 apresentaram forte sinal EGFP. Um fragmento contendo o promotor e o fragmento EGFP foi amplificado com sucesso usando o DNA genômico isolado das larvas positivas do EGFP como modelo. No entanto, o mesmo fragmento não foi detectado quando o DNA genômico foi isolado das larvas do tipo selvagem como modelo.Os ovos para microinjeção devem ser o mais frescos possível e devem ser sempre mantidos no gelo antes da microinjeção para retardar seu desenvolvimento. Essa técnica abre caminho para os pesquisadores responderem perguntas sobre genômica funcional de insetos de pragas e desenvolverem métodos de controle genético para esta praga global.

Research

JoVE Journal

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