Name: hyperactive piggybac transposase-mediated germline transformation in the fall armyworm, spodoptera frugiperda
Uploaded: 2021-09-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda at JoVE.com

La investigación reportada es apoyada por la Fundación Nacional de Ciencias I / UCRC, el Centro de Tecnologías de Manejo de Artrópodos, bajo la Subvención No IIP-1821936 y por socios de la industria, la Subvención Competitiva de la Iniciativa de Investigación Agrícola y Alimentaria No. 2019-67013-29351 y el Instituto Nacional de Alimentos y Agricultura, departamento de agricultura de los Estados Unidos (2019-67013-29351 y 2353057000).

1. Síntesis in vitro de arNm hyPBase
NOTA: La secuencia codificante completa de la secuencia hyPBase se sintetizó e insertó en un vector pTD1-Cas9 (consulte la Tabla de materiales)para producir la construcción pTD1-hyPBase, que contiene un casete que expresa hyPBase, promotor T7: poliedrín-5' UTR: hyPBase: poliedrín-3' UTR: poli (A). La secuencia completa de la construcción pTD1-hyPBase se proporciona en el Material suplementario.
<ol><li>Pre...

<ol>
	<li>Gui, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+transcriptomic+analysis+unveils+population+evolution+and+development+of+pesticide+resistance+in+fall+armyworm+Spodoptera+frugiperda.">Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda.</a> Protein Cell. , (2020).</li><li>Montezano, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+plants+of+Spodoptera+frugiperda+(Lepidoptera:+Noctuidae)+in+the+Americas.">Host plants of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in the Americas.</a> African Entomology. 26 (2), 286-300 (2018).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+ecdysone+oxidase+impairs+tissue+degeneration+in+Bombyx+mori.">Ectopic expression of ecdysone oxidase impairs tissue degeneration in Bombyx mori.</a> Proceedings, Biological Sciences. 282 (1809), 20150513 (2015).</li><li>Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+sexing+system+for+Ceratitis+capitata+(Diptera:+Tephritidae)+based+on+female-specific+embryonic+lethality.">Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (1), 1-8 (2013).</li><li>Gregory, M., Alphey, L., Morrison, N. I., Shimeld, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+transformation+with+piggyBac:+getting+the+number+of+injections+just+right.">Insect transformation with piggyBac: getting the number of injections just right.</a> Insect Molecular Biology. 25 (3), 259-271 (2016).</li><li>Otte, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+genetic+transformation+rates+in+honeybees.">Improving genetic transformation rates in honeybees.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16534 (2018).</li><li>Eckermann, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactive+piggyBac+transposase+improves+transformation+efficiency+in+diverse+insect+species.">Hyperactive piggyBac transposase improves transformation efficiency in diverse insect species.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 98, 16-24 (2018).</li><li>Chen, X., Koo, J., Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+systemic+RNA+interference+defective+protein+1+enhances+RNAi+efficiency+in+a+lepidopteran+insect,+the+fall+armyworm,+in+a+tissue-specific+manner.">Caenorhabditis elegans systemic RNA interference defective protein 1 enhances RNAi efficiency in a lepidopteran insect, the fall armyworm, in a tissue-specific manner.</a> RNA Biology. , 1-9 (2020).</li><li>Liu, Y. G., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+thermal+asymmetric+interlaced+PCR+for+amplification+of+unknown+flanking+sequences.">High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences.</a> Biotechniques. 43 (5), 649-650 (2007).</li><li>Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hyperactive+piggyBac+transposase+for+mammalian+applications.">A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).</li><li>Xu, H., O'Brochta, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+technologies+for+genetically+manipulating+the+silkworm+Bombyx+mori,+a+model+Lepidopteran+insect.">Advanced technologies for genetically manipulating the silkworm Bombyx mori, a model Lepidopteran insect.</a> Proceedings, Biological Sciences. 282 (1810), 20150487 (2015).</li><li>Wu, S. C. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+is+a+flexible+and+highly+active+transposon+as+compared+to+sleeping+beauty,+Tol2,+and+Mos1+in+mammalian+cells.">piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103 (41), 15008-15013 (2006).</li><li>Tamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transformation+of+the+silkworm+Bombyx+mori+L.+using+a+piggyBac+transposon-derived+vector.">Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector.</a> Nature Biotechnology. 18 (1), 81-84 (2000).</li><li>Handler, A. M., Harrell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transformation+of+Drosophila+melanogaster+with+the+piggyBac+transposon+vector.">Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector.</a> Insect Molecular Biology. 8 (4), 449-457 (1999).</li><li>Dreyfus, M., R&#233;gnier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+poly+(A)+tail+of+mRNAs:+bodyguard+in+eukaryotes,+scavenger+in+bacteria.">The poly (A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria.</a> Cell. 111 (5), 611-613 (2002).</li></ol>

La baja tasa de transposición y la dificultad de administrar componentes transgénicos en embriones frescos limitan el éxito de la transformación de la línea germinal en muchos insectos no modelo, especialmente aquellos de orden, Lepidoptera. Para aumentar la tasa de transformación de la línea germinal, se desarrolló una versión hiperactiva de la transposasa piggyBac más utilizada (hyPBase)7,10. Hasta la fecha, la transformación exitosa de la l...

El gusano cogollero (FAW), Spodoptera frugiperda,es originario de las regiones tropicales y subtropicales de América. Actualmente, este es un insecto herbívoro devastador en más de 100 países en todo el mundo1. Las larvas de FAW se alimentan de más de 350 plantas huésped, incluidos algunos cultivos alimentarios básicos importantes2. La fuerte capacidad de migración de los adultos FAW contribuye a su reciente y rápida propagación desde las Américas a otros lugares1,2. Como resultado, este insecto ahora está amenazando la seguridad alimentaria a nivel internacional. La aplicación de nuevas tecnologías puede facilitar estudios avanzados en FAW y proporcionar estrategias novedosas para controlar esta plaga.
La transformación de la línea germinal de insectos se ha utilizado para estudiar la función de los genes y generar insectos transgénicos para su uso en el control genético3,4. Entre los diversos métodos utilizados para lograr la transformación genética en insectos, el método basado en elementos piggyBac es el método más utilizado5. Sin embargo, debido a la baja tasa de transposición, sigue siendo difícil llevar a cabo la transgénesis en insectos no modelo. Recientemente, se desarrolló una versión hiperactiva de la transposasa piggyBac (hyPBase)6,7. La transformación de la línea germinal se logró en FAW recientemente8,que es el primer informe que utilizó la hyPBase en insectos lepidópteros. En este informe, se describe información detallada sobre el empleo de ARNm de hyPBase en la generación de FAW transgénicos. El método descrito aquí podría aplicarse para lograr la transformación de otros insectos lepidópteros.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5&#34; Dental Cotton Rolls</td>
			<td>PlastCare USA</td>
			<td>8542025591</td>
			<td>REARING</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 oz Souffle Cup Lids</td>
			<td>DART</td>
			<td>PL1N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 oz Souffle Cups</td>
			<td>DART</td>
			<td>P100N</td>
			<td>REARING</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 oz Plastic Deli Containers</td>
			<td>Genpack</td>
			<td>AD48</td>
			<td>REARING</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Add-on Filter Set (Green)</td>
			<td>NightSea LLC</td>
			<td>SFA-BLFS-GR</td>
			<td>SCREENING</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF100-50-10</td>
			<td>INJECTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass</td>
			<td>SUTTER INSTRUMENT</td>
			<td>BF-100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745T</td>
			<td>SCREENING</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Featherweight Forceps</td>
			<td>BioQuip</td>
			<td>4750</td>
			<td>REARING</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gutter Guard</td>
			<td>ThermWell Products</td>
			<td>VX620</td>
			<td>REARING</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td>INJECTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-300</td>
			<td>INJECTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>INJECTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-22</td>
			<td>INJECTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NightSea Full System</td>
			<td>NightSea LLC</td>
			<td>SFA-RB-DIM</td>
			<td>SCREENING</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen Gas</td>
			<td>AWG/Scott-Gross</td>
			<td>NI 225</td>
			<td>INJECTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper Towels</td>
			<td>Bounty</td>
			<td>&#160;43217-45074</td>
			<td>REARING</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spodoptera frugiperda Artificial Diet</td>
			<td>Southland Products, Inc</td>
			<td>N/A [Request Species/Quantity]</td>
			<td>REARING</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spodoptera frugiperda Eggs</td>
			<td>Benzon Research, Inc</td>
			<td>N/A [Request Species/Quantity]</td>
			<td>REARING</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq MasterMix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>polymerase mixture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hyperactive piggybac transposase-mediated germline transformation in the fall armyworm, spodoptera frugiperda

La inserción estable de carga genética en los genomas de insectos utilizando elementos transponibles es una herramienta poderosa para estudios genómicos funcionales y el desarrollo de estrategias genéticas de manejo de plagas. El elemento transponible más utilizado en la transformación de insectos es piggyBac,y la transformación de la línea germinal basada en piggyBacse ha llevado a cabo con éxito en insectos modelo. Sin embargo, todavía es un desafío emplear esta tecnología en insectos no modelo que incluyen plagas agrícolas. Este artículo informa sobre la transformación de la línea germinal de una plaga agrícola global, el gusano cogollero (FAW), Spodoptera frugiperda,utilizando la transponasa hiperactiva piggyBac (hyPBase).
En este trabajo, el ARNm hyPBase fue producido y utilizado en lugar del plásmido ayudante en microinyecciones embrionarias. Este cambio condujo a la generación exitosa de FAW transgénicos. Además, también se describen los métodos de cribado de animales transgénicos, la detección rápida basada en PCR de la inserción de transgenes y la determinación del sitio de integración basada en PCR entrelazada asimétrica térmica (TAIL-PCR). Por lo tanto, este trabajo presenta un protocolo para producir FAW transgénico, que facilitará la transgénesis basada en piggyBacen FAW y otros insectos lepidópteros.

Un constructo para la expresión del promotor T7 que contiene hyPBase: poliedrín-5'UTR: hyPBase: poliedrín-3'UTR: se generó una señal poli (A)(Figura 1A)y se amplificó como un fragmento de PCR de ~2,2 kb para sintetizar el ARNm de hyPBase in vitro (Figura 1B). Luego, se produjo el ARNm hyPBase y se sometió a electroforesis en gel de agarosa. El ARNm del tamaño esperado (~1.1 kb banda) se detectó en un gel de agarosa al 1%(Fi...

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Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

La transformación exitosa de la línea germinal en el gusano cogollero, Spodoptera frugiperda,se logró utilizando ARNm de la transposasa hiperactiva piggyBac.

PiggyActivoBac Transformación de la línea germinal mediada por transposasa en el gusano cogollero, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic ...

Este protocolo muestra la producción de gusano cogollero transgénico utilizando un sistema de transformación basado en piggyBac. Esperamos que estos métodos se beneficien de mejorar la transformación, no solo en el gusano cogollero, sino también en los insectos lepidópteros. El método descrito aquí hace que la transformación de la línea germinal de los insectos plaga de lepidópteros sea eficiente.Demostrando el procedimiento estará el Dr. Xien Chen, un becario postdoctoral en mi laboratorio. Comience colocando 12 pupas macho y 12 pupas hembra en una caja. Coloque una solución de sacarosa al 10% en la caja para alimentar a los adultos.Cubra la caja con una toalla de papel. En el segundo día después de la eclosión, exponga a los adultos a una luz intensa durante la noche. En el tercer día después de la eclosión, transfiera a los adultos a un lugar oscuro.Recoger los embriones dentro de las dos horas posteriores a la sobreposición. Agregue gotas de agua al trozo de la toalla de papel con huevos frescos guardados en una placa de Petri sobre hielo. Transfiera los huevos suavemente a un portaobjetos de vidrio con un cepillo fino y alinearlos uno por uno en un portaobjetos de vidrio.Mantenga los portaobjetos de vidrio con los huevos alineados en hielo antes de la microinyección. Inyecte una mezcla de 200 nanogramos por microlitro de plásmido de expresión de EGFP basado en piggyBac, 200 nanogramos por microlitro de ARNm de transposasa de piggyBac hiperactivo y agua destilada estéril en los huevos utilizando la presión de compensación del microinyector automatizado. Mantenga los huevos inyectados a 27 más o menos un grado Celsius, 60 más o menos 10% de humedad relativa hasta la eclosión.Alimente a las larvas eclosionadas con una dieta artificial y transfiera cada larva a una taza pequeña en la etapa temprana de cuajada y estrella. Recoge las pupas y coloca aproximadamente 150 pupas hembras y 150 machos en una jaula. Cuelgue varios trozos de toallas de papel de 30 centímetros por 15 centímetros de tamaño en la jaula para recoger los huevos.Recoja las toallas de papel con huevos diariamente y mantenga los huevos en condiciones apropiadas hasta que eclosionen. Mantenga las larvas neonatas a cuatro grados centígrados durante cinco minutos para inmovilizarlas y luego transfiéralas a una placa helada. Examinar las larvas neonolientas inmovilizadas bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia.Seleccione los neonatos EGFP positivos, elévelos a la etapa pupal, en aproximadamente dos semanas a 27 más o menos un grado Celsius. El ARNm hiperactivo de la transposasa piggyBac sintetizado in vitro se detectó utilizando un gel de agarosa al 1%. Los embriones inyectados con PDS no mostraron señal de EGFP, mientras que el plásmido que expresa EGFP y los embriones inyectados con ARNm de la transposasa piggyBac hiperactiva mostraron fluorescencia de EGP, lo que indica que la construcción de piggyBac fue exitosa.Las larvas G1 obtenidas de huevos resultantes de un autocruce de adultos G0 mostraron una fuerte señal egfp. Un fragmento que contenía el promotor y el fragmento de EGFP se amplificó con éxito utilizando el ADN genómico aislado de las larvas positivas de EGFP como plantilla. Sin embargo, el mismo fragmento no se detectó cuando se aisló el ADN genómico de las larvas de tipo silvestre como plantilla.Los huevos para la microinyección deben ser lo más frescos posible y siempre deben mantenerse en hielo antes de la microinyección para ralentizar su desarrollo. Esta técnica allana el camino para que los investigadores respondan preguntas en genómica funcional de insectos plaga y desarrollen métodos de control genético para esta plaga global.

Research

JoVE Journal

Biology

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La identificación de bacterias metabólicamente activas en el intestino de la Generalista<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; Vía ADN isótopos estables Uso<sup&gt; 13</sup&gt; C-glucosa

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